单核苷酸多态性及其应用
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在PCR反应中，将供者-受者染料对分别结合到Taqman探 针的两端，探针未与目标序列结合时，通过FRET作用使供者 不发荧光；完全互补配对后，由于Taq DNA聚合酶具有5‘核 酸酶的活性，可将供者从探针上切下来从而发出荧光。如果 探针与目标序列中存在错配碱基，就会减少探针与目标序列 结合的紧密程度及Taq DNA聚合酶切割供者的活性，也就影 响了供者的荧光释放量，从而使碱基突变链和正常链得以区 分。
绘制人类基因单体型图的目的就是描述人类常 见的遗传多态性模式和染色体上具有成组紧密关联 SNPs的区域。
2002年10月，国际人类基因组单体型图计划 (HapMap计划)正式启动，截至目前已有超过150万 SNPs被精确定位于各染色体上，并且已根据这些 SNPs对来自4个不同人种的269份DNA样品进行了基 因分型。 后期目标是要使总密度达到每500bP有一个SNP。 通过不同个体基因组DNA的基因分型和频率计算， 绘制更加精密的单倍型图谱。人类基因单体型图的 绘制完成，将为我们精确定位复杂疾病(如糖尿病， 癌症，心脏病，脑猝和哮喘等)易感基因提供重要 信息。
2 SNP与疾病易感基因的相关性分析 当一个遗传标记的频率在患者中明显超过非
患者时．就表明该标记可能与这种疾病相关、随 着大量代谢通路和上百万SNPs的确认，SNP作为新 一代遗传标记在人类疾病研究中显示出极高的潜 在价值。
已经有高血压、哮喘、类风湿关节炎、肺癌、 前列腺癌等许多易感基因通过SNP的相关研究被发 现。
硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，其物质的量和焦磷酸 一致。
ATP驱动萤光素酶介导的萤光素向氧化萤光素 (oxyluclferin)的转化，氧化萤光素发出与ATP含量成正 比的可见光信号。 光信号由CCD摄像机检测并通过相应的软件得到反映。
每个峰的高度(光信号）与反应中掺入的核苷酸数成正 比，ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，猝灭光信号， 并再生反应体系，加入另一种dNTP进行下一轮反应。随着 以上过程的循环进行，互补DNA链合成，DNA序列信号峰确 定。 该技术分析系统自动化程度高，通量大，速度快，易 于建立标准化操作，适合大规模SNP研究及基因分型。
PCR扩增
链亲和素包裹的微孔板
+
碱变性
持续缓慢升温
SNP的检测方法
变性高效液相色谱(Denaturing High Performance Liquid Chromatography, DHPLC)
原理
SNP的检测方法
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ质谱分析法(matrix-assisted laser desorption/ionization time-flight mass spectrometry) 原理 ：适当大小的有机分子晶体(介质)用接近其吸收光 谱的激光瞬时激发，会发生能量转移及解吸附过程。如将 低浓度的蛋白质或核酸分子加入介质溶液中并加以干燥， 蛋白质或核酸分子将嵌入到介质晶体中。将该晶体放入质 谱仪的真空小室，用瞬时(纳秒)强激光激发，晶体中的蛋 白质或核酸分子就会解吸附，转变成气相的离子态，此时 可通过质谱分析这些离子。
SNP大都表现为二等位基因（bialletic)多
态性,即在该位置只存在两种不同的碱基。
位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等
位位点被称作单倍型(haplotype)，相邻SNPs的 等位位点倾向于以一个整体遗传给后代.
根据SNP在基因组中的分布位置可分为:
基因编码区SNP(cSNP)
供者
受者
供者
受者
焦磷酸测序法
焦磷酸测序法(pyrosequencing)是一种不依 赖平板胶或毛细管电泳，不依赖DNA的荧光标记/ 激发/检测体系的序列分析技术，适用于已知序列
的DNA片段进行验证分析，适用于已知SNP的序列
验证及基因分型。
焦磷酸测序法主要是由四种酶催化同一反应体 系中的酶级联反应:
SNP的应用
SNP作图
利用SNP图谱搜寻遗传致病基因
SNP在药物设计中的作用
SNP在法医学中的应用
人类起源迁移进化的研究
1．人类基因单体型图的绘制
大多数染色体区域具有少数几个常见的单体型， 代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。
某些染色体区域可以有很多SNP位点，但是只用 少数几个标签SNPs，就能够提供该区域内大多数的 遗传多态性模式。
SNP的检测方法
DNA芯片技术（DNA chip）
将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1块集成电路板上， 彼此之间重叠1个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧 光标记的正常DNA和突变DNA分别与2块DNA芯片杂交，由于至 少存在1个碱基的差异，正常和突变的DNA将会得到不同的杂 交图谱，经过共聚集显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧 光信号，即可确定是否存在突变，该方法快速简单、片动化 程度高，具有很大的发展潜力，将在基因突变检测中心发挥 非常重要的作用。
SNP的特征
SNP是人类可遗传的变异中最常出现的一种， 占所有已知多态性的90%以上，在人类基因组中广 泛存在，人类DNA中每300-1000bp就有一个SNP.
因此，一个人类个体大约携带300万-1000万个 SNPs。
SNP的特征
一个SNP表示在基因组某个位点上一个核苷酸的变 化， 作为一种碱基的替换，大多数为转换（C—T， G—A），也可能是颠换。 具有转换型变异的SNP约占SNP总量的2／3左右。 转换的发生率总是明显高于其它几种变异，而 且在CG序列上出现最为频繁，多是发生C—T的转换， 原因是CG中的C是甲基化的，它能自发的脱氨基而替 换为胸腺嘧啶。
基因调控区SNP(pSNP)
基因间随机编码区SNP(rSNP)
等三类。
因为编码区内的变异率占周围序列的 1/5，cRNP的总量显著少于其他两类SNPs。
cSNP又可分为2种： 同义cSNP(synonymous cSNP)： 非同义cSNP(non-synonymous cSNP)
单核苷酸多态性及其应用
SNP的概念
单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP)
是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变
而引起的多态性。 同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱 基的变化，主要表现为基因组核苷酸水平上的变异 引起的DNA序列多态性 。
Single nucleotide polymorphism
同义cSNP： SNP所导致的编码序列改变并不影响其所翻 译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱 基的含义相同； 非同义cSNP： 指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋 白质序列发生改变，从而影响蛋白质的功能。这 种改变常常是导致生物性状改变的直接原因。 位于基因调控区的SNP则会影响基因表达量 的多少，因此，这两类SNP在功能和疾病发生发 展方面具有更重要的意义。
3．指导用药与药物设计 由于SNP能够充分反映个体间的遗传差异， 所以诵过研究SNP与个体对药物敏感或耐受的 相天性研究，可能阐明遗传因素对药效的影 响，因此可能建立与基因型相关的治疗方 案．对患者施行个性化用药。另外，随着SNP 的研究与药物基因组学的结合．根据特定的 基因型来设计药物将成为可能。
5‘
Taqman 探针
3‘ 受者
供者
来自百度文库
5‘
Taqman 探针
3‘ 受者
供者
引物
供者
受者
5‘
3‘
目标序列
供者 引物 受者
5‘
3‘
目标序列
SNP的检测方法
分子信标(molecular beacon)法
分子信标是一个U型的单链核苷酸探针（探针序列内
部可有一定程度的互补配对），在探针两端也加上供者受者染料对，U型探针使两染料靠近，通过FRET作用使供 者不发荧光。当探针与目标序列完全互补配对后，两染料 分离，使得供者的荧光亮增加，如果目标序列中存在错配 碱基，就会影响探针与其结合，从而影响到供者的荧光亮， 使碱基突变链和正常链得以区分。
包括DNA聚合酶、硫酸化酶、萤光素酶和双磷
酸酶; 反应底物为adenosine 5‘phosphosulfate(APS) 和萤光素。 反应体系还包括待测序的DNA单链和测序引物。
在每一轮测序反应中，加入一种dNTP。 如该dNTP与模板配对，聚合酶就可以催化该dNTP掺入到 引物链中并释放焦磷酸基团(PPi)。 掺入的dNTP和释放的焦磷酸的物质的量相等，反应时 dATP由deoxyadenosine alfa-thio triphosphale(dATPaS) 替代． 因为DNA聚合酶对dATPaS的催化效率比对dATP的催化效 率高，且dATP是萤光素酶的底物，dATPctS不是。
原理:
当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性 温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳 迁移率下降，DNA链中有一个碱基改变时，会在不 同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度 而被分离。
SNP的检测方法
Taqman法
以荧光共振能量传递(fluorescent resonance energy transfer,FRET)为基础的检测方法。
SNP的检测方法
动态等位基因特异性杂交法(dynamic allele specific hybridization,DASH) 用生物素标记一条引物进行目的DNA扩增，PCR产物经生 物素结合于链亲和素包裹的微孔板壁，不带生物素标记的链 用碱洗掉。加入探针和荧光染料，荧光染料SYBR GreenⅠ可 特异性地插入ＤＮＡ双链中，在激发光的作用下发出荧光， 而在单链ＤＮＡ中则不能；探针和ＰＣＲ产物单链杂交后， 在ＤＡＳＨ仪中微孔板持续缓慢升温，同时连续检测各孔中 荧光强度，将温度及各孔中对应的荧光强度输入计算机, Ｓ ＮＰ基因型与探针完全匹配的样品在较高温度才解链,因此在 较高温度才得到d(Fluorescence)/dt峰;与探针不完全匹配的 样品则在较低温度时就得到d(Fluorescence)/dt峰，杂合子 则得到两个峰。
SNP的检测方法
单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism,SSCP)
原理：
单链DNA的折叠结构是由单核苷酸序列 决定的，当某一个碱基发生突变时，便会直 接影响该链的构象，非变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳时迁移率会发生改变。
SNP的检测方法
变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)
SNP数据库
美国国立生物技术信息中心 http://www.nchi.nlm.nin.gov/snp 德国的HGBAS网站 http://www.hgbas.cgr.ki.sei 日本JST的数据库 http://snp.ims.u-tolkyo.ac.jp
绘制人类基因单体型图的目的就是描述人类常 见的遗传多态性模式和染色体上具有成组紧密关联 SNPs的区域。
2002年10月，国际人类基因组单体型图计划 (HapMap计划)正式启动，截至目前已有超过150万 SNPs被精确定位于各染色体上，并且已根据这些 SNPs对来自4个不同人种的269份DNA样品进行了基 因分型。 后期目标是要使总密度达到每500bP有一个SNP。 通过不同个体基因组DNA的基因分型和频率计算， 绘制更加精密的单倍型图谱。人类基因单体型图的 绘制完成，将为我们精确定位复杂疾病(如糖尿病， 癌症，心脏病，脑猝和哮喘等)易感基因提供重要 信息。
2 SNP与疾病易感基因的相关性分析 当一个遗传标记的频率在患者中明显超过非
患者时．就表明该标记可能与这种疾病相关、随 着大量代谢通路和上百万SNPs的确认，SNP作为新 一代遗传标记在人类疾病研究中显示出极高的潜 在价值。
已经有高血压、哮喘、类风湿关节炎、肺癌、 前列腺癌等许多易感基因通过SNP的相关研究被发 现。
硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，其物质的量和焦磷酸 一致。
ATP驱动萤光素酶介导的萤光素向氧化萤光素 (oxyluclferin)的转化，氧化萤光素发出与ATP含量成正 比的可见光信号。 光信号由CCD摄像机检测并通过相应的软件得到反映。
每个峰的高度(光信号）与反应中掺入的核苷酸数成正 比，ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，猝灭光信号， 并再生反应体系，加入另一种dNTP进行下一轮反应。随着 以上过程的循环进行，互补DNA链合成，DNA序列信号峰确 定。 该技术分析系统自动化程度高，通量大，速度快，易 于建立标准化操作，适合大规模SNP研究及基因分型。
PCR扩增
链亲和素包裹的微孔板
+
碱变性
持续缓慢升温
SNP的检测方法
变性高效液相色谱(Denaturing High Performance Liquid Chromatography, DHPLC)
原理
SNP的检测方法
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ质谱分析法(matrix-assisted laser desorption/ionization time-flight mass spectrometry) 原理 ：适当大小的有机分子晶体(介质)用接近其吸收光 谱的激光瞬时激发，会发生能量转移及解吸附过程。如将 低浓度的蛋白质或核酸分子加入介质溶液中并加以干燥， 蛋白质或核酸分子将嵌入到介质晶体中。将该晶体放入质 谱仪的真空小室，用瞬时(纳秒)强激光激发，晶体中的蛋 白质或核酸分子就会解吸附，转变成气相的离子态，此时 可通过质谱分析这些离子。
SNP大都表现为二等位基因（bialletic)多
态性,即在该位置只存在两种不同的碱基。
位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等
位位点被称作单倍型(haplotype)，相邻SNPs的 等位位点倾向于以一个整体遗传给后代.
根据SNP在基因组中的分布位置可分为:
基因编码区SNP(cSNP)
供者
受者
供者
受者
焦磷酸测序法
焦磷酸测序法(pyrosequencing)是一种不依 赖平板胶或毛细管电泳，不依赖DNA的荧光标记/ 激发/检测体系的序列分析技术，适用于已知序列
的DNA片段进行验证分析，适用于已知SNP的序列
验证及基因分型。
焦磷酸测序法主要是由四种酶催化同一反应体 系中的酶级联反应:
SNP的应用
SNP作图
利用SNP图谱搜寻遗传致病基因
SNP在药物设计中的作用
SNP在法医学中的应用
人类起源迁移进化的研究
1．人类基因单体型图的绘制
大多数染色体区域具有少数几个常见的单体型， 代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。
某些染色体区域可以有很多SNP位点，但是只用 少数几个标签SNPs，就能够提供该区域内大多数的 遗传多态性模式。
SNP的检测方法
DNA芯片技术（DNA chip）
将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1块集成电路板上， 彼此之间重叠1个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧 光标记的正常DNA和突变DNA分别与2块DNA芯片杂交，由于至 少存在1个碱基的差异，正常和突变的DNA将会得到不同的杂 交图谱，经过共聚集显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧 光信号，即可确定是否存在突变，该方法快速简单、片动化 程度高，具有很大的发展潜力，将在基因突变检测中心发挥 非常重要的作用。
SNP的特征
SNP是人类可遗传的变异中最常出现的一种， 占所有已知多态性的90%以上，在人类基因组中广 泛存在，人类DNA中每300-1000bp就有一个SNP.
因此，一个人类个体大约携带300万-1000万个 SNPs。
SNP的特征
一个SNP表示在基因组某个位点上一个核苷酸的变 化， 作为一种碱基的替换，大多数为转换（C—T， G—A），也可能是颠换。 具有转换型变异的SNP约占SNP总量的2／3左右。 转换的发生率总是明显高于其它几种变异，而 且在CG序列上出现最为频繁，多是发生C—T的转换， 原因是CG中的C是甲基化的，它能自发的脱氨基而替 换为胸腺嘧啶。
基因调控区SNP(pSNP)
基因间随机编码区SNP(rSNP)
等三类。
因为编码区内的变异率占周围序列的 1/5，cRNP的总量显著少于其他两类SNPs。
cSNP又可分为2种： 同义cSNP(synonymous cSNP)： 非同义cSNP(non-synonymous cSNP)
单核苷酸多态性及其应用
SNP的概念
单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP)
是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变
而引起的多态性。 同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱 基的变化，主要表现为基因组核苷酸水平上的变异 引起的DNA序列多态性 。
Single nucleotide polymorphism
同义cSNP： SNP所导致的编码序列改变并不影响其所翻 译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱 基的含义相同； 非同义cSNP： 指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋 白质序列发生改变，从而影响蛋白质的功能。这 种改变常常是导致生物性状改变的直接原因。 位于基因调控区的SNP则会影响基因表达量 的多少，因此，这两类SNP在功能和疾病发生发 展方面具有更重要的意义。
3．指导用药与药物设计 由于SNP能够充分反映个体间的遗传差异， 所以诵过研究SNP与个体对药物敏感或耐受的 相天性研究，可能阐明遗传因素对药效的影 响，因此可能建立与基因型相关的治疗方 案．对患者施行个性化用药。另外，随着SNP 的研究与药物基因组学的结合．根据特定的 基因型来设计药物将成为可能。
5‘
Taqman 探针
3‘ 受者
供者
来自百度文库
5‘
Taqman 探针
3‘ 受者
供者
引物
供者
受者
5‘
3‘
目标序列
供者 引物 受者
5‘
3‘
目标序列
SNP的检测方法
分子信标(molecular beacon)法
分子信标是一个U型的单链核苷酸探针（探针序列内
部可有一定程度的互补配对），在探针两端也加上供者受者染料对，U型探针使两染料靠近，通过FRET作用使供 者不发荧光。当探针与目标序列完全互补配对后，两染料 分离，使得供者的荧光亮增加，如果目标序列中存在错配 碱基，就会影响探针与其结合，从而影响到供者的荧光亮， 使碱基突变链和正常链得以区分。
包括DNA聚合酶、硫酸化酶、萤光素酶和双磷
酸酶; 反应底物为adenosine 5‘phosphosulfate(APS) 和萤光素。 反应体系还包括待测序的DNA单链和测序引物。
在每一轮测序反应中，加入一种dNTP。 如该dNTP与模板配对，聚合酶就可以催化该dNTP掺入到 引物链中并释放焦磷酸基团(PPi)。 掺入的dNTP和释放的焦磷酸的物质的量相等，反应时 dATP由deoxyadenosine alfa-thio triphosphale(dATPaS) 替代． 因为DNA聚合酶对dATPaS的催化效率比对dATP的催化效 率高，且dATP是萤光素酶的底物，dATPctS不是。
原理:
当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性 温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳 迁移率下降，DNA链中有一个碱基改变时，会在不 同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度 而被分离。
SNP的检测方法
Taqman法
以荧光共振能量传递(fluorescent resonance energy transfer,FRET)为基础的检测方法。
SNP的检测方法
动态等位基因特异性杂交法(dynamic allele specific hybridization,DASH) 用生物素标记一条引物进行目的DNA扩增，PCR产物经生 物素结合于链亲和素包裹的微孔板壁，不带生物素标记的链 用碱洗掉。加入探针和荧光染料，荧光染料SYBR GreenⅠ可 特异性地插入ＤＮＡ双链中，在激发光的作用下发出荧光， 而在单链ＤＮＡ中则不能；探针和ＰＣＲ产物单链杂交后， 在ＤＡＳＨ仪中微孔板持续缓慢升温，同时连续检测各孔中 荧光强度，将温度及各孔中对应的荧光强度输入计算机, Ｓ ＮＰ基因型与探针完全匹配的样品在较高温度才解链,因此在 较高温度才得到d(Fluorescence)/dt峰;与探针不完全匹配的 样品则在较低温度时就得到d(Fluorescence)/dt峰，杂合子 则得到两个峰。
SNP的检测方法
单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism,SSCP)
原理：
单链DNA的折叠结构是由单核苷酸序列 决定的，当某一个碱基发生突变时，便会直 接影响该链的构象，非变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳时迁移率会发生改变。
SNP的检测方法
变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)
SNP数据库
美国国立生物技术信息中心 http://www.nchi.nlm.nin.gov/snp 德国的HGBAS网站 http://www.hgbas.cgr.ki.sei 日本JST的数据库 http://snp.ims.u-tolkyo.ac.jp