猪小肠粘膜上皮细胞的分离及体外原代培养模型的建立
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关键词 猪；小肠粘膜细胞；原代培养 中图分类号 S828
肠粘膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells, IEC)是 省原种猪场。 肠道的重要功能细胞，参与肠道食糜的消化、吸收、免 1.2 主要仪器设备与试剂
疫屏障和应激反应等，并与肠道的内、外分泌功能关 系十分密切。 长期以来，在研究 IEC 的生物学功能、细 胞增殖和分化的调控因素，物质吸收与代谢等多采用 肠道肿瘤细胞系为试验模型[1]。 然而癌细胞是非正常 的细胞，其生理特征明显不同于正常细胞，单纯由癌 细胞系的研究结果来解释正常细胞的行为，明显有其 不足。 原代培养是从供体取得组织细胞后在体外进行 的首次培养， 原代培养的细胞生物学特性变化较少， 最能反映和接近体内生长特性，是一种良好的试验载 体。 国外早在 1993 年就有猪肠细胞原代培养的报道[2]， 其 它 类 型 的 猪 组 织 细 胞 原 代 培 养 的 报 道 也 不 少 [3-5]， 国 内关于动物体细胞原代培养的报道多集中在其它动 物身上[6-9]，而关于猪 IEC 原代培养的方法一直属于空 白。 本试验的目的就是通过机械和酶消化结合的方法 建立猪 IEC 原代培养的系统，为猪肠道营养的研究提 供新的试验材料。 1 试验材料 1.1 试验动物
3.3.2 免疫学方法鉴定 免疫学方法鉴定上皮细胞角蛋白 8 的表达，阳性
细 胞 呈 棕 黄 色 或 棕 褐 色 ，90% 以 上 的 细 胞 呈 阳 性 反 应，如图4 所示。
a
OD 值
0.7
0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
024 48 42 96 120 144 168 192 216 240
b
接 种 时 间 （h）
图 2 猪 IEC 的生长曲线
3.3 猪 IEC 的鉴定 3.3.1 碱性磷酸酶的鉴定
碱性磷酸酶显色后，可以看到细胞胞质含黑色颗 粒 ，细 胞 骨 架 清 晰 ；90% 以 上 的 细 胞 呈 阳 性 反 应 ，如 图 3 所示。
12
图 4 免疫学方法鉴定 IEC（100×）
之间有紧密的联系， 共同被称作内胚层结构增殖单 养建立了理想的试验模型。
位。 完整的内胚层结构增殖单位可以很好地通过细胞 与细胞、细胞与细 胞 外基 质(extracellular matrix，ECM) 之间的相互作用或者信息分子的复杂信号网络来维 持自身的平衡[13]。 但这个平衡系统在离体组织样品中 是很脆弱的，因组织突然供血不良、温度调节失衡、细 胞和细胞、细胞和 ECM 的相互作用也会紊乱。 上皮细 胞和 ECM 联系的 紊乱 会 导致 细胞 程 序化 的 死亡 ，即 失巢凋亡现象(anoikis)[14]。 肠干细胞对失巢凋亡有高度 的敏感性，这也正是肠上皮细胞原代培养很难获得成 功的主要原因。 常用的分离方法包括组织切块移植 法、机械分离法、螯合作用和酶消化法，酶消化法分离 上皮细胞的优势可以消除一些细胞和细胞之间的相 互作用,尤其是上皮细胞和隐窝成纤维细胞之间的相 互作用。 所有酶中胶原酶因其对上皮细胞的损伤较小 而使用得最多。 本研究使用胶原酶分离 IEC，效果良好。
营养研究
《饲料工业》·2010 年第 31 卷第 1 期
猪小肠粘膜上皮细胞的分离及体外原代培养模型的建立
职爱民 左建军 黄志毅 邹仕庚 冯定远
摘 要 用机械刮取小肠粘膜加胶原酶Ⅱ消化的方法，采用新生未吮乳仔猪小肠组织，成功地分 离了猪小肠粘膜上皮细胞（Intestinal epithelial cells, IEC）且在体外培养传代，并采用碱性磷酸酶和角 蛋白免疫学试验鉴定，结果表明：体外培养的猪 IEC 在 DMEM-F12 培养基中，细胞在 1~2 d 贴壁，5~6 d 形成细胞克隆，9~11 d 融合成片；碱性磷酸酶和生物素标记的细胞角蛋白抗体鉴定结果显示 90%培 养的细胞为阳性，分别从生化的角度证明和细胞生物学角度鉴定了所培养的细胞为 IEC。
左建军、黄志毅、邹仕庚、冯定远(通讯作者)，华南农业大 学动物科学学院。
收稿日期：2009-10-26 ★ 国家重点基础研究发展计划项目(2004CB117501)、广东联合
基金项目(No.u0731004)和博士点基金项目(20070564014) 资助
全培养液，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌 ，1.5 ml Eppendorf 管以 1 ml/管分装，-20 ℃保存备用 。 DMEM-F12 完全培养基为 DMEM-F12 不完全培养基加 10%的胎 牛血清。 2.1.2 猪 IEC 的分离
取生长良好的细胞，吸去培养液，用 PBS 洗 细 胞
3 次；80％冷丙酮固定 10 min，吸弃，PBS 洗 3 次；加入酶
a
反应基质液 （2％巴比妥钠 1 ml、3％ β-甘油磷酸钠1 ml、
2％硝酸钙 2 ml、2％硫酸镁 1 ml、蒸馏水 5 ml,pH=9.2～
9.4）37 ℃反应 2 h,吸弃，PBS 洗 3 次 ；加 入 2％硝酸钙
10
职爱民等：猪小肠粘膜上皮细胞的分离及体外原代培养模型的建立
营养研究
二指肠、回肠和空场各 15 cm 左右，沿纵向剪开，培养 基冲洗三遍并用玻片轻轻刮去表面杂物；清洗后的培 养基转移到新的盛有 15 ml 37 ℃预热 DMEM-F12 不 完全培养基的平皿中， 取出小肠，DMEM-F12 培养基 分离 IEC 细胞，用玻片轻轻分离肠粘 膜组 织 ；用移 液 器吹打均匀后转移到细胞培养瓶中，加入Ⅱ型胶原酶至 0.1%终浓度；分别置 4 ℃和 37 ℃各消化 12 h 和 2 h 后加
2 min,吸弃，PBS 洗 3 次；加入 2％硝酸钴 2 min 后吸弃;
加入 2％硫化铵，放入 37 ℃培养箱 10 min，吸弃；流水
冲洗，镜检。
2.4.2 免疫学方法鉴定
在 96 孔 板 中 接 种 密 度 为 1×105 个/ml 的 细 胞 悬
液 ，每 孔 100 μl，接 种 4 d 后 进 行 IEC 角 蛋 白 8 的 免
PBS 洗细胞 2 min×3 次；吸去多余的 PBST,加 50 μl 封 闭液于孔中,37 ℃孵育 10 min； 吸干液体, 并用 PBST 洗 2 min×3 次；每孔细胞加 100 μl 的 一抗 （鼠 抗人 角 蛋 白 8 单 抗 ）,37 ℃温 育 30 min；PBST 洗 2 min×3 次; 每 孔 加 50 μl 抗 小 鼠 生 物 素 二 抗 ,37 ℃ 孵 育 20 min; PBS 洗 2 min×3 次；每孔加 50 μl HRP 标记链亲和素， 37 ℃ 孵 育 20 min；PBS 洗 2 min×3 次 现 用 现 配 DAB
职爱民等：猪小肠粘膜上皮细胞的分离及体外原代培养模型的建立
营养研究
4 讨论
从细胞生物学角度鉴定了所培养的细胞为 IEC。 综上
位于消化管内壁的肠上皮是一种单层组织，由肠 所述，本试验通过机械分离和胶原酶消化相结合的方
隐窝基部的干细胞不断增殖。 上皮细胞和成纤维细胞 法 ，成 功地 在 体 外 培 养 了 新 生 仔 猪 IEC，为 猪 肠 道 营
图 1 猪肠上皮细胞的分离、培养
3.2 体外原代培养猪IEC 的增殖 其生长曲线如图 2 所示。 由图 2 可知，接种后 48 h
细胞处于适应休眠期， 然后开始进入对数生长期，在 216 h 后处于停滞期，细胞不再增殖。 群体倍增时间约 为 72 h。
a. 100×；b. 300× 图 3 碱性磷酸酶鉴定 IEC
参 照 文 献 报 道 的 方 法[10－11]并 根 据 实 际 情 况 调 整 , 具体如下: 将刚出生未吮乳的仔猪颈动脉放血处死, 75％的酒精擦洗消毒后，置于超净工作台。 无菌条件 下打开腹腔,整体分离肠道,迅速投入盛有 15 ml 37 ℃ 预热 DMEM-F12 不完全培养基的平皿中； 分别取十
四甲基偶氮唑蓝(MTT)母液(5 mg/ml)：称取 250 mg MTT，溶于 50 ml PBS 中，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌, 分装后-20 ℃避光保存备用。
参照 Sladowski 的方 法 并 做 改 进[12]，具 体 如 下 ：将 细胞悬液稀释为 5×104 个/ml， 接种于 96 孔细胞培养 板内，每孔 200 μl。 共接 10 板。 分别于接种后 24、48、 72、96、120、144、168、192、216、240 h 取 一 板 细 胞 ， 吸 去培养液，在每孔中加入 20 μl 5 mg/ml MTT 溶液，入 培养箱继续培养 6 h，取出弃上清液，用 PBS 清洗一遍 后每孔中加入 200 μl DMSO， 室温下放置 30 min，用 酶标仪读取 490 nm 处吸光值(OD490)。 2.4 猪 IEC 的鉴定 2.4.1 碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）的鉴定
显 色 液 （DAB 底 物 缓 冲 液 ： DAB 显 色 液 ： 底 物 溶 液 ： 三 蒸 水=1： 1： 1： 20）；每 孔 加 50 μl DAB 显 色 液，室温显色 2~5 min；自来水冲洗，镜检。 3 结果 3.1 猪 IEC 的分离培养
无菌分离后小肠，可以观察到悬浮于培养基的绒 毛，镜下清晰可见(图 1a)。 消化接种后 24~48 h 内贴壁 (图 1b)，贴壁的 IEC 呈单层生长，形状不一，大多呈多 角形，细胞表面有多个突出，胞浆饱满，核为圆形或卵 圆形，核仁 1~2 个，符合小肠上皮细胞的特征。 贴壁的 IEC 呈单 层生 长 ， 形 状 呈 三 角 形 或 者 多 角 形 和 梭 形 等， 细胞生长良好，5~6 d 形成细胞群落，9~11 d 汇合 成片(图 1c)，细胞排列紧密，互相簇拥而 形成 “铺 路石 样”(图1d)。
疫酶联反应，以肌细胞作为阴性对照。 具体操作步骤
b
如下：80%冷丙酮固定 10 min, 吸干多余的冷丙酮；用
11
营养研究
职爱民等：猪小肠粘膜上皮细胞的分离及体外原代培养模型的建立
c
d 注 ：a. 肠 绒 毛 ，40 × ；b. 48 h 内 贴 壁 的 IEC，100 × ；c. 正 在 生 长 的 IEC，100×；d. 铺路石样的 IEC，100×。
新生杜×长×大三元杂交仔猪（未吮奶），购于广东
NU-2500 型 CO2 细胞培养箱(Nuaire 公司，美国)； IX70 型倒 置 生物 显 微镜(Olympus 公 司，日 本)；5804R 型高速大容量冷冻离心机(Eppendorf 公司,德国)；SWCJ-1F 型超净工作台(苏州净化，中 国)；HVE-50 型 高 压蒸汽灭菌锅(HIRAYAMA 公司，日本)；GF-M2000 型 酶标仪（山东高密彩虹仪器公司）；CS101-2AB 型鼓风 干燥箱(重庆试验设备厂)；79-1 型磁力加热搅拌器(江 苏 金 坛 荣 华 仪 器 总 厂)；Orion420A+型 酸 度 计(Thermo Electron 公 司 ，美 国)；DMEM 培 养 基 、胎 牛 血 清 、胰 酶 和胶原酶Ⅱ型(Gibico 公司)，标准胎牛血清（杭州四季 青 公 司 ）， 青 霉 素 、 链 霉 素 、β- 甘 油 磷 酸 钠 、 硝 酸 钴 、 硫 化铵(Sigma 公司)，NaCl、KCl、NaH2PO4·12H2O，K2HPO4、 丙酮、硝酸钙、硫酸镁等试剂均为国产、分析纯。 2 试验方法 2.1 猪 IEC 的分离培养 2.1.1 主要试剂配制
等量的 DMEM-F12 完全培养基终止消化，1 000 r/min 离心 10 min 后移去上清并用 DMEM-F12 完全培养基 悬浮，重复一次后完全培养基悬浮并计数，按 （1～5）× 105 密度接种，37 ℃、5% CO2 培养。 2.2 猪 IEC 的传代培养
移除培养液，PBS 冲洗细胞两次，然后加入 0.25% 的胰酶，镜下观察大部分细胞回缩呈椭圆形时小心移 除消化液，加入完全培养液吹打细胞悬液，使其均匀， 调整所需细胞密度，接种后置于 37 ℃、5% CO2 培养。 2.3 MTT 法测定猪 IEC 的增殖
按 照 说 明 书 配 制 DMEM -F12 不 完 全 培 养 基 ， 0.22 μm 过滤除菌，分装，4 ℃避光保存备用。 1 g Ⅱ型 胶原酶干粉溶于 100 ml 上述配好的 DMEM-F12 不完
职爱民，河南省农业科学院农业部动物免疫学重点开放 实验室，博士，副研究员，450002，河南省郑州市农业路 1 号。
肠粘膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells, IEC)是 省原种猪场。 肠道的重要功能细胞，参与肠道食糜的消化、吸收、免 1.2 主要仪器设备与试剂
疫屏障和应激反应等，并与肠道的内、外分泌功能关 系十分密切。 长期以来，在研究 IEC 的生物学功能、细 胞增殖和分化的调控因素，物质吸收与代谢等多采用 肠道肿瘤细胞系为试验模型[1]。 然而癌细胞是非正常 的细胞，其生理特征明显不同于正常细胞，单纯由癌 细胞系的研究结果来解释正常细胞的行为，明显有其 不足。 原代培养是从供体取得组织细胞后在体外进行 的首次培养， 原代培养的细胞生物学特性变化较少， 最能反映和接近体内生长特性，是一种良好的试验载 体。 国外早在 1993 年就有猪肠细胞原代培养的报道[2]， 其 它 类 型 的 猪 组 织 细 胞 原 代 培 养 的 报 道 也 不 少 [3-5]， 国 内关于动物体细胞原代培养的报道多集中在其它动 物身上[6-9]，而关于猪 IEC 原代培养的方法一直属于空 白。 本试验的目的就是通过机械和酶消化结合的方法 建立猪 IEC 原代培养的系统，为猪肠道营养的研究提 供新的试验材料。 1 试验材料 1.1 试验动物
3.3.2 免疫学方法鉴定 免疫学方法鉴定上皮细胞角蛋白 8 的表达，阳性
细 胞 呈 棕 黄 色 或 棕 褐 色 ，90% 以 上 的 细 胞 呈 阳 性 反 应，如图4 所示。
a
OD 值
0.7
0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
024 48 42 96 120 144 168 192 216 240
b
接 种 时 间 （h）
图 2 猪 IEC 的生长曲线
3.3 猪 IEC 的鉴定 3.3.1 碱性磷酸酶的鉴定
碱性磷酸酶显色后，可以看到细胞胞质含黑色颗 粒 ，细 胞 骨 架 清 晰 ；90% 以 上 的 细 胞 呈 阳 性 反 应 ，如 图 3 所示。
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图 4 免疫学方法鉴定 IEC（100×）
之间有紧密的联系， 共同被称作内胚层结构增殖单 养建立了理想的试验模型。
位。 完整的内胚层结构增殖单位可以很好地通过细胞 与细胞、细胞与细 胞 外基 质(extracellular matrix，ECM) 之间的相互作用或者信息分子的复杂信号网络来维 持自身的平衡[13]。 但这个平衡系统在离体组织样品中 是很脆弱的，因组织突然供血不良、温度调节失衡、细 胞和细胞、细胞和 ECM 的相互作用也会紊乱。 上皮细 胞和 ECM 联系的 紊乱 会 导致 细胞 程 序化 的 死亡 ，即 失巢凋亡现象(anoikis)[14]。 肠干细胞对失巢凋亡有高度 的敏感性，这也正是肠上皮细胞原代培养很难获得成 功的主要原因。 常用的分离方法包括组织切块移植 法、机械分离法、螯合作用和酶消化法，酶消化法分离 上皮细胞的优势可以消除一些细胞和细胞之间的相 互作用,尤其是上皮细胞和隐窝成纤维细胞之间的相 互作用。 所有酶中胶原酶因其对上皮细胞的损伤较小 而使用得最多。 本研究使用胶原酶分离 IEC，效果良好。
营养研究
《饲料工业》·2010 年第 31 卷第 1 期
猪小肠粘膜上皮细胞的分离及体外原代培养模型的建立
职爱民 左建军 黄志毅 邹仕庚 冯定远
摘 要 用机械刮取小肠粘膜加胶原酶Ⅱ消化的方法，采用新生未吮乳仔猪小肠组织，成功地分 离了猪小肠粘膜上皮细胞（Intestinal epithelial cells, IEC）且在体外培养传代，并采用碱性磷酸酶和角 蛋白免疫学试验鉴定，结果表明：体外培养的猪 IEC 在 DMEM-F12 培养基中，细胞在 1~2 d 贴壁，5~6 d 形成细胞克隆，9~11 d 融合成片；碱性磷酸酶和生物素标记的细胞角蛋白抗体鉴定结果显示 90%培 养的细胞为阳性，分别从生化的角度证明和细胞生物学角度鉴定了所培养的细胞为 IEC。
左建军、黄志毅、邹仕庚、冯定远(通讯作者)，华南农业大 学动物科学学院。
收稿日期：2009-10-26 ★ 国家重点基础研究发展计划项目(2004CB117501)、广东联合
基金项目(No.u0731004)和博士点基金项目(20070564014) 资助
全培养液，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌 ，1.5 ml Eppendorf 管以 1 ml/管分装，-20 ℃保存备用 。 DMEM-F12 完全培养基为 DMEM-F12 不完全培养基加 10%的胎 牛血清。 2.1.2 猪 IEC 的分离
取生长良好的细胞，吸去培养液，用 PBS 洗 细 胞
3 次；80％冷丙酮固定 10 min，吸弃，PBS 洗 3 次；加入酶
a
反应基质液 （2％巴比妥钠 1 ml、3％ β-甘油磷酸钠1 ml、
2％硝酸钙 2 ml、2％硫酸镁 1 ml、蒸馏水 5 ml,pH=9.2～
9.4）37 ℃反应 2 h,吸弃，PBS 洗 3 次 ；加 入 2％硝酸钙
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职爱民等：猪小肠粘膜上皮细胞的分离及体外原代培养模型的建立
营养研究
二指肠、回肠和空场各 15 cm 左右，沿纵向剪开，培养 基冲洗三遍并用玻片轻轻刮去表面杂物；清洗后的培 养基转移到新的盛有 15 ml 37 ℃预热 DMEM-F12 不 完全培养基的平皿中， 取出小肠，DMEM-F12 培养基 分离 IEC 细胞，用玻片轻轻分离肠粘 膜组 织 ；用移 液 器吹打均匀后转移到细胞培养瓶中，加入Ⅱ型胶原酶至 0.1%终浓度；分别置 4 ℃和 37 ℃各消化 12 h 和 2 h 后加
2 min,吸弃，PBS 洗 3 次；加入 2％硝酸钴 2 min 后吸弃;
加入 2％硫化铵，放入 37 ℃培养箱 10 min，吸弃；流水
冲洗，镜检。
2.4.2 免疫学方法鉴定
在 96 孔 板 中 接 种 密 度 为 1×105 个/ml 的 细 胞 悬
液 ，每 孔 100 μl，接 种 4 d 后 进 行 IEC 角 蛋 白 8 的 免
PBS 洗细胞 2 min×3 次；吸去多余的 PBST,加 50 μl 封 闭液于孔中,37 ℃孵育 10 min； 吸干液体, 并用 PBST 洗 2 min×3 次；每孔细胞加 100 μl 的 一抗 （鼠 抗人 角 蛋 白 8 单 抗 ）,37 ℃温 育 30 min；PBST 洗 2 min×3 次; 每 孔 加 50 μl 抗 小 鼠 生 物 素 二 抗 ,37 ℃ 孵 育 20 min; PBS 洗 2 min×3 次；每孔加 50 μl HRP 标记链亲和素， 37 ℃ 孵 育 20 min；PBS 洗 2 min×3 次 现 用 现 配 DAB
职爱民等：猪小肠粘膜上皮细胞的分离及体外原代培养模型的建立
营养研究
4 讨论
从细胞生物学角度鉴定了所培养的细胞为 IEC。 综上
位于消化管内壁的肠上皮是一种单层组织，由肠 所述，本试验通过机械分离和胶原酶消化相结合的方
隐窝基部的干细胞不断增殖。 上皮细胞和成纤维细胞 法 ，成 功地 在 体 外 培 养 了 新 生 仔 猪 IEC，为 猪 肠 道 营
图 1 猪肠上皮细胞的分离、培养
3.2 体外原代培养猪IEC 的增殖 其生长曲线如图 2 所示。 由图 2 可知，接种后 48 h
细胞处于适应休眠期， 然后开始进入对数生长期，在 216 h 后处于停滞期，细胞不再增殖。 群体倍增时间约 为 72 h。
a. 100×；b. 300× 图 3 碱性磷酸酶鉴定 IEC
参 照 文 献 报 道 的 方 法[10－11]并 根 据 实 际 情 况 调 整 , 具体如下: 将刚出生未吮乳的仔猪颈动脉放血处死, 75％的酒精擦洗消毒后，置于超净工作台。 无菌条件 下打开腹腔,整体分离肠道,迅速投入盛有 15 ml 37 ℃ 预热 DMEM-F12 不完全培养基的平皿中； 分别取十
四甲基偶氮唑蓝(MTT)母液(5 mg/ml)：称取 250 mg MTT，溶于 50 ml PBS 中，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌, 分装后-20 ℃避光保存备用。
参照 Sladowski 的方 法 并 做 改 进[12]，具 体 如 下 ：将 细胞悬液稀释为 5×104 个/ml， 接种于 96 孔细胞培养 板内，每孔 200 μl。 共接 10 板。 分别于接种后 24、48、 72、96、120、144、168、192、216、240 h 取 一 板 细 胞 ， 吸 去培养液，在每孔中加入 20 μl 5 mg/ml MTT 溶液，入 培养箱继续培养 6 h，取出弃上清液，用 PBS 清洗一遍 后每孔中加入 200 μl DMSO， 室温下放置 30 min，用 酶标仪读取 490 nm 处吸光值(OD490)。 2.4 猪 IEC 的鉴定 2.4.1 碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）的鉴定
显 色 液 （DAB 底 物 缓 冲 液 ： DAB 显 色 液 ： 底 物 溶 液 ： 三 蒸 水=1： 1： 1： 20）；每 孔 加 50 μl DAB 显 色 液，室温显色 2~5 min；自来水冲洗，镜检。 3 结果 3.1 猪 IEC 的分离培养
无菌分离后小肠，可以观察到悬浮于培养基的绒 毛，镜下清晰可见(图 1a)。 消化接种后 24~48 h 内贴壁 (图 1b)，贴壁的 IEC 呈单层生长，形状不一，大多呈多 角形，细胞表面有多个突出，胞浆饱满，核为圆形或卵 圆形，核仁 1~2 个，符合小肠上皮细胞的特征。 贴壁的 IEC 呈单 层生 长 ， 形 状 呈 三 角 形 或 者 多 角 形 和 梭 形 等， 细胞生长良好，5~6 d 形成细胞群落，9~11 d 汇合 成片(图 1c)，细胞排列紧密，互相簇拥而 形成 “铺 路石 样”(图1d)。
疫酶联反应，以肌细胞作为阴性对照。 具体操作步骤
b
如下：80%冷丙酮固定 10 min, 吸干多余的冷丙酮；用
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营养研究
职爱民等：猪小肠粘膜上皮细胞的分离及体外原代培养模型的建立
c
d 注 ：a. 肠 绒 毛 ，40 × ；b. 48 h 内 贴 壁 的 IEC，100 × ；c. 正 在 生 长 的 IEC，100×；d. 铺路石样的 IEC，100×。
新生杜×长×大三元杂交仔猪（未吮奶），购于广东
NU-2500 型 CO2 细胞培养箱(Nuaire 公司，美国)； IX70 型倒 置 生物 显 微镜(Olympus 公 司，日 本)；5804R 型高速大容量冷冻离心机(Eppendorf 公司,德国)；SWCJ-1F 型超净工作台(苏州净化，中 国)；HVE-50 型 高 压蒸汽灭菌锅(HIRAYAMA 公司，日本)；GF-M2000 型 酶标仪（山东高密彩虹仪器公司）；CS101-2AB 型鼓风 干燥箱(重庆试验设备厂)；79-1 型磁力加热搅拌器(江 苏 金 坛 荣 华 仪 器 总 厂)；Orion420A+型 酸 度 计(Thermo Electron 公 司 ，美 国)；DMEM 培 养 基 、胎 牛 血 清 、胰 酶 和胶原酶Ⅱ型(Gibico 公司)，标准胎牛血清（杭州四季 青 公 司 ）， 青 霉 素 、 链 霉 素 、β- 甘 油 磷 酸 钠 、 硝 酸 钴 、 硫 化铵(Sigma 公司)，NaCl、KCl、NaH2PO4·12H2O，K2HPO4、 丙酮、硝酸钙、硫酸镁等试剂均为国产、分析纯。 2 试验方法 2.1 猪 IEC 的分离培养 2.1.1 主要试剂配制
等量的 DMEM-F12 完全培养基终止消化，1 000 r/min 离心 10 min 后移去上清并用 DMEM-F12 完全培养基 悬浮，重复一次后完全培养基悬浮并计数，按 （1～5）× 105 密度接种，37 ℃、5% CO2 培养。 2.2 猪 IEC 的传代培养
移除培养液，PBS 冲洗细胞两次，然后加入 0.25% 的胰酶，镜下观察大部分细胞回缩呈椭圆形时小心移 除消化液，加入完全培养液吹打细胞悬液，使其均匀， 调整所需细胞密度，接种后置于 37 ℃、5% CO2 培养。 2.3 MTT 法测定猪 IEC 的增殖
按 照 说 明 书 配 制 DMEM -F12 不 完 全 培 养 基 ， 0.22 μm 过滤除菌，分装，4 ℃避光保存备用。 1 g Ⅱ型 胶原酶干粉溶于 100 ml 上述配好的 DMEM-F12 不完
职爱民，河南省农业科学院农业部动物免疫学重点开放 实验室，博士，副研究员，450002，河南省郑州市农业路 1 号。