核酸研究的基本技术

概念：指加热变性使 DNA的双螺旋结构失 去一半时的温度。
一、核酸的分离、纯化和鉴定
1. 基因组DNA的分离、纯化：PCR、
g) 哺乳动物细胞(5x106~107)
实验步骤：RT
匀浆：TE pH8.0 组织( 液氮冻存、研磨) 消化：EDTA 、SDS、蛋白酶K、RNase 抽提：酚、氯仿、异戊醇 37℃/55 ℃
收菌 重悬：TE-葡萄糖
裂解：变性，NaOH-SDS 5min
中和：复性，KAc 抽提：酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)
沉淀：异丙醇
洗涤：70％乙醇 溶解：TE-RNase A
纯化：氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心
聚乙二醇分级沉淀法
Kit: 碱裂解，DNA介质(硅胶、玻璃奶)
α互补现象
外源DNA插入
蓝白筛选
pUC系列质粒
(lac操纵子)
诱导物 IPTG
细菌
(β-半乳糖苷酶N-末端缺陷型)
β-半乳糖苷酶氨基端
缺陷型 β-半乳糖苷酶
生色底物X-gal
白色菌落 蓝色菌落
二、PCR(聚合酶链式反应)技术
1985, Mullis K, PCR，Klenow 1988, Saiki, Taq 酶
1.原理
6)差异PCR
6、PCR在生物学中的应用
1)大量扩增目的核酸片段
2)克隆新基因
3)生物多态性的研究
4)核酸测序
5)在核酸中引入突变
6)检测基因的整合、表达情况
7)疾病的诊断
在基因中引入突变
1.需突变位点位于基因两侧，只需在合成引物时，直接 加上突变碱基即可；
2、当突变位于基因的中间部位时，可以采用以下两种 方法进行突变
6)参数：94℃ 5min - 30×(94℃ 30sec - 55 ℃ 30sec - 72℃1 min)
- 72 ℃7min
引物设计原则
1)长度一般为18~25个碱基； 2)尽可能选择碱基随机分布的序列； 3)两条引物的G+C的百分比应尽量相似，多为45~55%； 4)避免引物内部形成二级结构； 5)两引物之间不应发生互补，特别是在3´端; 6)引物3´末端碱基可以影响Taq酶的延伸效率，最好 选T、G或C，而非A； 7)引物5´端允许有一段序列不与模板配对, 内切酶，保护碱基。
(1) 无RNase环境：手套勤换、试剂专用、DEPC处理
玻璃器皿：180º C干烤8小时以上 塑料器皿：氯仿冲洗 0.1%DEPC水溶液浸泡(RT 12h或37º C 2h)，高压 灭菌去除DEPC
(2) 样品保存： 材料 + Trizol：-70℃ 1m 材料: 液氮 长期
RNA沉淀+75％乙醇：RT 1w
退火温度计算公式：
1) T=2×(A+T)+4×(G+C)-3~5
2) T=22+1.46 ln±3~5 ln=2(G or C)+(A or T)
20~35nt
3) T=81.5+16.6lg[J+]+0.41(G+C%)-(600/l)-0.63(FA%)
[J+]=monovalent cations l=oligonucleotide length FA=formamide 14~70nt
5、常见类型
1)反转录PCR：RT-PCR
AAAAAAAAAAAA
反转录酶
Oligo(dT)n
AAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTTT
AAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTTT
RNaseH
TTTTTTTTTTTTTTTT
PCR
随机引物
AAAAAAAAAAAA
特异下游引物
3、影响因素
模板：ng级的质粒DNA，μg级基因组DNA。 引物：引物浓度不宜偏高，否则易形成引物二聚体。 Mg2+浓度：特异性及产量 dNTPs浓度：正确性和产量 Taq酶用量：非特异性 循环参数：常规为25~30个循环
对照：阳性对照 阴性对照：不加模板
4、特点：特异性、有效性、忠实性
• 操作简便省时； • 灵敏度高； • 特异性较强，但有一定的假阳性率。提高退火温度可 以提高特异性； • 对原始材料的质量要求较低； • 有一定程度的单核苷酸错误掺入。因为Taq DNA聚和 酶缺乏3’→5’核酸外切酶活性，不能纠正反应中发生 的错误核苷酸掺入。
AAAAAAAAAAAA
关键：总RNA完整性
反转录引物
2)巢式PCR: 模板数低
第一轮PCR
1 2
第二轮PCR
3 4 3 2 1 4
3) RACE: cDNA末端的快速克隆
5’
m7Gppp
3’
AAAAA
5’RACE
3’RACE
3’RACE
GSP2 GSP1
Q0 Q1
AAAAAA
TTTT-Q1-Q0
2.反应体系
3.类型
4.PCR产物的克隆、表达和鉴定
1、原理: 模板变性、引物退火、DNA pol进行DNA合成
模板 引物与模板结合 第一轮扩增
第二轮扩增 第三轮扩增
PCR产物呈指数方式增加
25~30个循环
理论109
实际105~107
2、PCR反应体系：25～100 μl
1)模板DNA：单链或双链DNA, 避免DNA聚合酶抑制剂和能
分类
按复制能力分类
严谨性质粒：它们的复制伴随着染色体复制，1～几个拷贝。
松弛型质粒：它们的复制与染色体复制无关，10~200拷贝，常用。 按用途分类 克隆载体
表达载体：含有强启动子，使克隆化的外源基因转录产生大量
的mRNA。依其发挥作用的宿主细胞不同，分为 原核、真核、酵母、昆虫、病毒表达载体。
大小：1kb~200kb 质粒的不相容性：两种亲缘关系密切的不同质粒不能
垂直，银盐染色
非变性，变性
4. 质粒： 概念：细菌等微生物细胞染色体以外，能独立进行
复制和遗传，赋予宿主细胞一定生物学性状 的共价闭环双链DNA分子。
载体：指可容忍外源DNA片段插入、可在细胞间转移
并能在细胞内自主复制的DNA分子。 如:细菌质粒、噬菌体和某些病毒
组成：复制子、启动子、多克隆位点、选择标记基因
稳定共存于同一个大肠杆菌菌株内,
随细胞分裂分别进入不同子代细胞 的现象。 DNA分子同源性 相同阻碍蛋白 相互抑制
穿梭质粒：人工构建
两种不同复制起点和选择标记
两种不同的宿主细胞中存活和复制
转移基因 基因表达活性和功能
分离：碱裂解法、煮沸法：剧烈，小质粒
去污剂(SDS)裂解法：易受损的大质粒 (>15kb) 碱裂解法
沉淀：异丙醇 / NaAc+无水乙醇
洗涤：75％乙醇 干燥：风干 溶解：TE / H2O
注意事项： 1. 试剂：pH值准确 2. 蛋白酶K：20mg/ml， 分装，-20℃，避免反复冻融 3. 抽提：完全，不要触及蛋白层
4. 干燥：避免过分
5. 操作：小心，机械剪切作用，80~100kb
2. 总RNA的分离纯化: RT-PCR、Northern-blot
核酸研究的基本技术
江 红
三所五室
1. 核酸的分离、纯化和鉴定:
基因组DNA、质粒、总RNA
2. PCR技术: 反应体系、常见的PCR技术、
PCR产物的克隆、表达、鉴定
3. 核酸分子的杂交: Southern-blot
Northern-blot
4. 新基因的克隆和功能研究
Tm值(DNA的熔点或解链温度)
复制子：ColE1, pMB1, pSC101，控制着质粒在细菌中的拷贝数。 启动子：位于表达载体，启动基因的转录，如Ptac, PCMV, PSV40等。 多克隆位点(MCS)：人工合成的含多个单一限制性内切酶识别位点 的一段特殊的DNA序列，便于酶切、插入重组 和克隆DNA分子。
选择标记基因：Ampr、Tetr、Kanr、Neor
mRNA
反转录
TTTT-Q1-Q0
第一链cDNA
第一次扩增
GSP1
Q0
第二次扩增
GSP2
Q1
5’RACE
方法一：Cap-Finder
方法二 GeneRacer 去5’-PO4
(牛小肠磷酸酶)
(烟草酸焦磷酸酶)
去5’cap
连接头
cDNA第一链
5’末端
3’末端
注意
1.第一链的合成至关重要 1) 确定所需的mRNA的存在 2) mRNA中存在的稳定二级结构可能对反转录有影响， 采用热稳定的具反转录活性的DNA聚合酶 2.反转录结束后通过两次NH4Ac沉淀去除多余dNTP和引物 3.内源性同聚序列的影响
(2) 核酸的凝胶电泳：分离、纯化
琼脂糖凝胶电泳：agarose, 水平,
TAE, EB(2ng), 紫外灯
总RNA
1% agarose
迁移率：同样大小的分子 超螺旋 》线性分子 》缺口或松弛
DNA Marker:
DL2000, λDNA/HindⅢ
聚丙烯酰胺凝胶电泳: PAGE(Acr+Bis)，
-20℃ 1y
3. 核酸的鉴定
生物学活性 物理化学指标 相对分子量 紫外吸收 沉降系数
电泳迁移率
粘度
(1) 核酸的定量：
OD260：DNA, RNA; OD280：蛋白质 浓度： 1OD260： 50μg/ml ds DNA 40μg/ml ss DNA，总RNA 35μg/ml 单链RNA 20μg/ml 单链寡核苷酸 核酸纯度: OD260 / OD280 DNA 1.8 RNA 1.7~2.1 OD260和OD280应大于0.05， 2.0
1)降低引物的用量 0.5pmol/µg mRNA/20µl反应体积 2)避免太低的杂交温度
4)长片段PCR
Taq酶：LA Taq酶 5U/ 50μl反应 dNTP: 2.5mM 8 μl 延伸：5min 循环：25
5)DNA指纹分析：随机引物
遗传学图谱绘制、系统生物学、发育生物学
单位点微卫星多态性分析 随机扩增多态DNA分析：RAPD 扩增片段长度多态性分析：AFLP DNA单链构象多态性分析：SSCP
实验材料：哺乳动物组织(50~100mg)
哺乳动物细胞(5x106~107)
实验步骤：
匀浆：Trizol 组织( 液氮冻存、研磨) 抽提：氯仿 沉淀：异丙醇 / NaAc + 无水乙醇 RT 15min
洗涤：75％乙醇
干燥：风干 溶解：DEPC-H2O 保存：分装，-70℃，避免反复冻融
注意事项：
新合成的DNA 造成链末端终止的双 脱氧核苷酸
7、注意事项
1)阴阳性对照 2)配制PCR混合物
PCR buffer+dNTP+H2O
3)控制污染: 靶序列污染，气溶胶
紫外线照射 更概念
核酸酶：是一类能切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二 酯键，使核酸分子多核苷酸链发生水解的蛋白酶。 基因工程中最常用的核酸酶是核酸内切酶。 限制性核酸内切酶: 简称限制酶，是一类能识别双链DNA分子 中特异核苷酸序列的DNA水解酶，它能特 异地结合于限制酶识别序列或其附近的位 点，并在此切割双链DNA分子。
低温度 55℃
高温度
热启动PCR: 提高特异性
Taq酶合成延伸速率：22℃ 0.25nt/sec， 37℃ 1.5nt/sec， 55℃ 24nt/sec， 70℃ >60nt/sec
1.Taq酶单克隆抗体: 低温与Taq酶结合，抑制活性; 高温与Taq酶解离，释放活性。
2.模板变性后加入Taq酶。
特征
识别序列：4~6个核苷酸，迴文结构。 切割产物：同时切割dsDNA的两条链 平滑末端或粘性末端 SmaⅠ CCC GGG CCC GGG + GGG CCC GGG CCC EcoRⅠ GAAT T C C T TAAG G C T TAA + AAT T C G
方法一
1 2
第一轮 PCR
1
第二轮 PCR
3
方法二
1
3 2 4
第一轮分步PCR
PCR产物互补
Taq酶 1 4
第二轮PCR
DNA的序列测定：Sanger双脱氧链终止法测序的原理
5´ 单链模板DNA 3´
测序引物
4种dNTP(包括 [32P]dNTP)
ddTTP
ddCTP
DNA聚合酶
ddGTP
ddATP
分类
I类: 识别部位复杂，特异性差，在识别序列周围400~ 7000bp范围内切割DNA。 II类：能识别双链DNA的特定序列并进行切割，产生特异 的DNA片段，常规应用于分子克隆中。 III类：在识别位点周围27~27bp范围内切割DNA。
命名原则
EcoR I
第一个大写字母：属的缩写 两个小写字母：种的缩写 第二个大写字母：不同变种和品系的缩写 罗马数字： 同一微生物中多种限制酶分离的顺序
结合DNA的蛋白质污染, 1～0.1μg。
2)引物：人工合成的两段与待扩增靶DNA侧翼片段互补的寡核苷酸。
20pmol
3)Mg2+的浓度：反应产物的特异性和产量，1.5mmol/L。 4)dNTP：50~200µmol/L，四种dNTP浓度相同。
5)Taq DNA聚合酶：Klenow, Taq酶, 高保真Taq酶, 2.5U/100μl 。