蛋白相互作用研究技术

(4) 由于未被发现的调控途径激活报告基因，这 种假阳性需用其它实验排除。 (5) 假阳性也可能是双杂交设计的原因:cDNA文 库的构建中，如使用随机引物，可能使蛋白 中一些非暴露区域暴露，并被筛选出来；一 对不在同一时间、同一种组织表达的蛋白可 能发生作用，而不是生理意义上的作用。
假 阴 性
两个蛋白之间本应发生相互作用 但报 告基因不表达或表达程度低检测不到。 常见原因： (1) 融合蛋白对细胞有毒性。这时，应选敏 感性低的菌株或拷贝数低的载体；采取共转 化的方法也可以降低毒性。 (2) 若蛋白间相互作用效果弱，则应选高敏 感菌株或高拷贝载体。
(3) prey-AD 对bait-BD无特异性，与无关的 DNA 结合域杂交体共转化酵母亦表现阳性。 在筛出阳性克隆后，将 Prey-AD 与无关 DNA 结合域杂交体作共转化酵母测试。以排除假 阳性。 Harper 采取一种快速鉴别假阳性的方法： 用选择性培养基去除阳性克隆的 bait-BD质粒， 只 剩 prey-AD 质 粒 ， 与 不 同 性 别 的 含 无 关 DNA 结合域杂交体的酵母交配，以二倍体酵 母是否表现阳性来鉴别假阳性。省去了回收 质粒共转化酵母的烦琐步骤。
• 这种方法常用于测定两种蛋白质是否在体 内结合，常使用针对这两种蛋白的抗体分 别进行co-IP，以相互验证，与质谱技术结 合，也可用于确定与特定蛋白结合的未知 蛋白。
优点： 1.得到的蛋白质相互作用是在细胞内天然形成的， 反应的是细胞的生理状态。 2.可以得到天然状态的蛋白复合物。 缺点： 1.可能检测不到低亲和力和瞬时蛋白相互作用。 2.不能证明两种蛋白质的直接结合，其他分子可能 起到桥梁作用。
常见问题及其解决
1.不能有效纯化融合蛋白。
2.检测不到特异性相互作用的目的蛋白条带。
3.背景过高。
4.标签对融合蛋白空间结构的影响。 • 应用特殊的亲和层析系统，如串联亲和层析 （tandem affinity purification，TAP），也是 一个值得注意的趋势，该系统可增加对互作蛋白 的纯化能力，加上质谱技术的应用，成为在细胞 内进行蛋白复合物筛选的有力手段。
三、酵母双杂交基本实验步骤
1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与 DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。 2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合， 构建成文库质粒。 3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活 域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未 知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的 转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达， 便可捕捉到新的蛋白质。
• 在生命科学领域，FRET技术是检测活体中生物大分子纳米级 距离和纳米级距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中 两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。正如前述，当供 体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个 探针的距离在10nm范围以内时，就会产生FRET现象。而在 生物体内，如果两个蛋白质分子的距离在10nm之内，一般认 为这两个蛋白质分子存在直接相互作用。
3.依赖于高质量的可用于免疫沉淀的特异性抗体。
常见问题
1.细胞裂解液的选择。 2.抑制剂的选择。 3.细胞裂解操作。 4.抗体的选择和使用。
第四节 物理学方法研究蛋白质相互作用
• 生物化学方法只能在裂解液中进行，无法 做到在活细胞生理条件下实时动态观察蛋 白间相互作用。而一些物理学方法在一定 程度上改变了这一状态。
（二）用途
• 一方面可以用于确认两个已知蛋白质的相互作用。 • 另一方面，更重要的是可以从cDNA文库中寻找 与已知蛋白质相互作用的未知分子。 该方法的优点： • 一是具有很高的灵敏度，可以检测到生物化学方法 检测不到的相对较弱以及瞬时的蛋白质相互作用； • 另一个优点是在酵母的体内环境中进行分析，更接 近天然状态。
第三节 免疫共沉淀
• 免疫共沉淀（coimmunoprecipitation,co-IP）：以抗体与 抗原间的特异性结合为基础，用于测定蛋 白质相互作用，是确定两种蛋白质在完整 细胞内生理相互作用的有效方法。
原理： • 在保持蛋白相互作用条件下裂解细胞，在裂解液中加入已知蛋 白的抗体，孵育后加入可与抗体结合的蛋白A/G-琼脂糖珠沉 淀抗原抗体复合物，若细胞中有与已知蛋白互作的蛋白，就可 以与上面的复合物一起被沉淀下来，经SDS-PAGE后，复合 物可被分离，再经免疫印迹或质谱鉴定出互作蛋白。
四、酵母双杂交系统存在的缺陷及相应对策
核内作用 融合蛋白必须转至核内才能活化转录。这是影 响双杂交系统进一步推广的主要障碍。对于胞外受 体配体作用。以及需要核外加工修饰等翻译后介导 的蛋白质作用而言，该系统应用受到限制。一般而 言，膜蛋白也不适于此，已出现通过改变某些细胞 膜定位序列，在载体中添加核定位信号序列的方法 以及专门研究非核内蛋白作用的统。
优点： 1.灵敏度高。可以检测到生化方法检测不到的较弱 的蛋白相互作用。
2.实验材料比较容易获得。实验周期短。
3.可以排除其他蛋白的干扰。反映出蛋白间直接的 相互作用。 用途： 1.证明一对蛋白质分子是否存在直接物理结合。
2.分析一对相互作用蛋白间相互作用结构域。
3.用已知蛋白作为钓饵，筛选细胞内与之结合的未 知蛋白。
α－半乳糖苷酶基因
• Mel1：catalyzes the hydrolysis of melibiose to galactose and glucose. Using p-nitrophenyl-α-D-galactoside (PNP- α Gal), a colorless compound that yields a yellow product (p-nitrophenol) upon hydrolysis.
酵母双杂交系统的基 础元件：
• 与BD融合的蛋白---诱饵蛋白（bait） • 与AD融合的蛋白---猎物蛋白或靶蛋白 （prey or target protein） • 基因组中整合了报 告基因（reporter gene）的酵母菌株 ----LacZ（编码B-半 乳糖苷酶）
二、酵母双杂交系统的基本原理和用途
• 酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）： 以酿酒酵母为实验宿主，基于对真核生物调 控转录起始过程的认识和报告基因技术的发 展而建立，是目前蛋白质相互作用研究的最 有力工具。
一、酵母双杂交系统的建立 经典文献出处：
• Fields S, Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature,1989,340(6230):245-246. • 1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先 描述酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）。
• 是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因， 也就是说，是一个其表达产物非常容易被 鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达 调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它 目的基因相融合，在调控序列控制下进行 表达，从而利用它的表达产物来标定目的 基因的表达调控，筛选得到转化体。
• Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活因子，天然 的Gal4分子是由一条由881个氨基酸残基组成的多肽链。 • 两个结构域中的DNA-BD由位于N-末端的147个氨基酸组 成，能识别位于Gal4基因的上游激活序列（upstream activation sequence,UAS）。AD由位于C端的768-881 位多肽构成。他们将Gal4的BD与酵母SNF1融合，将 Gal4的AD与酵母SNF4融合，这两个蛋白已知是可以相互 作用的。 • 当将两种重组质粒共转化含有Gal4结合位点的报告基因 LacZ的酵母菌株后，激活了UAS下游的报告基因LacZ的 表达。
假 阳 性
指诱饵和靶蛋白在没有发生作用的情况 下，报告基因被激活 进行文库筛选时，这是最常见的干扰 实验准确性的问题。
产生假阳性的可能原因
(1) 靶蛋白本身含转录活化成分 ( 如可结合报 告基因上游DNA)，即prey-AD 自身可激活 报告基因转录。
(2) 诱饵蛋白本身有激活作用。对以上情况， 可通过严格对照实验，排除假阳性；或对 诱饵和靶蛋白分别作单独活性检测。
• 酵母双杂交技术在发展的过程中对报告基因、 “诱饵”载体、“猎物”载体等做了很多改进。 其中一个重要改进是引入了多个报告基因，如广 泛采用的HIS3基因等。目前，大多数酵母双杂交 系统往往同时使用2个甚至3个报告基因，但都含 有最基本的lacZ基因。这种多重筛选提高了检测 的灵敏度并减少了假阳性现象。
一、荧光共振能量转移技术 Fluorescence resonance energy transfer, FRET，实现了单个活细胞蛋白质 相互作用的在体实时动态的连续观察。
• 荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的 一种 能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子 的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时， 就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体 的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体 发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。 •
• 该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。 真核生物基于转录需要反式作用因子的参与，真核生物转 录因子含有两个不同的结构域：
•这Baidu Nhomakorabea个结构域各具功能，互不影响，单独存在时均没有转 录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起 来的空间结构方可表现出一个完整的激活因子的功能。
报告基因 (reporter gene)：
• 用该法检测到的互作蛋白，其丰度往往很低，因 此可以用抗体进行检测，当进行筛选时，可以进 行银染，之后切下条带进行质谱检测。
局限：
高等生物的蛋白要求正确的翻译后修饰， 因此，GST融合蛋白在大肠杆菌中的折叠 和修饰往往不能反映其在天然环境中的状 况，检测到的蛋白相互作用也不能充分说 明在天然环境中的状况，还需要其他实验 相互验证。但可以采用真核表达系统，如 昆虫细胞表达系统等，弥补以上缺陷。
第二节 标签融合蛋白结合实验
原理
• 标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和层析原理的、分析 蛋白质体外直接相互作用的方法。
• 该方法利用一种带有特定蛋白序列标签（tag）的纯化融 合蛋白作为钓饵，在体外与待检测的纯化蛋白质温育，然 后用可结合蛋白标签的琼脂糖珠将融合蛋白沉淀回收，洗 脱液经电泳分离并染色。如果两种蛋白质有直接的结合， 待测蛋白质将与融合蛋白同时被琼脂糖珠沉淀（pulldown），在电泳胶中可见到相应的条带。 目前最常用的标签是GST，有各种商品化的载体用于构建 GST融合基因，并在大肠杆菌中表达为GST融合蛋白。利 用GST与还原型谷胱甘肽（glutathione）的结合作用， 可以用共价偶联了还原型谷胱甘肽的琼脂糖珠一步纯化 GST融合蛋白。另一个常用的标签是His标签。
转化率
如何提高转化率是文库筛选成败的关键，尤其 是低丰度cDNA文库筛选，必须提高转化率。 (1)共转化较依次转化省时省力，并可减弱或 消除融合表达蛋白对酵母毒性。
(2)酵母两性接合是更为有效的方法。将诱 饵蛋白载体与靶蛋白载体分别转入不同接 合型单倍体酵母中再杂交。将诱饵蛋白与 靶蛋白带入同一二倍体细胞中。 (3)构建文库也非常重要，体内重组技术成 功率高。
（一）酵母双杂交实验原理
用于鉴定蛋白质-蛋白质之间的互作
• A蛋白（bait），B蛋白 （prey）， A蛋白和B蛋白可以 互作
• A蛋白融合调节蛋白 的DNA结合 结构域（BD）， B蛋白融合调 节蛋白的激活域（AD） • 启动子带有调节蛋白结合位点的 Reporter gene • 在酵母中单独表达任一融合基因， 报告基因不表达 • 在酵母中同时表达两个融合基因， 报告基因表达
第五章 蛋白相互作用研究技术
• 蛋白相互作用是指两个或两个以上蛋白质分子，通 过非共价键形成蛋白复合物的过程。 • 蛋白质间相互作用存在于机体每个细胞的生命活动 过程中。理解蛋白质相互作用的方式、作用程度、 作用结果，将有助于蛋白功能分析、发育机制探索、 疾病发生机制、药物研发等众多问题的解决。
第一节 酵母双杂交法