酶活的测定方法

酶活测试及试剂

1 木素过氧化物酶（Lip）：

3ml反应体系：①0.1mol/L酒石酸缓冲液(pH3.0) 1.5mL；②10mmol/L藜芦醇1.0mL；

③粗酶液0.4mL；④10mmol/L H202 0.1mL启动反应，25℃反应3min。于310nm测其光密度，以1.0mL缓冲液代替藜芦醇作空白对照，定义每分钟使1μmol的藜芦醇氧化成藜芦醛所需的酶量为一个酶活力单位(U)，藜芦醛的摩尔吸光系数9 300 mol-1cm-1。

0.1mol/L酒石酸缓冲液(pH3.0)：配0.1mol/L的酒石酸和酒石酸钠溶液各100mL，然后分别取出部分混合均匀至pH值为3.0。（酒石酸：分子量75，0.1mol/L溶液为7.5g/L。酒石酸钠：分子量230，0.1mol/L溶液为23g/L）

10mmol/L藜芦醇：1.682g藜芦醇添加到1L水中即可（试剂藜芦（3,4-Dimethoxybenzyl alcohol）的分子量为168.19）

10mmol/L H202（按1L计算）：称取1.13g过氧化氢试剂加入到1L纯水中即可（原试剂含30% H202）

2 锰过氧化物酶（MnP）：

3ml反应体系：① 0.05mol/L琥珀酸缓冲液（丁二酸）(pH4.5) 2.0mL；②15mmol/LMnSO4 0.5mL；③粗酶液0.4mL；④10mmol/L H202 0.1mL启动反应，37℃反应3min。240nm测吸光值变化。三价锰离子的吸光系数为8100 M−1 cm−1）

0.05mol/L琥珀酸缓冲液（丁二酸）(pH4.5)：配0.05mol/L的琥珀酸和琥珀酸钠溶液各100mL，然后分别取出部分混合均匀至pH值为4.5。（琥珀酸：分子量118.09，0.05mol/L 溶液为5.9g/L。琥珀酸钠：分子量270.15，0.05mol/L溶液为13.5g/L）

15mmol/L MnSO4（按1L计算）：2.535g硫酸锰加入到1L纯水中溶解即可。（试剂为一水硫酸锰, Manganese Sulfate, MuSO4·H2O. 分子量：169.01）

3 漆酶（Lac）：

3ml反应体系：①0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH =5.0）2.0mL；②1.0mmol/L ABTS 0.5mL；③粗酶液0.5mL；在25℃下启动反应，测λ=420nm 处吸光度变化，1 个酶活力单位用每分钟1μmol 的ABTS 被转化所需的酶量。（原理是ABTS被Lac氧化，氧化产物的消光系数ε为3.6×104(mol/L)-1·cm-1）

0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)：配0.1mol/L的柠檬酸柠檬酸钠溶液各100mL，然后分别取出部分混合均匀至pH值为5.0。（柠檬酸：分子量192.14，0.1mol/L

溶液为19.2g/L。柠檬酸钠：分子量294.10，0.1mol/L溶液为29.4g/L）

1.0mmol/L ABTS（按1L计算）：0.549g ABTS加入到1L纯水中溶解即可。（试剂为2,2'-Azinobis(3-ehtylbenzothiazolin-6-sulfnicAcid),C

H16N4O6S4.(NH2)2分子量：548.67）

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