微生物工程工艺原理

微生物工程工艺原理
绪论
一、名词解释
微生物工程：微生物工程是指利用微生物的特性和代谢活动，通过现代工程技术在生物反应器中生产有用物质的一门工程技术学科，其包括菌种选育、菌种生产、生物产品的发酵和分离提取以及微生物机能的利用。

发酵工程：是研究生物技术工业生产过程中各单元操作的工艺和设备的一门学科，是生物技术产业化的重要环节。

也叫微生物工程。

二、问答题
2、微生物工业生产主要有哪些优点和缺点？
←优点：
←1、微生物种类繁多，繁殖速度快，代谢能力强，容易通过人工诱变获得有益的突变株，使生产产率提高。

←2、微生物酶的种类很多，能催化各种生物化学反应，发酵过程以生命体的自动调节方式进行，数十个反应过程能够象单一反应一样在反应设备内一次完成。

←3、反应通常在常温常压下进行，条件温和，能耗少，可以用简易的设备来生产多种多样的产品。

←4、原料通常以糖蜜，淀粉等碳水化合物为主，可以是农副产品，工业废水或可再生资源，微生物能有选择地吸收所需物质。

←5、容易生产复杂的高分子化合物，能高度选择性地在复杂化合物的特定部位进行氧化、还原、转化等反应。

←6、发酵过程需要防止杂菌污染，培养基需要进行灭菌，设备也需要进行严格的冲洗、灭菌，空气需要过滤等。

←缺点：
←1、底物不可能完全转化成目的产物，副产物的产生不可避免，造成提取和精制的困难。

←2、微生物反应是活细胞反应，除受环境因素影响外，也受细胞内因素影响，且菌体易变异，实际控制难。

←3、原料是农副产品，虽然价廉，但质量和价格波动大。

←4、生产前准备工作量大，花费高，反应器效率低。

←5、因过高的底物或产物浓度导致酶和细胞的抑制作用。

因此底物浓度不能很高，导致使用大体积的反应器，并
←要在无杂菌污染情况下进行操作。

←6、发酵废水常具有较高的COD和BOD，需要进行处理后才能排放，生产门槛高，资金投入较大。

3、一般发酵过程主要有哪几部分组成？
典型的发酵过程可以划分成以下六个基本组成部分：
（1）生产菌种选育和扩大培养，培养基的配制；
（2）培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌；
（3）生产菌种接种入生物反应器中，无菌空气的制备与通风；
（4）控制生产菌种最适生长和代谢条件，进行发酵生产；
（5）产物提取和精制；
（6）过程中排出的废弃物的处理。

6、微生物工程的发展历史可分为哪几个阶段？
1.自然发酵时期
2.纯培养技术时期（阶段以显微镜的诞生和微生物学的问世为标志。

）
3.通气搅拌的好气性发酵工程技术时期（一阶段以青霉素的工业开发获得成功为标志。

）
4.人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术时期
5. 发酵动力学和连续化、自动化发酵工程技术时期
6.微生物酶反应合成与化学合成相结合工程技术时期
第1章菌种与种子扩大培养
*一、名词解释：
种子扩大培养：就是将保藏菌种经过试管斜面活化和逐级扩大培养,而获得一定数量和质量的纯种的过程称为种子扩大培养。

这些纯种培养物称为种子。

菌种选育、
菌种退化：菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用，而引起某些优良特性变弱或消失的现象称为菌种退化。

菌种保藏
OD值：是细胞个数，菌体大小和发酵液色泽深浅的综合反应，可用比色计或分光光度计进行测定。

*二、问答题
*1、微生物工业对生产菌种的要求是什么？
1、料制成的培养基上迅速生长和大量合成目的产物
----价值高
2、要求不高、易控制的培养条件下迅速生长和发酵，发酵周期短。

----可操作性强
3、代谢调控要求选择高产菌株，如营养缺陷型菌株或调节突变型菌株
4、菌体能力强，以防止感染噬菌体而造成“倒罐”现象的发生。

5、纯粹，不易退化，可保证发酵生产和产品质量的稳定性。

----遗传稳定性强
6、非病原菌，不产生任何有害的物质和毒素，以保证产品的安全。

----安全性强
*2、菌种退化的表现有哪些？原因是什么？预防方法有哪些？
菌种退化表现：菌种发酵力、繁殖力、代谢能力、生产性能、产物得率等下降，发酵周期延长，抗不良环境条件的性能减弱。

菌种退化的原因：内因主要是有关基因的负突变
外因：1、菌种保藏不妥（染菌等）
2、菌种生长的要求没有得到满足（培养条件不良）
3、传代接种次数过多
*防止菌种退化的方法：
1.定期进行分离复壮。

2.提供合适的培养条件，满足其生长要求。

3.尽量控制减少接种传代次数。

4.做好菌种的保藏工作。

5.采用幼龄菌接种培养
*5、菌种保藏的原理和目的分别是什么？常用的菌种保藏的方法有哪些？*目的：保证菌种在长时间内要尽可能保持菌株优良生产性能的稳定性，不污染杂菌，不死亡。

*基本原理：根据菌种的生理生化特点，人工创造条件使菌种的代谢活动处于不活泼的休眠状态。

*工业微生物菌种保藏技术
*(1) 斜面保藏：3-6个月
*(2)沙土管干燥保藏：2年
*(3)液氮保藏：2-3年
*(4) 悬液保藏：常温或低温
*(5) 超低温保藏：1年以上
*(6) 冷冻干燥保藏：5-10年
第2章培养基制备与灭菌
*一、名词解释：
*葡萄糖值DE值：也称葡萄糖值，用于表示淀粉水解程度及糖化程度，是指葡萄糖（把所有还原糖都当成葡萄糖算）占干物质的百分数。

*微生物热阻：是指微生物在一定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间，表示微生物对热的抵抗能力。

*二、问答题：
*2、淀粉水解糖的制备方法主要有哪些？各有什么优缺点？
*1、酸解法：
*定义：以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。

*是一种常用的，传统的水解方法。

*优点：设备要求简单，水解时间短（20min），设备生产能力大
*缺点：高温高压下进行，设备要求耐腐蚀、耐高温、耐高压，副反应多，对原料要求严格，淀粉颗粒不宜过大，淀粉乳浓度不能过高。

*2、酶解法：（双酶水解法）
*定义：用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。

一般分为两步：第一步是利用α－淀粉酶将淀粉液化转为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化。

第二步是利用淀粉糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，称为糖化。

也称双酶法α-淀粉酶（液化）
*葡萄糖淀粉酶（糖化）
*优点：1、反应条件温和。

*2、酶的专一性强，副反应少
*3、可在较高的淀粉乳浓度下水解
*4、糖液的营养物质丰富
*5、糖液色泽浅，无苦味，有利于糖液的精制
*缺点：时间长（2～3）天，要求的设备多，糖液过滤困难。

*3、酸酶结合法
*酸酶法
*酶酸法
*3、微生物灭菌的方法主要有哪些？为什么培养基采用湿热灭菌的方法？*常用灭菌方法：干热灭菌、湿热灭菌、物理灭菌（射线、微波等）、化学灭菌（各种化学药品）
*6、分批灭菌和连续灭菌在操作上有何不同？各有什么特点？
不同之处为：分批时，这三个阶段在时间上错开（在同一设备，不同时间内完成）；连续时，这三个阶段在空间上错开（同一时间，不同设备内完成），故连续灭菌需分别设置加热设备、保温维持设备和冷却设备
*分批灭菌的优点：1.对于含有固体颗粒或含有较多泡沫的培养基，杀菌更彻底。

2.适用于小容积发酵罐，节约资金和能源。

缺点：1.灭菌时间长，培养基营养
成分破坏较大。

2.发酵罐利用率低。

3.不适用自动控制，劳动强度大。

*连续灭菌优点：1）可以采用高温短时灭菌（HTST）；2）发酵罐利用率高；
3）蒸汽负荷均衡；4）热效率高；5）可采用自动控制，降低劳动强度；
缺点：不适合含有固体颗粒或含有较多泡沫的培养基灭菌，连续灭菌适合大批量培养基灭菌，对容量小的培养基灭菌体现不出其优势，有些浪费*10、如何对培养基进行灭菌？
第3章糖嫌气性发酵产物积累机制
*一、名词解释
*发酵机制：微生物通过其代谢活动，利用基质（底物）合成人们所需要的代谢产物的内在规律。

*代谢控制发酵：人为地改变微生物的代谢调控机制，过量积累中间产物。

EMP型发酵：
*二、问答题
*2、糖酵解途径有哪些特点？调节糖酵解的因素主要有哪些？（酶、能荷、化合物）
*糖酵解途径的特点
*1、广泛存在于各种细胞中，每个反应都不需要氧参与。

*2、分为两个阶段：
*6C（葡萄糖）3C（3-磷酸甘油醛）：消耗2ATP
*3C（3-磷酸甘油醛）丙酮酸：生成4ATP
*3、糖酵解有10多个反应组成，每个反应都在酶的作用下完成。

*4、其他糖类作为碳源和能源时，是通过葡萄糖或其他中间产物并入糖酵解途径的。

*5、在不同的有机体和不同条件下，H的受体不同，丙酮酸的去路也不同。

调节糖酵解的因素主要有：
*1、酶：主要是通过己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶等三个激酶完成
*2、能荷
*3、化合物：无机磷、柠檬酸、脂肪酸和乙酰CoA
*3、说明糖酵解生成的产物的去向分别如何？
*4、什么是酵母的第一型、第二型、第三型发酵？有什么不同？说明酒精发酵生产过程中产生甘油的原因？
*酵母一型发酵：在酵母体内，葡萄糖经酵解途径生成丙酮酸，在无氧条件下，由丙酮酸脱羧酶催化使丙酮酸脱羧生成乙醛，生成的乙醛在乙醇脱氢酶的作用下成为受氢体被还原成乙醇。

*酵母Ⅱ型发酵：磷酸二羟丙酮代替乙醛作为氢受体形成甘油，这样酵母酒精发酵转为甘油发酵称为酵母Ⅱ型发酵。

*酵母Ⅲ型发酵：酵母菌在碱性条件(pH7.6)下，由于乙醛生成等量的乙酸和乙醇，因
此乙醛作为氢受体的作用被抑制，这时磷酸二羟丙酮成为氢受体，发酵总产物为甘油、乙酸、乙醇。

2C6H12O6 + H2O → 2甘油+ 乙酸+ 乙醇+ 2CO2
*酒精发酵生产过程中产生甘油的原因：
当环境渗透压升高，酿酒酵母将合成并在胞内积累甘油以维持细胞内外的渗透压平衡；当在缺氧条件下生长时，酿酒酵母将合成并在胞内积累甘油以维持细胞的氧化还原平衡。

存在于胞浆中的3-磷酸甘油脱氢酶，以NAD+为辅酶，催化磷酸二羟丙酮生成3-磷酸甘油，然后3-磷酸甘油磷酸酶催化3-磷酸甘油生成甘油。

*第4章柠檬酸发酵机制
* 1.好养发酵的机制是什么？
*好氧发酵机制：
*糖的有氧氧化过程（也称EMP-TCA途径)可分为三个阶段：
*一、葡萄糖经EMP途径转化为丙酮酸;
*二、在有氧条件下，丙酮酸进入线粒体，在丙酮酸脱氢酶的作用下氧化脱羧，与辅酶A结合生成乙酰辅酶A;
*乙酰辅酶A中，乙酰基与辅酶之间以高能硫酯键结合，其活性大大提高，通过它丙酮酸才能进入TCA循环进行彻底分解，因而此步反应视为EMP 和TCA之间的连接桥梁。

*三、三羧酸循环（TCA循环）也称柠檬酸循环，经过TCA循环，乙酰辅酶A中的乙酰基被氧化分解成CO2和H2O，放出大量能量（ATP)。

*在TCA循环中看不到有氧分子的直接参与，只是有还原型辅酶NADH2,FADH2形成，在有氧条件下，它们将所带的氢交给终受体氧形成水，并放出大量能量，这种氧化作用称为生物氧化或氧化呼吸或细胞呼吸。

*总反应式为：
*C6H12O6 + 6O2 +38 ADP →6H2O + 6CO2 +38 ATP
* 5.简述二氧化碳固定反应对提高柠檬酸产率的意义。

第5章氨基酸发酵机制
*一、解释名词：
*初级代谢产物：微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质。

*次级代谢产物：微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无
明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。

*反馈抑制：反应途径中当反应产物达到一定浓度时，会对该途径中有关催化生成该产物的酶的活力起到抑制的作用，这种调节方式称为反馈抑制。

*反馈阻遏：代谢终产物达到一定浓度时，反馈阻遏该代谢途径有关的一种或几种酶的生物合成的调节方式。

*分解代谢物阻遏：细胞内同时有两种分解底物（如碳源）或其分解产物存在时，被菌体迅速利用的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。

*营养缺陷型突变株：人为选育的，先天丧失合成某一种或几种必须生长因子能力的菌株。

抗结构类似物菌株：在培养基内人为的加入某种氨基酸结构类似物，迫使微生物发生基因突变，从遗传学角度改变了这种氨基酸对代谢途径的反馈抑制作用的菌株。

二、问答题：
*1、谷氨酸的生物合成途径是什么？包含哪些生化过程？
*生物合成途径：葡萄糖经EMP和HMP途径生成丙酮酸，一方面丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-CoA；另一方面经CO2固定作用生成草酰乙酸，两者合成柠檬酸进入TCA循环，由TCA循环的中间产物α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶催化下生成谷氨酸。

*3、说明谷氨酸生产菌细胞膜渗透性改变方法及其机理。

*作用机理：改变细胞膜结构，通过使磷脂合成量为正常的1/2或1/3，使细胞膜不完整，有破损，而达到改变通透性的目的。

*改变方法：1.从生物素入手，选育生物素缺陷型菌株限制外源性生物素供应。

2.
选育油酸缺陷型。

3.选育甘油缺陷型。

4.选育温度敏感型突变株。

5.其他，如营养缺陷型；药物抗性突变株；敏感型突变株等。

6.添加表面活性剂与饱和脂肪酸，它们是生物素拮抗剂，阻碍磷脂的合成，使细胞膜合成不正常。

7.添加青霉素等抗生素，使细胞壁合成不正常，使细胞膜易破损。

（控制方法：在长期进入产酸期时添加）
第6章核酸类物质的发酵机制
*一、名词解释：
*全合成途径：从磷酸核糖开始，逐步加上必要的成分，最后闭合成环（嘌呤或嘧啶环）合成核苷酸的途径。

*补救合成途径：从培养基中吸取嘌呤或嘧啶碱基、戊糖、磷酸，通过一系列酶的催化作用合成核苷酸的途径。

*二、问答题：
*2、核苷酸微生物生物合成主要有哪几条途径？
*全合成途径：从磷酸核糖开始，逐步加上必要的成分，最后闭合成环（嘌呤或嘧啶环）合成核苷酸的途径。

*补救合成途径：从培养基中吸取嘌呤或嘧啶碱基、戊糖、磷酸，通过一系列酶的催化作用合成核苷酸的途径。

第7章抗生素的发酵机制
*一、名词解释：
*初级代谢：是指微生物合成它们生长所必需的物质的代谢。

*次级代谢：是指微生物在生长后期进行的与他们的生长无明显关系的代谢
*分叉中间体：糖代谢中既能用来合成初级代谢产物，又能合成次级代谢产物的中间体。

*分解代谢产物阻遏（葡萄糖效应）：葡萄糖的分解和利用减少了抗生素的生物合成，即青霉素发酵受葡萄糖的抑制的现象。

*二、问答题：
*2、说明抗生素生物合成的代谢调节机制有哪些？
*①细胞生长期到抗生素产生期的过渡调节：有关酶被激活或合成后开始合成抗生素。

②酶的诱导作用：添加诱导剂，去除阻遏力。

③分解代谢产物的调节控制：采用
不易快速利用的C源和N源；流程工艺中间补料控制糖浓度在低水平范围；采用抗结构类似物突变菌株等方法消除分解代谢阻遏。

④磷酸盐的调节：高浓度有利于细胞生长繁殖，抑制抗生素合成；控制磷酸盐适量有利于抗生素合成。

⑤NH4+的抑制作用。

⑥初级代谢调节对次级代谢的作用。

⑦次级代谢的反馈抑制。

⑧次级代谢的能荷调节。

第8章_发酵动力学
*一、名词解释：
*发酵动力学：是研究发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平
衡及其内在规律。

* 稀释率：指单位时间内流过单位体积发酵罐培养液的体积数
比生长速率：在对数生长期，单位质量菌体在单位时间内的增殖菌数为常数，称为比生长速率
* 二、问答题：
* 2、分批培养的微生物细胞的生长规律是什么？二次生长在哪个时期？ * 微生物生长规律：1.迟滞期，细胞数量很少增加，但细胞的个体长大并合成新的酶
系和细胞物质 2.对数期：细胞活力很强，生长速率达到最大值并保持稳定，而生长速率的大小取决于培养基的营养情况和环境条件 3.稳定期：微生物的生长速率下降到等于死亡速率，活细胞数量基本稳定 4.衰亡期：由于自溶作用和有害物质的影响，细胞破裂，死亡加速。

* 二次生长在
* 3、什么是莫诺方程？其建立的条件是什么？
* 单位质量干菌体在单位时间内生成菌体的量：
* * 莫诺方程是在如下假设基础上建立起来的：
* 1）菌体生长为均衡型非结构式生长，因此，细胞成分只需要一个参数即
菌体浓度表示即可。

* 2）培养基中只有一种底物是生长限制性底物，其他营养成分不影响微生
物生长。

* 3）将微生物生长视为简单反应，并假设菌体得率为常数，没有动态滞后。

* 4、什么是分批发酵和补料分批发酵？各有什么特点？
← 分批发酵又称分批培养，即在一个密闭系统内一次性投入有限数量营养物进行的间
歇式培养方法。

特点：
← （1）一次性，一次投料，一次接种，一次收获。

← （2）非恒态培养法，所有工艺参数都随时间而变化。

← （3）是封闭系统，操作方式简单。

← （4）微生物培养过程中营养成分不断降低，为限制性条件下的生长，但培养液体
积为常数。

← 补料分批培养：是指在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。

[][]
S K S S +⋅=max μμ
也称半连续培养或半连续发酵。

←特点：
←（1）是介于分批培养和连续培养之间的一种技术
←（2）发酵罐内的培养液体积不再是常数，而是随时间和补料流速而变的变量。

←（3）为非封闭系统，但不连续流出发酵液。

←（4）操作灵活方便，适应范围更广，生产效率高。

*5、什么是连续发酵？连续发酵有什么优缺点？
*连续培养，又称连续发酵：是培养过程中连续等量地加入新鲜培养液并以同样流量连续排出发酵液，使细胞保持稳定的生长环境和生长状态的
培养方法。

*连续发酵优点(相对于分批发酵而言) ：1、高效，简化；2、便于自动控制；3、产品质量稳定;4、设备利用率高，节约成本，生产均衡；
*缺点：1、菌种易变异退化；2、易污染杂菌；3、营养物利用率低；4、不易混合均匀；5、状体细胞输送存在问题。

6、补料分批发酵准稳态和连续发酵的恒态有什么不同？
当补料速度足够低时，将会出现μ＝D 的稳态现象，称为准稳态状态。

准稳态时，μ＝D，但两者不是定值，而是以相同的速率下降。

恒定状态μ＝D=常数。