7、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR,rtpcr)
rt-pcr检测基因表达水平的原理
rt-pcr检测基因表达水平的原理RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，用于检测基因表达水平。
其原理是通过逆转录将RNA转化为cDNA，并利用聚合酶链式反应（PCR）扩增目标基因的序列，最终定量检测目标基因的表达水平。
下面将详细介绍RT-PCR的原理。
1.逆转录（Reverse Transcription）逆转录是RT-PCR的第一步，主要是将目标基因的RNA转化为互补的DNA，即cDNA。
逆转录反应需要逆转录酶（Reverse Transcriptase）和引物（Primers）的参与。
首先，待检测的RNA通过加热来解旋成为单链。
然后，在逆转录反应中，引物（Primers）结合在RNA的末端，提供一个起始点。
逆转录酶（Reverse Transcriptase）将引物作为模板，合成互补的DNA链。
引物一般选择Oligo-dT引物，它可以与RNA的多聚腺苷酸尾端结合，从而引导逆转录酶合成cDNA链。
此外，逆转录反应还需要dNTP（脱氧核苷酸三磷酸盐）和逆转录缓冲液等辅助物资。
2. PCR扩增（Polymerase Chain Reaction）逆转录后得到的cDNA是目标基因的复制物。
为了增加检测敏感性，需进一步扩增cDNA序列。
在PCR扩增过程中，引物（Primers）的作用是选择目标基因的特异序列，通过引物与目标序列的互补配对，使DNA聚合酶（DNA Polymerase）能够在相应的温度下在该位置合成新的DNA链。
PCR扩增需要参与的物质有DNA聚合酶、引物、dNTP、缓冲液和模板DNA。
引物是PCR反应中的关键，其中一对引物的设计应使其能够选择性地与目标基因序列的两个位点互补，从而能够在接下来的扩增反应中产生目标DNA片段。
PCR反应一般包括三个步骤：变性、退火和扩增。
首先，通过高温（通常为94℃至96℃）变性步骤将目标DNA链分离为两个单链。
RT-PCR的具体步骤
RT-PCR的具体步骤RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常见的分子生物学技术，用于检测RNA分子。
在本文中，我们将介绍RT-PCR的具体步骤，以便您更加全面地了解这种技术。
1.总RNA提取首先需要从细胞中提取RNA。
这可以通过商用试剂盒或手工方法实现。
如果使用试剂盒，则遵循其说明书中的步骤。
如果手工提取RNA，则需要使用三个基本试剂：细胞裂解缓冲液、氯仿和异丙醇。
步骤如下：•将细胞收集在管中，加入裂解缓冲液。
•冷冻-解冻样品3次，使细胞壁破裂并释放RNA。
•加入氯仿并混合。
•离心样品，使沉淀分离出来。
•将上层溶液转移到另一个管中，加入异丙醇。
•冷藏或冷冻，然后离心。
•去除上层液体，并在无水酒精中对RNA进行洗涤和沉淀。
2.反转录在提取出RNA后，需要将其转录为DNA，即逆转录。
这可以通过使用反转录酶（RT）实现。
在反转录步骤中，会加入反转录引物和其他试剂来增强逆转录效果。
这些引物是由需要扩增的RNA序列的反向互补核酸序列构成的。
这些步骤如下：•将RNA加入反转录反应混合物中，该混合物包含反转录酶、引物和其他必要试剂。
•反转录混合物通常通过加热来促进逆转录引物结合到RNA模板上，并形成RNA-DNA杂交链。
随后，反转录酶在杂交链上寻找RNA模板，并通过降低杂交链的熔点来将反转录引物延伸为cDNA链。
3.PCR扩增完成逆转录后，需要进行PCR扩增以增加cDNA的数量。
PCR是一种将 DNA 扩增到数以百万计的技术，能够扩增非常小的DNA模板。
PCR的步骤如下：•在PCR反应混合物中加入适当的引物和其他必要试剂。
•该反应混合物包括DNA聚合酶、模板DNA、引物和核苷酸。
•反应混合物被放入PCR机器中，按照特定的程序进行加热和冷却，使DNA链复制为两条新的DNA链。
•扩增程度由PCR反应的周期数决定。
4.分析最后，将扩增的DNA分离并分析它们的大小、类型和量。
这可以通过游离电泳或毛细管电泳等技术实现。
RT–PCR的原理及实验步骤
RT –PCR的原理及实验步骤一、RT –PCR的原理RT -PCR即逆转录-聚合酶链反应。
原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：(1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；(3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
二、RT-PCR的准备：1.引物的设计及其原则：(1)引物的特异性决定PCR反应特异性。
因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。
在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。
尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
(2)引物设计原则的把握：引物设计原则包括:a.引物长度:一般为15～30 bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。
b.碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。
GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。
c.3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。
rtpcr原理
rtpcr原理RT-PCR原理。
RT-PCR全称为逆转录聚合酶链式反应，是一种用于检测RNA的技术。
它结合了逆转录和聚合酶链式反应的步骤，可以将RNA转录成cDNA，然后进行扩增和检测。
这种技术在分子生物学和医学诊断中得到了广泛的应用，尤其在病毒检测和基因表达分析方面有着重要的作用。
RT-PCR的原理主要分为三个步骤，逆转录、PCR扩增和检测。
首先是逆转录，即将RNA转录成cDNA。
这一步骤需要逆转录酶和引物，逆转录酶能够将RNA模板转录成cDNA，引物则是用来引导逆转录酶的合成。
在逆转录的过程中，引物将与RNA模板结合，逆转录酶将在引物的引导下合成cDNA链。
这样就得到了cDNA模板，为后续的PCR扩增提供了基础。
接下来是PCR扩增，即利用聚合酶链式反应对cDNA进行扩增。
在PCR反应中，需要两种引物，分别是前向引物和反向引物。
这两种引物将在PCR反应中与cDNA模板配对，聚合酶将在引物的引导下合成新的DNA链。
通过多轮的PCR反应，可以将目标DNA序列扩增到可检测的水平。
PCR扩增是RT-PCR技术的关键步骤，它能够快速、高效地扩增目标DNA序列，为后续的检测提供了充分的材料。
最后是检测，即对扩增后的DNA进行检测分析。
常用的检测方法包括凝胶电泳、实时荧光定量PCR和测序等。
凝胶电泳是一种常规的检测方法，通过电泳将扩增后的DNA分离并观察。
实时荧光定量PCR则是一种高灵敏度和高特异性的检测方法，可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号，从而定量分析目标DNA的含量。
而测序则是一种直接测定DNA序列的方法，可以准确地确定目标DNA的碱基序列。
这些检测方法可以根据实际需求进行选择，以满足不同的研究和临床应用。
总的来说，RT-PCR技术通过逆转录、PCR扩增和检测三个步骤，实现了对RNA的检测和分析。
它具有高灵敏度、高特异性和高效性的特点，可以广泛应用于基因表达分析、病毒检测、肿瘤诊断等领域。
随着生物技术的不断发展，RT-PCR技术也在不断完善和改进，为科研和临床诊断提供了强大的工具和支持。
PCR及RT-PCR概述
PCR及RT-PCR概述一、目的掌握聚合酶链式反应(PCR) 及逆转录－聚合酶链式反应(RT-PCR)的基本方法二、原理PCR用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。
在由Taq DNA聚合酶催化的一系列合成反应中，使用两段寡核苷酸作为反应的引物。
一般情况下，这两段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分别与模板DNA 两条链上的各一段序列互补，而这两段模板序列又分别位于待扩增的两侧。
反应时它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA 片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA 聚合酶合成DNA 的最适温度下,以目的DNA 为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍（图4）,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35 轮循环就可使DNA 扩增达106倍。
RNA的多聚酶链式反应（RT-PCR）是以RNA为模板，联合逆转录反应（reverse transcrip－tion, RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的特异DNA，为RNA病毒检测提供了方便；并为获得与扩增特定的RNA互补的cDNA提供了一条极为有利和有效的途径。
RNA扩增包括两个步骤：①在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补链cDNA；②加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNA。
在RT-PCR中关键步骤是RNA的逆转录，cDNA的PCR与一般PCR条件一样。
由于引物的高度选择性，细胞总RNA无需进行分级分离，即可直接用于RNA的PCR。
但RT-PCR对RNA制品的要求极为严格，作为模板的RNA分子必须是完整的，并且不含DNA、蛋白质和其它杂质。
反转录pcr名词解释
反转录pcr名词解释
反转录PCR是一种分子生物学技术，也被称为RT-PCR。
它结合了两种技术，聚合酶链式反应（PCR）和反转录（RT）。
这项技术主要用于从RNA模板合成DNA，然后利用PCR技术扩增DNA。
首先，反转录酶（RT酶）将RNA模板转录成互补的DNA链，这个过程称为反转录。
接着，PCR技术被用来扩增这些DNA片段，使其数量呈指数增长。
这使得科学家们能够从极少量的RNA样本中获得足够的DNA，以便进行后续的分子分析，比如基因表达分析或病毒检测。
反转录PCR在许多领域都有重要的应用，特别是在病毒学和基因表达研究中。
例如，它被用于检测病毒感染，如HIV、流感病毒等。
此外，它也被用于研究基因表达在不同条件下的变化，以及在研究中广泛用于克隆和定量分析特定的RNA。
这项技术的发展对于我们理解疾病的发病机制以及基因表达调控等方面具有重要意义。
rt-pcr的原理应用
RT-PCR的原理应用什么是RT-PCRRT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种基因检测技术，广泛应用于分子生物学和医学领域。
它可以在样本中检测到特定的RNA序列，并且是定量检测RNA的一种常用方法。
RT-PCR结合了反转录（Reverse Transcription）和聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）两个步骤。
RT-PCR的原理RT-PCR首先将RNA反转录为互补的DNA模板，然后通过聚合酶链反应增加DNA模板的数量。
整个过程分为三个主要步骤：反转录、PCR扩增和检测。
1.反转录：RNA在反转录过程中被逆转录酶（reverse transcriptase）转录成DNA。
这个过程使用一些反向引物（reverse primer）和dNTPs（脱氧核苷三磷酸）来帮助反转录酶合成DNA链。
最常用的反转录酶是M-MLV（Moloney Murine Leukemia Virus）逆转录酶。
2.PCR扩增：在反转录完成后，使用特定的引物（primer）将目标DNA序列扩增。
引物是一小段DNA片段，它可以与目标DNA序列的两端序列互补，并作为DNA聚合酶合成新的DNA链的起始物。
PCR过程包括循环加热和降温的步骤，以便在每个循环中将DNA复制一次。
通过PCR扩增，可以快速扩增目标DNA序列的数量。
3.检测：扩增的DNA可以通过凝胶电泳、荧光染料或实时荧光PCR等方法进行检测。
凝胶电泳是一种常用的检测方法，可以通过电泳将DNA片段分离并可视化。
荧光染料可以与DNA结合，通过荧光信号来检测DNA的存在。
实时荧光PCR可以实时监测扩增反应的进行，并通过荧光信号的变化来测量样本中特定序列的数量。
RT-PCR的应用RT-PCR广泛应用于生物医学领域，尤其是在病毒检测、基因表达分析和研究等方面起着重要作用。
1.病毒检测：RT-PCR可以用于检测病毒的存在和定量分析。
逆转录-聚合酶链反应RT-PCRReverseTranscription-Polymerase
历
1983.4 Kary Mullis 在 开 车前去北加利福尼亚红树 县 Redwood country 的 一 条被月光笼罩的山路上构 思了PCR 随后卖给了Roche公司 价格：10,000$ 1993 Nobel prize
史
PCR?
• • • PCR只是一个简单的不起眼玩艺 ——凯利· 穆利斯（Kary Mullis) PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概 念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的 技术，后者又上升成为新的概念。 …
• •
它最大的特点就是能不断推出新形式。
—— 摘自[Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow]
什么是PCR?
我不认为PCR能够用两种“革命”(政治 革命和科学革命)加以说明。……它的发明并 没有改变基因操作的本质。有了PCR，我们 能在更广的范围内更快、更容易地进行基 因操作，学术界也完全不用等到某人死去 或退休后才能接受PCR。它只不过是一种
DNA Replication PCR
解链方式
引 物
Topoisomerase
RNA primer
Heating
DNA primer
延 伸
DNA polymerase I
Taq DNA
polymerase
反应数
细胞分裂一次 DNA复制一次
Continuously 25-30cycles
PCR反应体系的五要素：
实验目的 实验原理 实验过程 注意事项
rRNA(80-85%)；tRNA(15-20%)； mRNA(1-5%)
随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点 退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从 带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA 。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例 。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。因为使用随机引物 从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。 Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3'端所发 现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％，所以与使用 随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性， oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每 20μl反应体系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。 基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反 义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dT) 那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的 设计。GSP可以同与mRNA 3'最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设 计为与反向扩增引物的下游退火。
简述RT-PCR的原理及应用
简述RT-PCR的原理及应用1. RT-PCR的原理RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种将RNA转录成DNA并通过聚合酶链式反应（PCR）扩增的技术。
它结合了逆转录反应（RT）和PCR技术，能够从RNA分子中扩增出目标序列的DNA片段。
RT-PCR的原理可以分为以下几个步骤： - 逆转录反应：在逆转录酶（RT酶）的作用下，将RNA模板反转录成单链cDNA（互补DNA）。
- 第一链合成：通过加入一条适配器序列，形成一条新的DNA链，并使其保持单链状态。
- 第二链合成：加入第二个引物，依靠DNA聚合酶进行DNA链的合成。
此时，所得到的双链cDNA与原始RNA分子完全互补。
这样，通过逆转录和扩增两个步骤，我们可以从RNA模板中获得目标序列的DNA片断。
接下来，这些DNA片段可以通过PCR技术进一步扩增，以获取更多目标DNA。
2. RT-PCR的应用RT-PCR技术具有广泛的应用范围，包括以下几个方面：2.1 基因表达分析RT-PCR广泛应用于基因表达分析领域，其敏感性、特异性和快速性使其成为研究基因表达的重要工具。
通过从细胞中提取RNA，然后经过逆转录反应合成cDNA，最后通过扩增PCR得到目标基因的片段，可以定量分析目标基因在不同条件或组织中的表达水平。
2.2 病毒检测与诊断RT-PCR技术在病毒检测和诊断方面具有重要的应用价值。
病毒RNA是RT-PCR的理想模板，通过逆转录和扩增，可以检测病毒的存在和数量。
例如，在COVID-19大流行期间，RT-PCR被广泛用于检测冠状病毒的RNA，以诊断感染者和筛查潜在的传播者。
2.3 遗传疾病筛查RT-PCR也被广泛用于遗传疾病的筛查，特别是单基因遗传病的检测。
通过RT-PCR扩增目标基因的DNA片段，可以鉴定致病基因的突变。
这对于帮助家族中可能患有遗传病的个体进行早期诊断和咨询是非常重要的。
rtpcr的作用
rtpcr的作用什么是rtpcrrtpcr（全称为逆转录聚合酶链反应，Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction），是一种基因检测技术，可以用于检测RNA分子在样本中的存在并量化。
rtpcr的原理rtpcr技术基于聚合酶链反应（PCR）的原理，通过逆转录将RNA转化为反义DNA （cDNA），然后使用一对特定的引物（primers）扩增目标基因的DNA片段。
逆转录过程中，逆转录酶将RNA模板反向转录合成cDNA，在PCR反应中，DNA聚合酶通过引物将cDNA扩增成大量的DNA。
这个过程可以使我们检测到RNA分子的存在，并量化RNA的数量。
rtpcr的应用rtpcr技术在生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用，特别是在疾病的诊断和治疗中起着重要作用。
1.病原体检测：rtpcr可以检测感染性疾病的病原体，如病毒和细菌。
通过扩增病原体酸核酸的特定片段，可以快速准确地诊断出病原体感染。
2.基因表达分析：rtpcr可以评估基因在不同组织或细胞中的表达水平。
通过对比不同样本中目标基因的表达差异，可以研究基因在生理和病理过程中的调控机制。
3.肿瘤检测：rtpcr可以检测肿瘤标志物，通过扩增患者体液或组织中的肿瘤相关基因，可以及早诊断出肿瘤，进行早期治疗。
4.遗传疾病诊断：rtpcr可以检测遗传疾病的突变基因，帮助医生确定患者是否携带致病基因，并进行遗传咨询和干预。
5.药物研发：rtpcr可以评估药物对特定基因的调控作用，在新药研发中有着重要的应用价值。
rtpcr的优势和局限性rtpcr技术相比传统的基因检测方法具有以下优势：•高灵敏度：可以检测到非常低浓度的目标RNA，并能够量化RNA的表达水平。
•高特异性：通过引物的设计，可以选择性地扩增目标基因，减少误报率。
•高准确性：可以重复多次扩增同一样本，并获得可重复的结果。
然而，rtpcr技术也存在一些局限性：•需要引物设计：需要针对目标基因设计特异引物，这对于一些未知基因或变异较多的基因可能存在困难。
rt-pcr 探针原理 -回复
rt-pcr 探针原理-回复RTPCR 探针原理引言：在生物学研究领域，分子生物学技术的发展为我们揭示了许多生物过程的奥秘。
其中一项重要的技术是逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），它是确定RNA中特定基因表达水平的强大工具。
RT-PCR技术的成功离不开探针的应用，通过探针的设计和合成，可以实现高度特异性的基因表达检测。
本文将详细探讨RT-PCR探针的原理，包括探针的设计、合成和应用方法。
一、RT-PCR的概述逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）是一种将RNA转化为DNA的方法，然后通过后续的PCR扩增反应来检测目标基因的表达水平。
RT-PCR技术的发明使得我们可以准确地测量RNA水平，并分析基因在不同组织或生理状态下的表达差异。
二、RT-PCR探针的基本原理RT-PCR探针是一种特殊的引物，用于在RT-PCR反应中选择性地扩增目标基因的特定序列。
与PCR引物不同，探针通常带有额外的物质，如荧光染料或报告分子，以便在扩增过程中检测目标序列的存在与否。
1. 探针的设计探针的设计是RT-PCR技术中极其重要的一步。
为了保证高度特异性和敏感性，需要根据目标基因的序列设计探针。
首先，需要选择一个足够长的片段作为探针的目标区域。
这个片段应在目标基因的独特区域，不能与其他基因序列混淆。
通常情况下，选择150-200个碱基对的片段是比较合适的。
其次，探针的设计需要满足一定的物理和化学特性。
例如，探针的GC含量应在40-60范围内，以确保适当的熔解温度。
此外，探针的末端应避免存在碱基序列间的重复，以免产生不特异的扩增产物。
最后，为了在PCR反应中检测探针的存在，需要将一个报告分子连接到探针上，比如荧光染料。
这种报告分子可以发出特定的信号，用于检测PCR 扩增的过程中特定序列的存在。
2. 探针的合成探针的合成可以通过合成化学方法来实现。
常见的方法是采用固相法合成，使用4个碱基的硫酰胺磺酰（or phosphoramidite）合成前体进行合成。
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
1． 随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长 序列时，可采用随机六聚体引物这一丌特异的引物来拷贝全长 mRNA。用此种方法时，体 系中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的 特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源于 rRNA。 2． Oligo(dT)：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有 3’端 Poly(A+)尾，此引物不其配对，仅 mRNA 可被转录。由于 Poly(A+)RNA 仅占总 RNA 的 1-4%，故此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA 在数量和复杂性 方面均要小。 3． 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标 RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物， 若 PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由不 mRNA 3’端最靠近的配对引物起 始。用此类引物仅产生所需要的 cDNA，导致更为特异的 PCR 扩增。 三、 试剂准备 1．RMA 提取试剂 2．第一链 cDNA 合成试剂盒 3．dNTPmix：含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2mM 4．Taq DNA 聚合酶 四、操作步骤 1. 总 RNA 的提取：见相关内容。 2. cDNA 第一链的合成：目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同， 但 操 作 步 骤 丌 一 。 现 以 GIBICOL 公 司 提 供 的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
详细 实验方法
逆转录-聚合酶链反应实验方法 实验材料
组织或细胞样品 试剂、试剂盒
一,RTPCR的基本知识
一、RT—PCR的原理逆转录PCR（reverse transcription PCR）或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。
在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR 进行DNA扩增。
RT-PCR的整体过程：首先由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。
RT-PCR 的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。
RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
二、常用RT-PCR定量分析的方法1、实时荧光PCR（Quantitative Real-time PCR）实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
在荧光信号中常用的荧光物质分为两种物质，荧光探针和荧光染料(1)SYBRGreenⅠ荧光染料法在RT-PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
这种方法可以用已知浓度的稳定核酸的标准品绘制标准曲线来对未知样品定量。
标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。
在标准曲线和未知样品反应过程中，通过荧光染料将产物标记，用相应的仪器随着反应的进行记录实验的实时结果。
(2).TaqMan探针法探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。
rtpcr的原理及应用
RTPCR的原理及应用1. 引言实时逆转录聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction, RTPCR)是一种用于检测RNA在体系中的数量和质量的方法。
RTPCR结合了逆转录反应和聚合酶链式反应，能够在短时间内快速、准确地检测样本中的RNA分子。
RTPCR具有灵敏度高、特异性好、快速、简洁的特点，广泛应用于基因表达分析、病原体检测和人类疾病研究等领域。
2. 原理RTPCR的原理基于逆转录反应和聚合酶链式反应。
逆转录反应将RNA转录为cDNA，聚合酶链式反应则在PCR扩增过程中指数倍增加RNA的复制。
RTPCR主要分为两个阶段：逆转录阶段和扩增阶段。
2.1 逆转录阶段逆转录阶段是将RNA转录为cDNA的过程。
首先，将RNA样本与引物（专门识别RNA序列的寡核苷酸）和酶（逆转录酶）混合，通过加热和降温的过程，逆转录酶会将RNA作为模板合成cDNA链。
逆转录阶段的关键步骤是反应体系的温度控制和逆转录酶的选择。
2.2 扩增阶段扩增阶段是将cDNA扩增为大量的DNA片段。
在此阶段，引物将cDNA作为模板，并与聚合酶和核苷酸混合。
扩增过程是通过多个循环的温度变化来实现的。
每个循环都包括分离（95°C）、退火（低温，引物与DNA结合）和扩增（高温，聚合酶合成新的DNA链）的步骤。
这个过程会重复多次，从而指数倍增加扩增产物的数量。
3. 应用RTPCR在基因表达分析、病原体检测和人类疾病研究等领域有着广泛的应用。
3.1 基因表达分析RTPCR可以用于定量研究基因的表达水平。
通过测量PCR产物的数量，可以推断RNA在细胞中的丰度。
这对于研究基因调控、生物过程和疾病机制等具有重要意义。
3.2 病原体检测RTPCR可以用于快速检测病原体，如病毒和细菌。
通过特定引物的选择，可以在样本中检测病原体的存在与数量，从而进行疾病的诊断和监测。
3.3 人类疾病研究RTPCR在人类疾病研究方面发挥着重要作用。
rt-pcr检测基因表达水平的原理
rt-pcr检测基因表达水平的原理一、 rt-pcr检测基因表达水平的基本原理1. rt-pcr技术是一种用来检测基因表达水平的常用方法，其中rt代表逆转录（reverse transcription），pcr代表聚合酶链式反应（polymerase ch本人n reaction）。
2. rt-pcr技术通过将RNA转录成cDNA，然后进行聚合酶链式反应来扩增特定基因的片段，从而检测基因的表达水平。
3. rt-pcr检测基因表达水平的原理可以分为逆转录和聚合酶链式反应两个步骤。
4. 逆转录是将RNA转录成cDNA的过程，通过逆转录酶（reverse transcriptase）的作用，RNA可以被转录成cDNA。
5. 聚合酶链式反应是将cDNA扩增的过程，通过聚合酶和引物（primer）的作用，cDNA可以被扩增成大量的目标片段。
二、 rt-pcr检测基因表达水平的具体步骤1. 提取RNA：首先需要从待检测的组织或细胞中提取总RNA，保证RNA的完整性和纯度对后续实验非常重要。
2. 逆转录：将提取的RNA进行逆转录反应，将RNA转录成cDNA。
逆转录反应需要逆转录酶和随机引物或特异性引物。
3. pcr扩增：将逆转录后得到的cDNA进行聚合酶链式反应，使用特异性引物对目标基因进行扩增。
聚合酶链式反应的过程需要聚合酶、引物和dNTP。
4. 分析结果：最后通过凝胶电泳或实时荧光定量PCR等方法对扩增产物进行定量和分析，得到基因表达水平的信息。
三、 rt-pcr检测基因表达水平的优缺点1. 优点：rt-pcr检测基因表达水平的灵敏度高，可以检测低表达基因；检测结果定量化准确，能够得到基因的具体表达量；方法简单、快速、高效，适用于大规模的基因表达分析。
2. 缺点：需要严格控制反应条件和引物设计，以避免假阳性结果；受到RNA的完整性和纯度的影响，需谨慎处理RNA样本；无法区分剪接异构体，对于复杂基因的表达分析存在局限性。
rt-pcr的原理实验步骤及应用
RT-PCR的原理、实验步骤及应用1. 原理RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的原理，用于检测和定量RNA的表达水平。
下面是RT-PCR的基本原理：•首先，通过逆转录作用，将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。
逆转录酶会在反应中合成cDNA互补链，其中DNA聚合酶将dNTPs部分替换为对应的ddNTPs（荧光标记的核苷酸）用于标记合成的cDNA。
•然后，在PCR反应中使用特定的引物（primers）来扩增目标cDNA。
引物是两个短的DNA序列，它们能够与cDNA互补的序列部分结合，从而指导DNA聚合酶合成新的DNA链。
•最后，通过荧光检测仪读取PCR反应体系中的信号，从而定量检测目标RNA的表达水平。
2. 实验步骤RT-PCR实验通常包括以下步骤：2.1 样品准备•收集所需的细胞或组织样品，并保存在RNA保护液中以保护RNA的完整性。
•如果需要，使用RNA提取试剂盒从细胞或组织中提取RNA。
2.2 逆转录反应•准备RT-PCR反应体系，包括逆转录酶、随机引物、RNA样品和其他反应组分。
•混合反应液，然后进行逆转录反应。
此步骤通常在反应器中以特定温度下进行。
2.3 PCR反应•将逆转录反应产生的cDNA用作PCR反应的模板。
•准备PCR反应体系，包括DNA聚合酶、引物和其他反应组分。
•将PCR反应液混合均匀，然后进行PCR反应。
PCR反应通常包括一系列的循环，在每个循环中，温度会发生变化以使DNA链合成和扩增。
2.4 结果分析•将PCR反应体系中的产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离。
•根据PCR反应产物大小，使用合适的染料将琼脂糖凝胶染色。
•使用紫外线透射仪观察琼脂糖凝胶中的DNA带，以便分析目标基因的扩增效果。
3. 应用RT-PCR广泛应用于分子生物学和医学领域，具有以下应用方面：•基因表达分析：通过测量RNA的表达水平，可以了解目标基因在不同样品中的表达情况，从而研究基因调控、识别潜在的生物标记物等。
TR-PCR
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
一、反转录酶的选择1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
二、合成cDNA引物的选择1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2． Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。
由于Poly(A )RNA 仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
rt pcr原理
rt pcr原理
RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是
一种常用的分子生物学技术，用于检测RNA分子的存在和浓度。
其原理基于聚合酶链式反应（PCR）和逆转录（RT）两
个步骤的结合。
首先，逆转录步骤将RNA转录成相应的DNA分子。
这一步
骤使用逆转录酶将特定的RNA模板转录成互补的DNA链，
生成称为cDNA的复制的DNA。
逆转录酶会在上述反应中合
成新的DNA链，并在合成的DNA链上加上一些特殊的引物
序列。
接下来，PCR步骤用于扩增目标DNA片段。
PCR反应通过转
录酶链式反应引发DNA的扩增。
反应液中的DNA片段会被PCR引物引导，并在加入热稳定的聚合酶的情况下，经历一
系列的循环性变性、退火和延伸，从而扩增起始 DNA区域。
这些循环热压的步骤会导致指数级别的DNA增加，从而产生
大量特定DNA片段。
扩增反应进行完毕后，可以采用多种方法来检测扩增产物。
最常见的方法是使用凝胶电泳，将扩增产物根据大小进行分离并观察。
此外，还可以使用DNA染料或探针等，在实验室条件
下观察和量化。
总的来说，RT-PCR技术通过结合逆转录和PCR两个步骤，
可以将RNA分子转录成DNA，并对目标DNA片段进行扩增。
这一技术在基因表达分析、病毒检测和遗传研究等领域得到了广泛应用。
定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)
定量逆转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）一、实验原理逆转录-聚合酶链反应(Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo （dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
二、实验步骤（一）总RNA提取1.Trizol裂解收集各处理组细胞于1.5ml离心管，用PBS缓冲液洗涤1次，每5～10×106个细胞加入1ml Trizol，吹打数次，使细胞充分裂解，室温静置5min。
（裂解后若不能及提取RNA，可在加入Trizol后，将其保存于-80℃）2.氯仿（三氯甲烷）萃取（1）每管加入200ul氯仿（Trizol :氯仿= 5 : 1），盖好离心管后，涡旋震荡15s后，放置室温静置2min。
（2）4℃、12000rpm条件下离心15min后，溶液分为上、中、下3层，上层为水相（无色透明，含RNA），下层为有机层（粉红色，含DNA和蛋白质等）。
3.异丙醇沉淀（1）吸取上层水相（约500μL）至RNase-free离心管中。
（不要吸到中间层）（2）加入500μL异丙醇（与上层水相等量），颠倒混匀数次。
（不要剧烈摇晃）（3）4℃、12000rpm条件下离心15min后，吸弃上清液，保留底部白色沉淀。
4.75%乙醇洗涤沉淀（1）加入1mL 75%乙醇（现配现用，DEPC水:无水乙醇= 1:3，配制后上下颠倒混匀）洗涤沉淀，涡旋震荡。
（2）4℃、12000rpm条件下离心5min后，吸弃上清液，将离心管开盖干燥10min。
5. RNA干燥溶解每管加入50μL DEPC水，盖好离心管后，敲打溶解。
（二）RNA浓度和纯度检测1.提前10min对酶联免疫分析仪进行预热。
2.用DEPC水洗涤微量比色皿。
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逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR，rtpcr）
逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）可以：（1）分析基因的转录产物；（2）获取目的基因；（3）合成cDNA探针；（4）构建RNA高效转录系统。
逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA
高效转录系统。
实验材料：组织、细胞
试剂、试剂盒：RNA提取试剂、dNTP混合物、Taq DNA聚合酶、第一链cDNA合成试剂盒仪器、耗材：离心管、离心机、水浴锅、PCR管、电泳仪、凝胶图像分析系统、移液管、移液枪、离心管盒
一、反转录酶的选择
1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
二、合成cDNA引物的选择
1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。
由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。
用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
三、试剂准备
1．RMA提取试剂
2．第一链cDNA合成试剂盒
3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
4．Taq DNA聚合酶
四、操作步骤
1. 总RNA的提取：见相关内容。
2. cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。
现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
①在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。
在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心。
②70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。
然后加入下列试剂的混合物：10×PCR buffer 2μl；25mM MgCl2 2μl；10mM dNTPmix 1μl；0.1M DTT 2μl
轻轻混匀，离心。
42℃孵育2-5min。
③加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。
④于70℃加热15min以终止反应。
⑤将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解残留的RNA。
-20℃保存备用。
3．PCR：
①取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2μl；上游引物（10pM）2μl；下游引物（10pM）2μl；dNTP(2mM) 4μl；10×PCR buffer 5μl；Taq 酶（2u/μl）1μl。
②加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。
轻轻混匀，离心。
③设定PCR程序。
在适当的温度参数下扩增28-32个循环。
为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。
④电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
⑤密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
五、注意事项
1．在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。
在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。
2．为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。
3．内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。
常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。
其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
4．PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。
故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。
5．防止DNA的污染：①采用DNA酶处理RNA样品；②在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。