笫九章 植物转化载7PPT课件

笫二节 根癌农杆菌TI质粒
• TI质粒是根癌农杆菌染 色体外的遗传物质,为双 股共价闭合的环状DNA 分子,约有150 200KB. • 章鱼碱型 • 胭脂碱型 • 农杆碱型 • 农杆菌素碱型(琥珀碱型)
• 在章鱼碱和胭脂碱型TI质粒DNA分子中, 都含有控制肿瘤诱发的两种基因区段: ★T区段~在肿癌形成期间,从根瘤土壤杆 菌 的TI质粒上导入植物细胞的DNQ片 段,约为23KB. ★和毒性区段~在细菌中表达的数个致瘤基 因,与T区段从细菌转移到植物细胞的遗 传有关.
笫九章 植物转化载体的构建
这一章主要有七节:
一植物基因工程载体的种 类和特征 二 根癌农杆TI质粒 三 T-DNA的结构特点和功 能 四 T-DNA转移的机制 五 植物基因转化载体系统 六 发根家杆菌的RI质粒 七 无选择标记基因植物转
物 植 因 基 转
笫一节 植物基因工程载体的种 类和特征
• 生物载体介导的遗传转化 • 非载体介导的遗传转化种 质转化系统 • 直接转化系统 • 生物载体介导的遗传化根据截体的不同 可以分为病毒载体和质粒载体介导的遗 传转化.
• VIRD:包括4个开放阅读框架,分别编码分子质量约为 16.2,47.4,21.3,和75.8KDA的四种不同的蛋白分子. • VIRD1编码一个DNA松弛酶,这种酶与DNA拓扑异构 酶I作用类似,它先在DNA链上切割一个缺刻,使DNA 解旋后再封闭,降低了DNA超螺旋数目. • VIRB:有两种信号肽序列:一种与细菌输出信号肽序列 相似.另一种信号序列属于脂蛋白信号序列. • VIRC:是毒性区各位点惟一以反针方向转录的位点,含 有两个开放阅读框架VIRC1和VIRC2,分别编码1个约 25KDA的蛋白质和个约22KDA的蛋白质. • VIRH:对植物产生的某些杀菌或者抑菌化合物起解毒 作用.
病毒具有较高的自我复制能力,在转化植 物中可以得到高拷贝的外源基因,有利于 外源基因的表达和功能的实现,可以产生 大量的外源蛋白质.
植物病毒载体感染植物后,病毒载体的 DNA一般不整合到植物细胞核DNA上, 不影响植物基因组的其他功能基因的表 达.
植物基因工程病毒载体存在的 缺陷:
a. 病毒载体不能把携 带的外源基因整合 到寄主染色体上,不 能按孟德尔规律传 递给后代; 病毒载体仍然存在 致病的可能性,可能 会诱发植物产生病 害; c. 病毒载体本身的不 稳定性,病毒载体中 的外源基因很容易 丢失; 病毒基因组发生突 变的频率也很高.
下面对各VIR 基因的性质,功 能及作用机制进行阐述
• VIRA:由单一基因所组成,大小为2.8KB,编码 1条92KDA的多肽.VIR基因所编码的蛋白质 与一些细菌中起转录调节作用的基因产物有很 高的同源性. • 功能:是帮助植物细胞接受植物信号分子,然后 启动毒性区表达. VIRG:小于VIRA,只有1.2KB,为单拷贝基因, 只能编码一条多肽, 即DNA结合化蛋白,
一 TI质粒的有关结构
• T—DNA:是农杆菌侵染植物细胞时,从TI 质粒 上导入植物细胞的一段DNA. • VIR区:VIR上的基因与T-DNA从细菌转移到 植物细胞遗传过程有关,能够使农杆菌表现毒性. • CON区:冠瘿碱能激活TRA基因,诱导TI质粒 转移. • ORI区;调控TI质粒的自我复制,故称复制起始 媒介将外源 基因导入植物细胞中 去 ,并且整合到宿主 细胞的基因组DNA 上. • 二 • 它能提供被寄主细胞 的复制和转录系统所 识别的DNA序列,即 启动子和复制子起始 点位点,以保证转化 的外源基因能在植物 细胞中进行复制和表 达.
一 病毒载体
• 1 .单链的RNA植物病毒 • 2 .单链的DNA植物病毒 • 3 .双链的DNA植物病毒 • 以其优点如下; • 植物病毒载体能把外源基因直接导入植物细胞, 并且系统地分布到整个植株,无需经过从原生质 体再生植株的过程,简化了植物基因工程中外源 基因的传递过程.
T-DNA两个重要特性
☆保留T-DNA两端的末端序列,然后用一 段外源DNA插入或直接取代野生型TDNA的部分基因可以使植物细胞的致瘤 基因除去,从而导致转化的植物细胞不具 有成瘤能力. ☆毒性区对T-DNA 的作用既可以以顺式 作用进行,又可以以反式进行,
VIR 区
• VIR 区段总长度大约35KB,由7个互补群组成, 分别为 VIRA,VIRB,VIRC,VIRD,VIRE,VIRG,VIR H. • 毒性区有两种情况: • 一种是组成性表达,即在无植物诱导分子存在下 依然保持一定的表达水平. • 一种是植物诱导性表达,即这些基因的表达必须 在土壤农杆菌感染植物受伤组织时,植物细胞分 泌的信号分子作用下才能启动表达.
二 质粒载体
• 格兰阴性菌 • 土壤杆菌属(特征是能够诱发植物产生肿瘤) • 根瘤菌属 • 在根瘤土壤杆菌中,决定冠瘿病的质粒TI质粒, 在毛根土壤杆菌中,决定毛根症的质粒为RI质 粒.它们能引起植物细胞产生病症外,还是理想 的基因克隆载体.通过它们可以将外源的DNA 转移到植物细胞,并再生出能够表达外源基因的 转基因植物.
• 从植物冠瘿瘤细胞中分别分离核DNA,叶绿体 DNA,线粒体DNA进行分子杂交证实T-DNA 仅存在于细胞核中. • 大小在23KB左右,都含有一段8KB左右的核 心区. • 胭脂碱T-DNA是一条约23KB的连续DNA片 段,两端各有一段25BP的重复序列,编码13个 基因. • 章鱼碱T-DNA由两条分离T-DNA片段组成,各 自带有相应的左边序列和右边界序列.长约 14DB,携带8个基因,包括章鱼碱合成酶基因和 致瘤基因.
VIRG的调节方式有两种形式:
• 它的全诱导表达需要正常功能的完整VIRA和 VIRG基因存在.依赖于自身编码的VIRG蛋白. • 在乙酰丁香酮存在时,野生型菌株的VIRG可以 由低PH和磷酸饥饿诱导而低水平表达. • VIRG的转录方向是从左到右的,最初的翻译起 始位点只能是48-50位的VIRG. • VIRG作为一种DNA结合蛋白,可以结合 到 VIRB,C,D,E,G和H 操纵的5’端非转录区.