体外检测人Th17细胞频率的方法

军医进修学院学报 J Chinese PLA Postgrad Med Sch
2010 Jan，31（1）
·51·
司。RPMI1640 培 养 液 和 H a n k ′s 液等均购自美国 GIBCO 公司。淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物 制品科技有限责任公司。BD FACS Calibur 流式细 胞仪为美国 BD 公司生产，离心机为北京医用离心 机厂产品，二氧化碳培养箱为力新仪器 ( 上海 ) 公 司的产品，显微镜为重庆光电仪器公司产品，血 球计数板购自上海求精生化试剂仪器有限公司。 3 PBMC 的 分 离 及 PBMC 与 外 周 血 刺 激 培 养 10mL 静脉血肝素抗凝后，加 Hank′s 液稀释，用淋 巴细胞分离液进行密度梯度离心。吸取上、中层 界面的 PBMC 充分洗涤后计数，用 RPMI1640 培养 液重悬 PBMC 并调整细胞密度为 2.5×1010/L。分取 细 胞 悬 液 100μL 与 外 周 血 250μL， 用 PMA 和 离 子霉素 ( 终浓度分别为 300ng/mL 和 1μg/mL) 刺激， 分别加 RPMI1640 充分混匀至总体积为 500μL 和 1 000μL，置于 37℃ CO2 培养箱 1h 后，加蛋白转 运抑制剂 Monensin 2μmol/L 继续培养 6h。 4 PMA 对外周血的刺激培养 取外周血 250μL， PMA 分 别 为 25、50、150、300、500、750、1 000 ng/mL+ 离子霉素 1μg/mL 进行刺激，加 RPMI1640 充分混匀总体积 1 000μL，置于 37℃ CO2 培养箱 1h 后加蛋白质转运抑制剂 Monensin 阻断，继续培 养 6h。 5 BFA 和 Monensin 阻断剂对外周血的刺激培养 取外周血 250μL 用 300ng/mL PMA + 1μg/mL 离 子 霉 素 进 行 刺 激， 加 RPMI1640 充 分 混 匀 总 体 积 1 000μL，置于 37℃ CO2 培养箱 1h 后分别加蛋白 质转运抑制剂 BFA 1μg/mL 或 Monensin 阻断，继 续培养 6h。 6 不同刺激时间时外周血的刺激培养 分别取 3 份 外周血 250μL，方法同上，分别继续培养 3、6、9h。
收稿日期 ：2009-03-31
修回日期 ：2009-04-30
基金项目 ：国家自然科学基金项目 (30801039)
Supported by National Natural Science Foundation of China(30801039)
作者简介 ：黄昂，男，军医进修学院 2007 级在读硕士。Email: huang-
3.0
2.5
%IL-17+ Cd4+ T cells
2.0
1.5
1.0
0.5
0
PMA(ng)： 25 50 150 300
500
lonomycin(μg) ：1 1 1
1
1
750
1000
1
1
图 2 PMA 浓度梯度对 Th17 频率的影响 Fig 2 Effect of PMA concentration gradient on the frequency of
angwin@yahoo.com.cn
通信作者 ：邹正升，主任医师，教授，硕士生导师。Email: zzs302@
sohu.com
CD4 T 细胞的百分比 ) 检测的影响，为后续研究打 下基础。
对象和方法
1 研究对象 解放军 302 医院健康志愿者 13 例， 年龄 20~54 岁，男 8 例，女 5 例，各抽取外周静 脉血 10mL。 2 主 要 试 剂 与 仪 器 PerCP 标 记 的 抗 CD3 单 抗 (PerCP-anti-CD3 mAb)、APC 标 记 的 抗 CD4 单 抗 (APC-anti-CD4 mAb)、PE 标 记 的 抗 IL-17 单 抗 (PE-anti-IL-17 mAb)、莫能菌素 (Monensin)、 布雷杆氏菌素 A(BFA)、溶血素 (BD FACS Lysing Solution)、破膜剂及洗液 (BD Cytofix/Cytoperm Fixation and Permeabilization Solution)、皂苷(Saponin)等均 购 自 美 国 BD 公 司。DMSO、 佛 波 酯 (PMA)、 离 子 霉素 (Ionomycin)、多聚甲醛等均购自美国 Sigma 公
传染病研究所，北京 100039
摘要 : 目的 探讨不同刺激对象、刺激剂量、刺激时间、蛋白质运送抑制剂对体外检测人 Th17 细胞频率的影响。方法 用 不同浓度的佛波酯 (PMA，终浓度 25、50、150、300、500、750、1 000ng/mL) 与离子霉素 (Ionomycin) 对健康人全血和外 周血单个核细胞 (PBMC) 进行刺激，1h 后加蛋白质转运抑制剂布雷杆氏菌素 A(BFA) 或莫能菌素 (Monensin)，分别培养 3h、 6h、9h，收集细胞，以荧光素 -mAb 标记后，用流式细胞术分析 Th17 频率。结果 全血刺激好于 PBMC 对 Th17 频率的检 测效果 (P<0.05)，PMA 300ng/mL 刺激全血时 Th17 频率最高，BFA 或 Monensin 阻断 IL-17 分泌效果相同但溶血有差异，刺 激 6h 最适宜。结论 PMA 300ng/mL + Ionomycin 刺激全血 1h 后加 Monensin 2μmol/L 继续培养 6h，是检测人 Th17 细胞频率 最适宜的方法。 关键词 : Th17 ；细胞 ；方法 ；流式细胞术 中图分类号 ：R 34 文献标识码 ：A 文章编号 ：1005-1139(2010)01-0050-03
Th17 细胞对炎症反应和自身免疫病的发生有 重要调节作用 ， [1-2] 目前尚无 Th17 细胞的有效检 测方法，由于 CD4+T 细胞中仅 Th17 细胞产生 IL17，因此可用 IL-17 阳性细胞占 CD4+T 细胞的百分 比来表示 Th17 细胞频率。为此，本研究在 Carter 等 [3] 建立的三色法流式细胞术基础上，研究了在 两 种 不 同 刺 激 对 象 ( 外 周 血 和 PBMC) 中，PMA 不 同刺激浓度、BFA 和 Monensin 阻断剂及刺激时间 对 Th17 细胞频率 ( 即产生 IL-17 的 Th17 细胞占
In vitro detection of the frequency of human Th17 cells
HUANG Ang1,2, ZHANG Ji-yuan3, ZHANG Zheng3, WANG Fu-sheng3, ZOU Zheng-sheng2 1Student Team, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 2Fourth Department of Infectious Diseases, Chinese PLA 302 Hospital, Beijing 100039, China; 3 Institute of Infectious Diseases, Chinese PLA 302 Hospital, Beijing 100039, China
7 流式细胞仪分析 操作参照 Cytofix/Cytoperm KIT 说明书。 8 统计学分析 采用 CHISS 软件，数据采用 -x±s 表示，多组间均数比较采用 Kruskal-Wallis H 检验， 两组间均数比较采用 Wilcoxon 秩和检验，以 P<0.05 为差异有统计学意义。
P>0Hale Waihona Puke Baidu05
Corresponding author: ZOU Zheng-sheng. Email: zzs302@sohu.com
Abstract: Objective To investigate the effect of different stimulated objects, different stimulating concentrations, different protein transportation inhibitors on the frequency of human Th17 cells. Methods Whole blood or peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were stimulated by PMA at different concentrations(25, 50, 150, 300, 500, 750, and 1 000ng/mL). Ionomycin, different protein transportation inhibitors (BFA or Monensin) were added after 1h and then Th17 cells were detected after different stimulating time points (3, 6, and 9h). Results The stimulating effect of whole blood was better than PBMC(P<0.05). The best final concentration of PMA stimulating the whole blood was 300ng/mL. BFA and Monensin had a similar inhibitory effect on IL-17 secretion, but influenced the process of hemolysis differently. Six hours were found to be more suitable to stimulate the whole blood. Conclusion Stimulating whole blood with PMA (300ng/mL) and Ionomycin, with 2μmol/L Monensin added after 1h and incubated for 6h, can detect the frequency of human Th17 cells. Key words: Th17; cells; methods; flow cytometry
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体外检测人 Th17 细胞频率的方法
军医进修学院学报 J Chinese PLA Postgrad Med Sch
2010 Jan，31（1）
黄 昂 1, 2，张纪元 3，张 政 3，王福生 3，邹正升 2 1 解放军总医院 学员队，北京 100853 ；2 解放军 302 医院 感染四科，北京 100039 ；3 解放军 302 医院
Th17
PMA 300ng/mL + Ionomycin 1μg/mL Monensin-treated
Time(hours)
3h
6h
9h
0.00
1.34
0.00
2.33
0.00
2.83
103
103
103
IL-17-PE
102
102
102
10 1
10 1
10 1
100 0.00
98.66 100 0.00
97.67 100 0.00
97.17
100 101 102 103
100 101 102 103
100 101 102 103
CD4-APC
图 3 流式细胞仪检测不同刺激时间对 Th17 频率的影响 ( 以 IL-17-PE 为标记 ) Fig 3 Flow cytometry showing the effect of different stimulating periods of time on the frequency of Th1（7 marked by IL-17-PE）
4
%IL-17+ Cd4+ T cells
3
2
1
0 PBMCs
Whole blood
图 1 不同刺激条件下的 Th17 频率统计学差异 Fig 1 Statistical difference in frequency of Th17 under different
stimulating conditions