8、细胞转染(脂质体介导法)

细胞转染（脂质体介导法）
细胞转染可以：（1）真核细胞可以掺入外源DNA而获得新的遗传标志；（2）应用于转基因动植物；（3）应用于生物制药、基因治疗、RNA干扰。

实验材料：293T细胞、MyoD表达质粒、EGFP表达质粒
试剂、试剂盒：DMEM培养基、青霉素、FCS、PBS、EDTA、转染试剂、链霉素、小牛血清仪器、耗材：微量移液器、Tip头、涡旋振荡器、恒温水浴箱、台式离心机、培养皿、转染管、离心管、观察用倒置显微镜、荧光显微镜、CCD
其他：
研究进展
1. 转染技术
国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效转染试剂率高受到研究者们的青睐。

其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。

聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(protonsponge)体。

这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。

大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。

目前在设计更复杂的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。

2. 转染效率
线型PEI（LinePEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（BranchedPEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。

但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。

超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性低，但转染效率却较高。

GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。

聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性，因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒，从而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI，这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性，其可降解性对体内应用也具有重要的意义。

一、实验目的
学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法——脂质体介导的转染。

了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白），为染色准备实验材料。

二、实验原理
上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。

外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。

电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。

但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。

利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。

上图是本次实验采用的脂质体中阳离子组分的结构的示意图。

本次实验采用的脂质体是promega公司的TransFast脂质体试剂，它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。

三、实验材料与器材
1、材料
293T细胞
MyoD表达质粒和EGFP表达质粒
DMEM培养基
链霉素/青霉素（双抗）
FCS（小牛血清）
PBS（磷酸盐缓冲溶液）
胰酶/EDTA消化液
转染试剂（TransFast）
2、器材
20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头
酒精灯
废液缸
血球计数板
涡旋振荡器
恒温水浴箱
台式离心机
35mm培养皿
转染管
15ml离心管
观察用倒置显微镜
荧光显微镜和CCD
四、实验步骤
1、细胞传代
（1）试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。

（2）弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。

（3）用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟（37℃，5%CO2 ）。

用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。

（4）加入1ml的含血清培养基终止反应。

（5）用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。

（6）将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。

（7）用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。

（8）将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。

（9）将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。

2、细胞转染
（1）转染试剂的准备
A. 将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。

B.震荡后将试剂放在-20℃保存，使用前还需震荡，。

（2）选择合适的混合比例（1：1-1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。

在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。

加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。

（3）将混合液在室温放置10-15分钟。

（4）吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。

（5）加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。

（6）到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24-48小时。

3、第二次细胞传代
（1）在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。

（2）再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新粉入培养皿中。

（3）在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

（4）转染条件优化可以参考TransFast的使用说明书。