聚合酶链式反应

DNA扩增量呈指数上升。 反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片 段扩增后的拷贝数，X表示每次扩增效率的平均值，n代表循 环次数。 平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效 率达不到理论值。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR 产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应 称平台期(Plateau)。


（三）DNA变性时间与终延伸时间
为了使模板DNA双链充分打开 ，开始时模板 DNA变性要适当延长，一般设预变性 （predenature)94℃ 3~5min。一般在扩 增完成 后，PCR产物中可能含有长短不一的分子，都 需要一步长时间的延伸反应，称为终延伸 （post extention），时间要保持在10 min左右， 以获得尽可能完整的产物，这对以后进行克隆 或测序反应尤为重要。反应终止后，可以放到 4中保存，以备电泳检测。
（三）三磷酸脱氧核苷酸
一般商品化供应的dNTP溶液pH为7.0，各 dNTP的 浓度为 2.5mmol/L,一般使用浓度控制在 20~200umol/L。四种各dNTP分子浓度必须相等，以 减少错配。 （四）镁离子 镁离子浓度对PCR反应影响很大，既影响到 Taq DNA聚合酶的活性和真实性，又影响到引物退 火、模板和PCR产物的解链温度、产物的特异性以 及引物二聚体生成等。PCR体系中的酶离子浓度在 0.5~2.5mol/L。
2.KCl
浓50mmol/L时，能促使引物退火。但在NaCl浓 度50mmol/L，KCl的浓度大于50mmol/L时，将 会抑制taq DNA聚合酶的活性。
3.DMSO
在使用Klenow大片段进行PCR时，二甲基亚砜 (DMSO)是有用的。但其浓度超过10%将会抑 制Taq DNA 聚合酶50%的活性，所以，大多数 人不使用DMSO。
（三）延伸时间和温度 延伸的时间长短取决于目的序列的长度、浓度及 延伸温度的高低。 一般引物延伸是在72 ℃下进行。对2Kb长的产品 扩增时间多采用1min（ 72 ℃ ）。
（四）平台效应 引起平台效应的因素： （1）dNTP或引物等消耗殆尽 （2）酶活性逐渐降低 （3）最终产物的阻化作用（焦磷酸盐、双链DNA） （4）非特异性产物或引物的二聚体与反应模板的竞争作 用 （5）浓度在10-8mol/ 时的特异引物的重退火（延伸率降 低，TapDNA聚合酶消耗，产物链分叉，引物移位）
2.Taq DNA聚合酶
是一种耐热的依赖于DNA的 DNA聚合酶，最初是从极 端嗜热的栖热水性菌中醇化出来的。目前，基因工程 产品Ampl:Taq TM有出售； 功能： 具 5 ′ →3 ′ DNA聚合酶活性， 5 ′→3 ′ 外切酶活性； 特点：高度耐热，最佳温度75 ℃—80℃;在序列分析和 PCR中应用广泛. 3.T4DNA聚合酶 功能： （1）具5′-凸端补平效果 （2） 5 ′→3 ′ 外切酶活性 （3） 3 ′→5 ′ 外切酶活性 （4）用与制备探针和加减法DNA序列分析
第一节 聚合酶链式反应扩增原理
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。类似于 DNA的体内复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核 苷酸引物。 ①模板DNA变性：模板DNA经93℃左右加热一定时间后，双链DNA 模板或经PCR扩增形成的双链DNA解离成为单链。 ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后， 温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下， 以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制 原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的单链。 变性--退火--延伸三步骤的重复循环，就可获得更多的 “模板互补链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。多 次循环后目的基因扩增放大几百万倍。

（二）反应参数
聚合酶链式反应（PCR）参数包括循环中三阶段 的温度及持续时间控制，以及循环的次数，这 在一定程度上影响着聚合酶链式反应的成功与 否 。通常PCR 反应所采取的反应参数为： 变性温度 95 ℃ 60s 退火温度 38~65 ℃ 60s 延伸温度 72 ℃ 1~2s 循环次数 30~35次 复性温度决定 与所用引物的长短与碱基组成， 一般需要通过实验来确定。
比较常用的酶有： 1.大肠杆菌 DNA聚合酶Ⅰ大片段 （Klenow片段） 它是 DNA聚合酶Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶处理后， 产生分子量为7.6×104的大片段 分子 。具5 ′ →3 ′DNA聚合酶活性 ， 3 ′→5 ′外切酶活性，其具体 用途为： （1）补平经限制性内切酶消化DNA所形成的 3 ′凹 端及对3 ′凹端进行放射性标记； （2）在cDNA可隆中 ，因此合成cDNA第二链。 （3）用于 Sanger双脱氧末端终止法进行DNA的 序 列分析。
第5章 聚合酶链式反应
聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction ,PCR) 80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重 复性好、易自动化等突出优点；能在一个 ephendof管内将所要研究的目的基因或某一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍。
第二节 聚合酶链式反应体系
一、聚合酶链式反应操作程序
通常进行聚合酶链式反应，主要考虑反映体系 、 反映参 数和 DNA变性时间与终变时间三个方 面内容 。
（一）反应体系
聚合酶链式反映体系的总体积依试验要求而定 。 例如，在50ul聚合酶链式反应（PCR）体系中， 加入下列试剂：20pmol上游引物和 20pmol下游 引物 ，20mmol/L Tris-Hcl(pH8.3, 20 ℃)、 1.5mmol/L MgCl2 、25mmol/L KCl、 0.05% Tween20 、100ug/ml 明胶或无核酸酶的牛血 清蛋白、50umol/L dNTP、 2U Taq DNA 聚合 酶、 100~200ngDNA模板，将试剂混匀。
二、引物3 '末位碱基
引物3 ‘末位碱基在很大程度上影响着TapDNA聚 合酶的有效延伸。实验表明，引物3 ’末位碱基 存在错配时，不同碱基的引发效率存在很大的 差异。
三、引物设计软件
第四节 聚合酶链式反应技术类型
一、已知DNA序列的聚合酶链式反应扩增 （一）巢式PCR 巢式PCR是为了增加扩增的灵敏度，对已知序列 设来自百度文库出第一对引物，扩增25个循环。然后根据 序列设计出第二对引物，它和已扩增出序列内 部两条链序列互补，继续再扩增25个循环。如 此，不受平台效应的限制，而且比单一的一对 引物PCR扩增灵敏度特异性高1000倍.
（八）降落PCR
降落（TD）PCR代表了一种完全不同的 PCR优化方法，它不是用许多反应管和每管用 不同的试剂浓度和（或）循环参数，而是一个 反应管或一小组反应管，在适合于扩增目的产 物而的不到人为产物或引物二聚体的循环条件 下反应。
二、逆转录聚合酶链式反应 先用逆转录酶作用于mRNA，以寡聚dT为 引物合成cDNA第一链，然后用已知一对引物， 扩增嵌合分子，这种方法称为逆转录（reverse transcription,RT）PCR，即RT-PCR。 1、RNA样本的制备 2、逆转录反应 用于该反应的引物可以是随即六聚体核苷 酸，也可以是oligo(dT)n。 3、PCR反应体系
4.其他成分
如明胶、牛血清蛋白、非离子型生物去污剂 ， 能帮助酶的作用。
三、聚合酶链式反应的条件
（一）变性的时间和温度 模板DNA和聚合酶链式反应(PCR)产物的变性 不充分是PCR失败的重要原因。一般在第一轮 循环前先进行94℃预变性3~10min，以便使模 板DNA完全解链，然后加入TaqDNA聚合酶趁 热启动，这样可减少聚合酶在低温下仍有活性 而引起的非特异性扩增。
（二）热巢式PCR
是巢式PCR的改进技术。
（三）半巢式PCR
为了节省材料，往往在设计巢式引物时，利用第一对引 物中的一个引物，再从 靶序列内部设计出另一个引物， 效果与巢式PCR相同。
（四）不对称PCR
不对称PCR多用于序列分析。
（五）等位特异性PCR
等位特异性(allele specific)PCR，即AS-PCR，又称扩增受 阻突变体系（amplification refractory mutation system,ARMS）,是为检测点突变而设计的。
第三节 聚合酶链式反应引物设计原则
一、引物设计的一般原则 （1）引物长度应为15~30个核苷酸，Tm可按下 列简单公式计算： Tm=（G+C）x 4 +（A+T） x 2 （2）引物中碱基的分布应当是随机的，避免出 现一连串的单一碱基或产生二级结构。 （3） G+C碱基的含量在45%~55 %左右。 （4）两个引物在3 端均必须与模板互补，5端可 以不互补。 （5）引物自身连续互补碱基小于4个。 （6）引物之间连续互补碱基亦应小于4。
设计RT-PCR引物时需要注意： （1）、引物限定区最好为180~500bp，当然，长片段也可有效的扩 增； （2）、引物5 ’和3’端不应存在回文序列结构； （3）、用oligo(dT)n作逆转录第一链cDNA的引物时，有义引物应 尽量位于RNA的3‘端，以免合成的第一链cDNA全长作为PCR的 模板； （4）、引物限定区的原染色体DNA中最好有一内含子，这样可检 测污染情况，或使引物设计在拼接后RNA的接头处； （5）、PCR引物限定区内最好有一酶切位点，以便鉴定产物； （6）、若待扩增基因的基因组结构不清楚时，因脊椎动物在编码 区5 ’端很少有大于300bp的外显子存在，因此引物限定区最好位 于编码区5 ’端300~400bp范围内，可使引物位于不同的外显子 内。若待研究基因没有内含子，或是细菌、病毒的RNA，就需要 对RNA样品用无RNase污染的DNaseI处理出去染色体DNA。
二、聚合酶链式反应的成分
（一）引物 在聚合酶链式反应中，要注意所用的引物浓度， 一般引物控制在20~200pmol,这种浓度通常足以 保证进行30轮以上的扩增。引物浓度偏高，会 引起错配和菲特异性产物的扩增，同时增加生 成引物二聚体的几率。相反 ，如引物浓度不足， 则聚合酶链式反应的效率极低
（二）DNA聚合酶
（五）模板 聚合酶链式反应（PCR)的模板DNA可以是单链分子， 也可以是双链分子；可以是线状分子，也可以是环 状分子，不过线状分子比环状分子的扩增效果稍好。 就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数 量和纯度。 （六）其他反应成分 1.Tris-HCl 在聚合酶链式反应(PCR)中使用10~50mmol/L TrisHCl (PH8.3,20℃). Tris缓冲液是一种双极化离子缓 冲液，温度每升高一度，PH值下降0.02，因此在典 型的热循环条件下，其 PH值在6.8~7.8之间变化。
发展简史
Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA 变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不 断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明 了聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制 , Klenow 酶催化，PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的 DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA 片段。 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶， Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使 PCR广泛的被应用。
（六）PCR-单链构象多态
1、原理和方法 PCR-单链构象多态(single strand conformtion polymorphism,SSCP) 2、特点 PCR-单链构象多态(PCR-SSCP)的优点是简单、快速、灵 敏度高，可同时处理多个样本。 3、应用
（七）竞争引物PCR
竞争引物PCR（COP-PCR）针对靶DNA一个测点 突变设计出两个等位特异性寡核苷酸（allele specific oligonucleotide ,ASO），一个为正常引物，另一个为突 变引物。
（二）引物的退火 引物的退火温度和所需时间长短取决于反应 体系中扩增的基因组成及引物的长度、浓度和碱 基组成。 实际使用的退火温度要比引物的Tm低5℃ 。 退火温度在55~72℃ 之间都会得到好的结果。一般 当引物中G+C含量高、长度较长并与模板完全配 对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产 物的特异性越高。当然，退火温度叶不能过高， 否则引物不能与模板很好得结合，得不到扩增产 物。退火通常需要30~60s。