DNA提取原理和方法

密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
基因组DNA－SDS法
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提 离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
Phenol-chloroform extraction of mouse tail DNA

Approximately ~1 cm of tail is cut and put into an microfuge tube; Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55º C overnight or until tissue is dissolved;
溶液Ⅲ Neutralization Buffer
成分 ： 3M KAc / 2M HAc
KAc : K+置换了SDS中的Na+，得到PDS沉淀
HAc : 中和NaOH,使DNA复性
吸附柱 Spin Column with Collection Tubes

结构： 特殊硅基质吸附材料，特异性吸附DNA，而RNA与蛋白 质穿过。 高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。
More Proteinase K may be added if digestion is not complete after 24 hr;


Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for 15 min at RT; Spin at 13,000 rpm for 30 min at RT; Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube; Add 0.5 ml Chloroform and vortex at top speed for 5 min at RT; Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT; Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube, add 50 ml 3 M NaOAc (pH=6.0) and 0.5 ml 100% ethanol, invert several times;
7.Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube; 8.Add 0.5 ml Chloroform and vortex at top speed for min
at RT; 9.Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;
NaOAc (pH=6.0) :
1. 沉淀核酸，缩短乙醇沉淀的时间 2. 提供单价阳离子。减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于 互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，
100% ethanol
1. 任意比和水相混溶，夺去DNA周围的水分子，使DNA失水 而易于聚合。 2. 但是加其他比例的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一 定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀 时，就会影响收得率。
Phenol：
优点：1. 有效变性蛋白质； 2. 抑制了DNase的降解作用。 缺点：能溶解10-15%的水，从而溶解一部分DNA
Chloroform：
1.加速有机相与液相分层。 2.去除DNA水溶液中残留的微量酚。
Isoamyl alcohol：
1. 减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。 2. 有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性 蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
• • •
阴离子交换树脂 磁珠
低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。 磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。


基因组DNA的提取
浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离

有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
Chloroform：
经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用 氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时， 将酚与氯仿混合（1:1）使用。
10.Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge
tube, add 50 ml 3M NaOAc (pH=6.0) and 0.5 ml 100% ethanol, invert several times; 11.Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;

Wash pellet once with 70% ethanol, air dry; Resuspend DNA in ddH2O. Use ~100-200 ml ddH2O to get final concentration as 100ng/ml for PCR.
2. Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55º C overnight or until tissue is dissolved;
质粒DNA的提取--碱裂解法
对数期菌体 上清液 沉淀
溶液I充分重悬
百度文库
抽提
干燥溶解
溶液II裂解
酒精沉淀
质粒DNA溶液
溶液III中和
离心洗涤
SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液的成分及作用 溶液Ⅰ Resuspension Buffer
成分：50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl， pH=8.0
DNA的保存 ：
1. DNA 则多以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解。 2. 基本上，核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度 成正比。
非基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
碱裂解法
密度梯度离心法
煮沸法

质粒DNA的提取--碱裂解法
1、培养细菌使质粒扩增 ---对数生长后期 2、收集和裂解细菌 3、质粒DNA的纯化
Tail solution:
1.SDS ：十二烷基硫酸钠
作用：a. 溶解细胞膜、核膜上脂质成分 b.使蛋白质变性
2.Tris：缓冲液
作用：细胞裂解时PH值也能稳定
3.EDTA
作用：是二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性。
3. More Proteinase K may be added if digestion is not complete
12. If there is no pellet, place samples in -80º C for 10 min
and spin at 13,000 rpm for 25 min at 4º C; 13. Wash pellet once with 70% ethanol, air dry; 14. Resuspend DNA in ddH2O.
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核酸的理化性质
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极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂， 钠盐比游离核酸易溶于水。 在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液 中较稳定。 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于 细胞核中。
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提取DNA总的原则 :
1 保证核酸一级结构的完整性；
2 其他生物大分子的污染应降低到最低程度；
A NaOAc solution with pH lower than 6.0 will cause the EDTA to precipitate;
Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;
If there is no pellet, place samples in -80º C for 10 min and spin at 13,000 rpm for 25 min at 4º C;
3 、质粒DNA的纯化
--- CsCl-溴化乙锭梯度密度离心
取决于线状DNA与闭环DNA与溴化乙锭结合的量
质粒DNA的提取--碱裂解法
原理
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
成分 ：0.2M NaOH / 1% SDS
NaOH ：溶解细胞，DNA变性
SDS ： (1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。 (2)解聚细胞中的核蛋白。 (3)SDS能与蛋白质结合成为复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。 SDS与NaOH联用：增强NaOH的强碱性
SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液的成分及作用
after 24 hr;
Proteinase K :
作用：广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很 高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。
4. Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for
15 min at RT; 5. Spin at 13,000 rpm for 30 min at RT;
大提&小提
区别： 1. 大提可以用于大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，而 小提用的菌液量很少，一般1.5-5ml。 2.一般试剂盒中大提比小提多了溶菌酶、异丙醇（回收沉 淀核酸）、LiCl（特异性去除RNA）、含一定量PEG的氯 化物（回收质粒DNA）及乙酸铵等，其作用及目的都是有 利于细菌的裂解和质粒的纯化，所以大提的产物比小提的 量多很多，而且纯度很高。 3.小提一般用于质粒鉴定和对纯度要求不是很高的实验， 大提用于质粒的大量提取和转染等纯度要求很高的实验。
质粒DNA的提取--碱裂解法
1、培养细菌使质粒扩增 ---对数生长后期
在含有相应抗性的液体培养基中培养已转化质粒的细菌(单克隆)，使 细菌快速增殖的同时质粒DNA得到大量扩增。
37 C 振荡过夜
o
质粒DNA的提取--碱裂解法
2、收集和裂解细菌
非离子型/离子型去污剂
裂解
有机溶剂/碱
加热
质粒DNA的提取--碱裂解法
* 内毒素的去除
•
内毒性也称为脂多糖或LPS，是革兰氏阴性胞膜上一种成分，细菌 外膜的外部脂质完全由内毒素分子组成。 包含疏水区域也包含了亲水和带电区域，从而赋予其与其它分子相 互作用的独特性质。 细菌在其活跃生长时表面的内毒素成分较少，而一旦其死亡则会释 放大量内毒素。在质粒提取的裂解过程中，内毒素会从细菌的外膜 释放到裂解液中。 内毒素会对原代细胞的DNA转染产生严重影响，同样也会影响培养 细胞的敏感性，内毒素水平增加可导致转染效率的大幅下降。
应用
机体软组织 动物韧性组织 细菌、酵母 细胞混悬液 培养细胞
3冷热交替法
4低渗裂解 Ⅲ化学法 1有机溶剂
细菌、病毒
红细胞 细菌、酵母
2去垢剂
3酶解法
组织、培养细胞
细菌、酵母


基因组DNA的提取
吸附材料结合法： 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
根据核酸分离纯化方式的不同有：
3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过 高浓度的金属离子； 4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
DNA提取的几种方法
基因组DNA的提取 非基因组DNA的提取 质粒DNA的提取
共价闭合环状结构
断裂成为线状

基因组DNA的提取
根据裂解方式的不同有： 细胞破碎方法
Ⅰ机械法 1匀浆法 2捣碎法 3研磨法 Ⅱ物理法 1超声法 2反复冻融法
DNA extraction
ZJL 2014.05.09
DNA extraction
• 细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结 合成核蛋白。
真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。前 者为双链线性分子；后者为双链环状分子。 除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒DNA； 在非细胞型病毒颗粒内，DNA的存在形式多种多样。
葡萄糖: 增稠。维持渗透压，防止DNA受机械切力作用降解。
EDTA : 二价金属离子的螯合剂，抑制DNase的活性。 有利于溶菌酶的作用。
这一步溶液中还可以加入RNase 溶菌酶：糖苷水解酶。当溶液中PH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液的成分及作用
溶液Ⅱ Lysis Buffer