单核苷酸多态性分析技术

SNPs检测方法分类
每种SNPs的检测方法都可将之看成由 区分SNPs特异位点的原理方法 和 数据的检测分析手段 两部分组成。
SNPs检测方法的分类
一、区分SNPs 位点的方法 1.基于杂交的方法 2.基于酶的方法 3.以构象为基础的方法 4.直接测序的方法 二、检测分析技术 1.凝胶分析技术 2.荧光检测技术 3. DNA 芯片 4.质谱检测技术
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Taqman 法
Minisequencing
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微测序，又称为
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单核苷酸引物延伸( single nucleotide primer extension , SnuPE ) ,SnuPE SnuPE) 引物指导的核苷酸合成(primer guided nucleotide ) incorpration incorpration) TDI ( template directed dye terminator incorpration ) incorpration)
基于杂交的方法
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原理: 短的核苷酸探针在和互补的目的片段进行 杂交时，完全匹配和有错配两种情况下，根据 杂交复合体稳定性的不同而将SNPs 位点检测 出来。 （差异越大，检测的特异性就越好）
基本操作
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) ,其中包 bp) 设计一对短的核苷酸探针(一般15～20 bp 括了SNP位点 与样品DNA 杂交时，20bp中一个碱基的差异会导 致Tm值下降5～7.5度 严格控制杂交条件，就可以鉴定出样品DNA中是 否存在SNP
单核苷酸多态性分析技术
瑞金医院药剂科 陈冰
单核苷酸多态性
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单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)
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主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引 起的DNA序列多态性。 人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多 态性的90%以上。 SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000 个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至 更多。
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cSNP又可分为2种：
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),即SNP所致的编码序列的 同义cSNP(synonymous cSNP cSNP), 改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱 基与未突变碱基的含义相同； -synonymous cSNP ),指碱基序列的改变 非同义cSNP(non cSNP(non-synonymous cSNP), 可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响 了蛋白质的功能。 这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。cSNP中 约有一半为非同义cSNP。
等位基因特异核苷酸探针 (Allele-specific oligonucleotide ，ASO) 。 修饰过的探针：引入一个错配的碱基、 PNA、 LNAs 等
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动态 的加热过程 ——动态等位基因特异杂交 动态的加热过程 (dynamic allele-specific hybridization, DASH ) DASH)
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基本步骤（液相）
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设计PCR扩增含SNPs位点的一段DNA ) dNTP) 对PCR产物进行纯化（去除引物和dNTP 加入检测引物,其3’末端碱基紧挨于多态性碱基 在DNA 聚合酶及标记的ddNTP 的存在下进行一 个碱基的延伸反应 延伸产物检测
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放射性同位素标记法、发光检测法、凝胶为基础的荧光 检测法、 质谱分析法、变性高压液相色谱法等
肽核酸探针 （Peptide nucleic acids，PNA)
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其骨架是肽键 特点：
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与靶分子高特异性地结 合（3个方面的影响） 链挤入 （形成三链复合 结构）（表达调控以及 反义治疗方面） 对核酸酶和蛋白酶均不 敏感（体外应用）
与靶分子高特异性地结合
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Tm值高 受盐浓度影响小（低盐浓度的体系） △Tm更大（一个PNA碱基的错配会使其Tm值 降低8-20度）
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3’端碱基分别与野生型与突变型模板互补。 当引物3’端与模型不能互补时扩增阻断 通过电泳分析PCR结果判断结果 等位基因特异扩增法 四引物法 五引物法
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方法包括
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等位基因特异性PCR
Taqman探针技术
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基于等位基因特异性杂交原理，Taqman探针在和互补的 目的片段进行杂交时，杂交复合体稳定性 基本步骤：通过检测PCR过程中产生的荧光信号来区分等 位基因，每检测一个SNP位点需要 TaqMan探针(或分子信 标) ，PCR 后进行结果分析。 优点：准确度高，适合样本多、位点数量少的检测。 缺点：价格昂贵（探针合成费用高），仅检测已知SNP位 点，不能同时发现未知SNP。
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基本步骤
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测序引物和DNA模板杂交（PCR扩增的、单链的）， 与酶和底物孵育。 四种dNTP（dATP，dTTP，dCTP，dGTP）之一被 加入反应体系，如与模板配对，与引物的末端形成共 价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。 可见光信号 。每个光信号的 一系列的酶学反应，发出 一系列的酶学反应，发出可见光信号 可见光信号。每个光信号的 峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。 ， 三磷酸腺苷双磷酸酶降解， ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解 淬灭光信号，并再生反应体系。 然后加入下一种dNTP。
基于酶的方法
1）DNA聚合酶 2）连接酶 3）限制性内切酶 4）外切酶FEN 5）RNase H
1）DNA聚合酶
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等位基因特异性PCR 多重等位基因特异性PCR Taqman法 引物延伸法 焦磷酸测序法
突变阻断扩增
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’端外切功能的特点 利用Taq酶缺乏3’-5 -5’ 设计等位基因特异性的引物
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SNP表现形式
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SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以 外的非编码序列上。
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cSNPs、基因周边SNPs（pSNPs）以及基因间SNPs （iSNPs）
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)比较少， cSNP) 位于编码区内的SNP(coding SNP, cSNP 因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。 cSNP在遗传性疾病研究中具有重要意义，因此 cSNP的研究更受关注。
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原理：
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用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜 基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质 子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电 离。 离子在电场作用下加速，根据到达检测器的飞行时间不同而 被检测，测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正 比
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优点：快捷、所需样标本量极少。 缺点：前处理工艺复杂，包括一次PCR、一次微测序、 两次纯化。要求高，必须去除样品中的干扰性离子 （钠，钾），方能获得真实信息的MALDI-TOF质谱 图。
SNP表现形式
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SNP可能是二等位多态性也可能是3个或4个等位 多态性，后两者非常少见。 转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有 转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生 几率相似。 (非甲基化 CpG( 转换的几率之所以高，可能是因为CpG 胞嘧啶鸟嘌呤)二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基 因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基 化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。
GENES ANALYSED BY SBE-DHPLC in Das lab GENE POLYMORPHISM -161T/C (promoter SNP) Ex8+283G/A (intron 8 SNP) 2677G → T (exon 21) 3435C → T (exon 26) 80G → A Glu429Ala Ile105Val
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基因频率
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SNP的影响依赖于药物反应的遗传学基础
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影响大的变异频率低 影响弱的变异频率高
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75%可改变AA序列的SNP等位基因频率<15%， 平均为7%。
SNP研究的优势
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SNP适于快速、规模化筛查。二等位基因 （biallelic） SNP等位基因频率的容易估计。 SNPs 的二态性，也有利于对其进行基因分型。 对SNP进行基因分型包括三方面的内容：
遗传标记
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第一代：RFLP ，以片段长度 第二代：STR，以片段长度 第三代：SNP ，以单个碱基
SNP表现形式
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SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异
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转换(transition) ：AG或CT )：AC、AT或GC、GT 颠换(transversion transversion) 碱基的插入 碱基缺失 通常所说的SNP并不包括后两种情况。
• UGT2B7 • VDR • PGP/MDR1 • PGP/MDR1 • RFC • MTHFR • GSTP1
RFC 80 G→A (R27H)
A/A G/A A/A G/G G/G
Allele frequencies:
A = 43.7% G = 56.3%
MALDITof MALDI-Tof
微测序法/引物延伸法
SBE-DHPLC
• PCR扩增目标序列 • 采用SAP和exoI去除过量 的引物dNTP，以纯化 PCR产物 • 利用ddNTPs进行微测序 方法 • 在引物的3’端只引入一 个碱基，获得包括SNP 的延伸产物 • 对产物变性并进样至 DHPLC • 根据延伸产物的碱基组 成及碱基疏水性分离
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PCR-southern blot • 原理
将PCR扩增产物转移到硝酸纤维膜或尼龙 膜上，再与标记的特异性探针进行杂交，来检测 有无特定的扩增片段及相对含量。 • 优点
• 直接检测基因的点突变，缺失及重排，比PCR产
物EB染色电泳分离法的灵敏度至少要高103以上 • 非放射性同位素标记的探针的应用，使得PCRsouthern blot应用更简便 • 现己广泛应用于癌基因、遗传特异基因、病 原体 特异基因等方面的研究及检测。
所以，PNA/DNA的非特异结合能得到很好的排 除。
LNA(locked nucleic acids)
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其结构是在DNA分子 的2′羟基和核糖环的4′ 碳原子间连入一个亚 甲基的“桥”。 特点：
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能以很高的亲和性和互 补的DNA、RNA 或 LNA 结合（构象更利于 杂交的稳定） 匹配和不匹配的△Tm 增加
Tm及影响因素
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Tm=2(A+T)+4(G+C)：
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(A+T)=15 (G+C)=5, Tm=30+20=50
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Tm=81.5+16.6(lg[K+]+0.41(G+C)%－675/n)
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熔点与离子浓度成正比 与（G+C）成正比 与核苷酸个数成正比。
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变性温度比熔点高；复性温度比熔点低3-5度
SNPs示意图（0.1％）
有意义SNP定位
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富含基因的DNA区域的SNP更有意义 生物学认为基因中SNP更重要
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)：影响最终蛋白产物，2-4/基因 编码区(cSNP cSNP) 调控区：影响剪接，而进一步影响蛋白产量 12000个cSNP 40%影响氨基酸序列Leabharlann Baidu5000个影响功能
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30000个基因
APEX arrayed primer extension)——固相 ( (arrayed
焦磷酸测序法 (Pyrosequencing )
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DNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶(ATP sulfurylase )、 sulfurylase) ) 和三磷酸腺苷双磷酸酶 荧光素酶(luciferase luciferase) )。 ( apyrase apyrase) 原理：DNA 聚合酶在一种dNTP的存在下进行引 将伴随 焦磷酸的释 物延伸反应,而引物的成功延伸 引物的成功延伸将伴随 将伴随焦磷酸的释 化学发光 放,焦磷酸在荧光素酶的存在下能引一种 焦磷酸在荧光素酶的存在下能引一种化学发光 反应,通过发光计的实时监测来达到检测的目的。
Dot blot技术
• 原理：将PCR扩增产物变性后直接点在膜 • •
上，与标记的特异性探针进行杂交。 优点：时间短，可半定量分析，一张膜上 可同时检测多个样品。 局限：只能看到一个斑点，必须小心控制 反应条件，设立阳性及阴性对照，以便对 检测标本做出正确鉴定.
△Tm 利用 利用△
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温度 固定 固定温度
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鉴别基因型所采用的化学反应 完成这些化学反应所采用的模式 应用生物技术系统检测反应结果。
SNPs检测方法
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理想的检测SNPs的方法
——发现未知的SNPs，或检测已知的SNPs
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反应原理严谨：灵敏度和准确度 操作和分析的自动化程度高：快速、简便、高 通量 费用相对低廉
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到现在还没有一个符合以上条件的理想方法 出现