(4) 絮凝沉淀技术

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（2）压力差破碎法 渗透压冲击 将细胞先放入高渗透压的介质中，如高浓度的甘 油或蔗糖溶液，在达到平衡后，介质被突然稀释， 或将细胞转入水中或缓冲液中，水就会迅速进入 细胞内，致使细胞膨胀，引起细胞壁的破裂.
此法适用于细胞壁比较脆弱的，或者细胞壁预先 用酶处理过的，或细胞壁合成受到抑制的微生物。 在各种细胞破碎法种是最为温和的一种。
沉 淀 技 术
赵 林
1
2
生物分离过程的一般流程
原料液 细胞分离(离心，过滤) 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲) 复性 细胞破碎 碎片分离
路线一
路线二
清液－胞外产物
路线一A
粗分离(沉淀/超过滤/萃取)
纯化(层析、离子交换、吸附) 脱盐(凝胶过滤、超滤) 浓缩(超滤) 精制(结晶、干燥)
在生物学上惰性，不能影响蛋白质的分子活性，而且尽 量不引入分离和测定的新杂质。 盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀的沉降和离心分离。 来源丰富、经济，常用盐有硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。
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（3）pH 对盐析的影响
一般而言，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解 度越大。 改变pH 可以改变蛋白质的带电性质，即可改
物。
• 沉淀生物活性物质时需注意沉淀剂或沉淀条件是否会破
坏活性；是否有毒；是否易除去。
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沉淀技术的应用
沉淀分离技术广泛应用于抗生素、有机酸等小分子物质和 蛋白质、多糖、核酸等大分子物质的分离。
通过沉淀技术可以达到产物浓缩的目的。
沉淀可以将已经纯化的产品由液态变成固态加以保存或进 一步处理。 沉淀可以进行间歇或连续操作。
（2）蛋白质分子周围的水化 层防止蛋白质凝聚沉淀。
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29
蛋白质外围结构： 双电层、水化层。
双电层
紧密层 分散层
蛋白质分子
• 带电粒子的静电相互作用取 •
决于ζ 电位的大小。 分散层厚度越小，ζ 电位越 小
双电层
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ζ 电位
ζ 电位是一个表征分散体系稳定性的重要指标。
由于带电微粒吸引分散系中带相反电荷的粒子，离 颗粒表面近的离子被强烈束缚着，而那些距离较远 的离子形成一个松散的电子云，电子云的内外电位 差就叫作ζ 电位。
如图所示，沉淀目
标蛋白的用盐饱和 度范围为35%-55%
具体值应根据同时
得到较大纯化倍数
和回收率而定。
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蛋白质盐析沉淀实例
硫酸铵饱和浓度 目标蛋白 来源 一次沉淀 人干扰素 白细胞介素2 二次沉淀 99 73.5 75 1.7 7.0 1.8 收率 纯化倍数
细胞培养液 30（上清液） 80（沉淀） 细胞培养液 35（上清液） 85（沉淀） 50（沉淀）
一些盐，以取得好的分离效果。 蛋白质浓度一般控制在2.5-3.0% 较合适。
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（2） 离子类型和离子强度的影响
常见阴离子盐析作用顺序： PO43-〉SO42-〉CH3COO-〉Cl-〉NO3-〉ClO4-〉I-〉SCN-
常见阳离子盐析作用顺序：
Al3+〉H+ 〉Ba2+〉Ca2+〉3;
溶解度和离子强度的关系
水溶液中蛋白质的溶解度一般在生理离子强度范 围（0.15~0.2 mol/kg）时最大。 当离子强度较高时，溶解度的对数与离子强度之 间呈线性关系。
Cohn方程： logS = β- ksI
S 蛋白质溶解度 g/L β 常数，取决于溶质的性质，多为经验数据。 ks 盐析常数 I 离子强度 mol/L
logC1 /C2 = ks（I2 -I1 ）
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几点结论
不同浓度的蛋白质盐析所需盐浓度不同，高浓度蛋白质可 以节约盐的用量。 蛋白质浓度太高时，由于一些蛋白质的β、 ks常数相近， 会发生严重的共沉作用。 蛋白质浓度太低时，所用盐的量较多，但发生共沉作用少。
分步分离提纯过程中，宁可控制蛋白质浓度低一些，多用
在超声波作用下 液体发生空化作 用（cavitation）， 空穴的形成、增 大和闭合产生极 大的冲击波和剪 切力，使细胞破 碎。 由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，主 要用于实验室规模的细胞破碎。
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2 物理破碎
（1）温度差破碎法 冻结（液氮） - 融化（50-60℃）
低温冷冻一方面能使细胞膜的疏水键结构 断裂，从而增加细胞的亲水性能；另一方 面胞内水结晶使细胞内外溶液浓度发生变 化，引起细胞突然膨胀而破裂。
氨基酸
二级结构
三级结构
血红蛋白
四级结构
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疏水作用力
氢键作用力
离子键作用力 二硫键
Cys-SH-----HS-Cys Cys-S—S-Cys
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1、蛋白质盐析的原理
分子直径：1—30 nm 相对分子量：5×103—1×106u
• 蛋白质分子以亲水胶体形式
存在于水溶液中。 （1）蛋白质为两性电解质， 在 一 定 pH 下 带 一 定 电 荷 ， 静电斥力使分子相互排斥。
组织纤溶酶原激活物 猪心抽提液
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（3）硫酸铵盐析需注意的问题
• 加固体硫酸铵时，要看清表上的温度要求。
• 分段盐析时，要考虑每次分段后蛋白质浓度的变化，以调整
不同的盐析饱和度。
• 盐析后一般需要放置半小时至1小时，待沉淀完全后再进行
过滤或离心，过早的分离会影响收率。
T
C
I
C
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4、盐析沉淀技术的操作
• 盐析常用盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁；磷酸钠、磷酸钾；
氯化钠、氯化钾；醋酸钠、柠檬酸钠、硫氰化钾等。
• 硫酸铵优点是溶解度比较大，而且受温度影响较小；缺点
是缓冲能力弱，含氮原子对蛋白质分析有影响。
• 硫酸钠是不含氮原子对蛋白质分析没有影响；缺点是30度
以下溶解度较低，30度以上效果较好。
盐的种类 盐析作用 溶解度 溶解度受T影响 缓冲能力 其他性质
硫酸铵
硫酸钠 磷酸盐
大
大 小
大
较小 较小
小
大 大
小
小 大
含氮、便宜
不含氮、较贵 不含氮、贵
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硫酸铵盐析操作
（1）硫酸铵使用前的预处理
• 选择硫酸铵纯度级别：粗分离采用三级纯度的生化工业用
的硫酸铵；对于蛋白质或酶的分离，要用纯度较高或经过 重结晶的硫酸铵。
钙盐法
谷氨酸+Ca2+
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二
盐析 salting-out
盐析沉淀技术
指生物大分子等物质在高浓度中性盐的水溶液 中溶解度降低而发生沉淀。
盐析法的优点： 成本低；操作简单、安全；对许多生物活性物 质稳定。 许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、 多肽、多糖、核酸等。
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蛋白质的各级结构
一级结构
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ks 盐析常数
主要取决于加盐的性质，ks大小与各种离子价数成正比， 与离子半径及溶液的介电常数有关。 多价阴离子，如硫酸根和磷酸根有较高的ks 蛋白质的盐析常数会受到溶液pH和温度的影响。
蛋白质 β-乳球蛋白 马血红蛋白 人血红蛋白 马肌红蛋白 卵清蛋白 纤维蛋白原 1.07 0.94 1.22 1.46 0.33 0.71 NaCl MgSO4 (NH4)2SO4 Na2SO4 0.63 0.76 1.00 2.00 0.69 磷酸盐 柠檬酸钠
一些蛋白质的盐析常数
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2、盐析方法的分类
在一定pH和温度下，改变离子强度的盐析
叫ks分段盐析法；适用于早期粗分离。 在一定离子强度下改变pH和温度的盐析叫
β分段盐析法；适用于后期的进一步分离提
纯。
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3、影响盐析的因素
（1） 蛋白质浓度的影响
logC1 = β- ksI1 logC2 = β- ksI2
变蛋白质溶解度。
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（4）温度对盐析的影响
在低离子强度下，蛋白质溶解度在一定范围
内一般随着温度增加而增加。
在高离子强度下，蛋白质类生物大分子随温
度的升高溶解度常常降低。 一般情况下，蛋白质盐析对温度的要求不严 格，在室温下进行即可；对温度敏感的酶，要在 0-4度下操作，以免失活。
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COHb
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盐析法机理
（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量盐 加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化 力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失， 使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。
（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域 间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易 沉淀。 （3）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋白 质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力 降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚 集而沉淀。
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分步盐析
不同蛋白质发生盐析时所需
求的离子强度是不同的。
一般从低离子强度到高离子
强度顺序进行分步沉淀。
假球蛋白 血清白蛋白C 血红蛋白
纤维蛋白原
肌红蛋白
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盐析用盐的基本要求
溶解度大，能配制高离子强度的盐溶液； 盐析作用强，一般多价阴离子较强，而多价阳离子容 易使盐析作用降低；
溶解度受温度影响小，便于在低温下操作
• 除去重金属离子：将硫酸铵配成溶液，通入硫化氢至饱和，
放置过夜，过滤除去重金属离子，滤液蒸发浓缩结晶，在 100度下烘干。
• 调pH：高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（pH约为5），
适用前用氨水或硫酸调至所需的值。
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（2）饱和硫酸铵的配制及调整
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固体加入法：将硫酸铵磨碎成细粒，在搅拌下分批缓慢加 入溶液中。当盐析要求饱和度较高而又不增大溶液的体积 时，多用此法。 饱和液法：取过量硫酸铵加热（50度）搅拌溶解，保温
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应用沉淀技术应考虑的因素
沉淀的方法和技术应具有一定的选择性，以使要分离的目 标成分得以很好的分离。（选择性越好，纯度越高） 对于酶类和蛋白质，除了选择性之外，还需要注意沉淀方 法对目标成分活性和结构的破坏作用。
对用于食品和医药中的目标成分，还需要考虑沉淀剂残留 对人体是否有害。
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沉淀技术的分类
破碎方法介绍
1.机械破碎法 2.物理破碎法 3.化学破碎法
4.酶学破碎法
4
1 机械破碎
1. 高压匀浆破碎 2. 珠磨破碎 机械破碎
3. 喷雾撞击破碎 4. 超声波破碎
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（1）高压匀浆
剪切力 450 m/s 50-70 MPa
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（2）珠磨
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（3）喷雾撞击破碎
高速冻结、微小粒子、高速载气
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（4）超声波
10分钟，趁热滤去不溶物，放置过夜，第二天有少量硫酸
铵析出即达到100%的饱和度。 盐析时所需加饱和液的体积 V=V0（S2-S1）/（1-S2） 透析平衡法：先将待盐析的样品装于透析袋内，然后进入 饱和硫酸铵溶液中进行透析，硫酸铵逐步进入袋内达到盐 析饱和度，产生沉淀。
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盐析所需饱和度的试验确定：
金属盐沉淀法 盐析法 等电点法 有机溶剂法 选择变性法 非离子多聚体法 生成盐复合物法 其它方法
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沉淀操作的基本步骤
待处理溶液 加入沉淀剂 沉淀物的陈化（沉淀析出）
离心或过滤
收集沉淀
收集上清
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一
金属盐沉淀法
原理： 利用金属离子与酸根在形成盐类时溶 解度低而进行的分离操作。
柠檬酸工业生产
柠檬酸有温和爽快的酸味，普遍用于各种饮料、汽水、葡萄 酒、糖果、点心、饼干、罐头果汁、乳制品等食品的制造。 柠檬酸属于果酸的一种，主要作用是加快角质更新，常用于乳 液、乳霜、洗发精、美白用品、抗老化用品、青春痘用品等。
外加酶制剂或自溶法 （1） 释放出克隆的胞内蛋白
（2） 制取特殊的壁葡聚糖聚合物
（3） 与机械细胞破碎法协同使用 （4） 从细胞内不同位置选择性地释放产物
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一、沉淀技术概述
沉淀 precipitation 是利用沉淀剂使目标产物或杂质在溶液中 的溶解度降低而形成无定形固体凝聚物 （aggregates）的过程。
化工、纺织
医药
环保
禽畜生产
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22
沉淀法从发酵液中提取柠檬酸 中和
2C6H8O7•H2O+3CaCO3------Ca3(C6H5O7)2•4H2O+3CO2+H2O
酸解
Ca3(C6H5O7)2•4H2O+3H2SO4+H2O -----2C6H8O7•H2O+3CaSO4•H2O
谷氨酸
锌盐法 谷氨酸+Zn+
• 沉淀操作常在发酵液经离心或过滤除去不溶
性杂质及细胞碎片以后进行，得到的沉淀物 可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透 析、超滤、层析或结晶等。
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沉淀技术的特点
• 沉淀过程中析出的固相成分较复杂：除含有目标分子外，
还夹杂共存的杂质、盐和溶剂。沉淀属于粗分离操作。
• 沉淀技术具有简单、经济和浓缩倍数高的优点。 • 沉淀分离具有选择性，可以有选择地沉淀杂质或目标产
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(3)干燥破碎 干燥破碎可采用空气干燥、真空干燥、喷雾 干燥和冷冻干燥等。 干燥过程能使细胞膜渗透性改变，再用丙酮、 丁醇或缓冲液等处理时，胞内物质就容易被抽 提出来。
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3 化学破碎法
原理：化学试剂改变或破坏细胞壁膜结构 常用试剂：碱液、有机溶剂、表面活性剂 有鲜明的优缺点
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4 酶学破碎法