稀碱法提取RNA

器材和试剂

1.器材：沸水浴，量筒，刻度移液管，吸管 及滴管，布氏漏斗和抽滤装置，试管，试管 架和试管夹，离心机，滤纸，pH试纸，烧杯， 天平，酵母粉。




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2.试剂 ⑴0.2%（m/V）NaOH溶液 ⑵95%（V/V）乙醇 ⑶冰乙酸 ⑷无水乙醚 ⑸1.5mol/L H2SO4 溶液 ⑹浓氨水 ⑺5%（m/V）AgNO3 溶液 ⑻苔黑酚乙醇溶液 称取苔黑酚6g，溶解于95%乙醇100mL(冰箱中可保存 一个月） ⑼ FeCl 3 的浓盐酸溶液 FeCl 3 溶液2mL，与浓盐酸400mL混合。 取10%（m/V）




⑵核糖 取试管一支，加入水解液1mL，再加入FeCl 3 的 浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液5滴，在通风橱中 沸水浴加热5分钟，观察试管中颜色变化。 ⑶磷酸 取试管一支，加入水解液1mL和定磷试剂1mL， 在沸水浴中加热，观察试管中颜色变化。
要点提示



1.用苔黑酚（又名地衣酚 3,5-二羟基甲苯）鉴 定戊糖时特异性较差，凡属戊糖均有此反应。甚至 木某些戊糖持续加热后生成的羟甲基糠醛也能与苔 黑酚反应，产生显色复合物。微量DNA无影响，在 试剂中加入适量 CuCl2 2H 2O 可减少DNA的干扰。 2.用乙醇沉淀RNA时，须用酸中和稀碱，可以 加冰乙酸至pH2.5，也可以直接用酸性乙醇（浓盐 酸1mL加入乙醇100mL中）至溶液pH为2.5。 3.用AgNO3鉴定RNA中的嘌呤碱时，除了产生嘌 呤银化物沉淀外，还会产生磷酸银沉淀，磷酸银沉 淀可溶于氨水，而嘌呤银化物沉淀在浓氨水中溶解 度很低，加入浓氨水可消除 PO43 的干扰。
实验步骤



1.RNA的粗提取 ⑴取酵母粉1g，放入一大试管中，加入0.2%NaOH溶 液10mL，摇匀成悬浮液。 ⑵将悬浮液在沸水浴中加热20分钟，冷却至室温， 倾入离心管中，3000r/min离心10分钟。 ⑶将上清液缓缓倾入含3mL95%乙醇的试管中，注 意要一边搅拌一边倾入，用冰乙酸调pH至2.5。静 置，待RNA完全沉淀后，3000r/min离心5分钟。



⑽定磷试剂 1）17%（m/V）H2SO4 溶液 2）2.5%（m/V）钼酸铵溶液 3）10%（m/V）抗坏血酸溶液（贮藏于棕色瓶中， 溶液在冰箱放置可用1个月。溶液呈淡黄色时可用， 如呈深黄色或棕色则已失效。） 临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合（限当 天使用） 17% H2SO4：2.5%钼酸铵：水：10%抗坏血酸 =1:1:2:1(V/V)

RNA用H2SO4水解时，可以生成磷酸﹑戊糖 和碱基，以下列反应鉴定各种成分。①磷酸： 用强酸使RNA中的有机磷消化生成无机磷， 后者与定磷试剂中的钼酸铵结合成磷钼酸铵 （黄色沉淀），当有还原剂存在时磷钼酸铵 立即转变成蓝色的还原产物——钼蓝；②核 糖：RNA与浓盐酸共热时，发生降解，形成 2 3 的核糖继而转变成糠醛，在Fe 或 Cu 催化 下后者与苔黑酚反应，生成鲜绿色复合物； ③嘌呤碱：嘌呤碱与AgNO3能产生白色的嘌呤 银化物沉淀。




⑷弃去上清液，向离心管中加入95%乙醇5mL，振 荡摇匀以洗涤沉淀，3000r/min离心3分钟，再弃去 上清液，管底部的沉淀即为RNA粗制品。 2.水解RNA 向上述含有RNA沉淀的离心管中加入 1.5mol/LH2SO4 溶液10mL，振荡摇匀后转入到一大 试管中，沸水浴中加热10min，使RNA水解，过滤 水解液，滤液用于RNA组分的定性鉴别。 3.RNA组分鉴定 ⑴嘌呤碱 取一支试管，加入水解液1mL，浓氨水2mL， 混匀后沿管壁慢慢加入5%的AgNO3 溶液1mL，勿振 荡，静置5min，观察是否产生白色絮状嘌呤银化物 沉淀。
实验十
酵母RNA的提取与组分鉴定
演讲：刘长伟 材料收集：刘亮亮 制作：李媛媛
实验目的
1. 学习稀碱法提取RNA的原理和操作方法 2. 掌握RNA组分的鉴定方法
原

理
酵母中含有丰富的RNA(可达酵母干重的 2.67%～10%），是工业上大规模制备核酸 和核苷酸的原料。稀碱法是工业上常用的 RNA提取方法之一，其原理是用稀碱溶液裂 解细胞，使RNA释放到碱液中，然后用酸中 和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇 沉淀RNA或调pH至2.5利用等电点沉淀RNA.