紫外分光光度法的原理

3.检查含量（纯度）:如药典规定VB12的E1%max， 361nm，1cm=207，上述VB12注射液原标示浓度为 0.05%，求实际浓度，方法：药液用重蒸水精确 稀释20倍，水做参比，用361nm测定的吸光度 为0.512，其含量为：1%∶207=x%∶0.512 ， x%=0.00247%，浓度= 0.00247%×20=0.049% 4.应用摩尔吸光系数测定浓度:一般的比色分析 中都有标准品，未知样品都是通过和标准溶液 对比分析含量。某些情况下，没有标准品，可 以用摩尔吸光系数或百分吸光系数进行测定， 直接测定溶液的吸光度，通过和该纯物质的吸
光系数比较，可以计算出浓度。这样的分析需 要经过精确校正了波长的分光光度计，紫外分 光光度计的波长一般精确到2nm，可以承担这 样的分析。如果知道分子量的话，百分吸光系 数和摩尔吸光系数之间可以互相换算，换算公 式是：百分吸光系数=10×摩尔吸光系数÷物 质的分子量。 比如血红蛋白是4个亚基组成的蛋白质，单个 亚基的平均分子量是16114.5。每个亚基都在高 铁氰化钾[K3Fe(CN)6]和氰化钾[KCN]溶液中形 成单体氰化高铁血红蛋白（HiCN），它的特征
硒-邻苯二胺络合物的吸收光谱特征吸收峰332.5nm
氧化钬的吸收光谱
二. 郎伯-比尔定律：当一束单色入射光[ I0]通过 厚度为L、浓度为C的有色溶液后，所透过光的 强度[ I1 ]与溶液厚度L及浓度C成负指数乘积的 L· C 如果物质在溶液中的浓度 关系：I1=I0· 10－K· 和显色强度成正比，则可以应用郎伯-比尔定律 通过比色方法从显色强度求浓度，这是比色分 析的原理。 入射光强度I0 透过光强度I1
样条件下测定，用百分吸光系数同样可以换算。 5. 紫外吸收光谱在某种程度上反映了化合物的 性质和结构，所以可以用于有机化合物的定性 和结构分析。利用标准样品或标准图谱可以对 未知化合物进行鉴定，即控制相同的测量条件， 将未知化合物的吸收光谱与标准品或标准图谱 进行对照，如果两者吸收光谱的形状、吸收峰 的数目、位置、最大吸收波长及吸光强度完全 一致，则可说明它们分子结构中存在相同的生 色基团，初步确定它们是同一种物质，如咖啡 因的定性。
该式说明溶液的吸光度和浓度 C、厚度L之间皆 成正比关系。当厚度一定时，溶液的浓度增加， 则吸光度成正比地增加，这就是比色分析的依 据。实际使用中，溶液的厚度就是比色杯的厚 度，它是相对固定的，有0.5、1 、2 、 4cm 的比 色杯，使用最多的是1cm的比色杯。 比色分析中有时也用透光度做单位，根据透 光度的负对数－ IogT= 吸光度，透光率为 100% 时，吸光度 = － Iog1=0 ，而透光率为 1% 时，吸 光度=－Iog0.01=2，二者间呈对数指数关系。 当然，只有溶液的浓度和吸光度之间成直线
强度研究化合物的结构和测定其含量，称为光 谱分析法，这也是比色分析的原理。根据发射 光谱分析的如火焰发射光谱法（又称火焰光度 法，分析钠、钾、钙），荧光光度和荧光分光 光度法（根据荧光的发射强度进行分析）。 根据吸收光谱分析的方法又称吸光光度法， 如应用可见光的吸收光谱进行分析的普通的分 光光度计和分光光度法；用紫外光的吸收光谱 进行分析的叫紫外分光光度计和紫外分光光度 法；用原子的吸收光谱进行分析的方法叫原子 吸收分光光度计和原子吸收分光光度法。
由于大多数有机化合物的紫外光谱比较简单， 缺乏精细的结构特征，而且很多生色团的吸收 峰几乎不受分子中其它非吸收基团的影响，因 此，仅根据紫外光谱鉴定有机化合物有很大局 限，一般必须与红外光谱、质谱、核磁共振波 谱等相配合，才能进行精确的鉴定。 6. 溶剂对紫外光谱的影响：在测定有机物的 紫外可见吸收光谱时，在溶解度容许范围内， 应尽量选择非极性溶剂或极性较小的溶剂（烷、 烯烃，如正己烷、正庚烷），以获得吸收光谱 的精细结构。与标准样品或标准图谱进行对比
第七章 紫外分光光度法的原理和应用
一. 比色分析的原理：光是一种电磁波，它 的波长用nm或Ǻ为单位，人的眼睛所能感觉到 的光波长约400～760 nm，这之间的光波称为可 见光。短于400 nm的叫紫外线，短于200nm的 叫远紫外线，再短的就是X射线和γ射线了。长 于760nm的叫红外线，红外线可长达5mm，再 长的就是无线电波了。 普通的日光、白炽灯光称为发射光，将这种 日光或白炽光通过棱镜可以分解为红、橙、黄、
可见光、紫外、荧光分析都要求溶液必须透 明，否则引起对光的吸收，影响分析的准确度。 对特殊的均匀的浑浊液也可以进行比色分析,称 为比浊法，比如应用于红细胞计数、细菌计数 的比浊测定。 光线通过透明的溶液时，还有少量的光线在 玻璃、溶液的表面被反射或散射，影响到吸光 度，所以要用一个空白管进行校正，除去反射、 光、散射光、试剂中杂质、非反应物的影响， 即用空白试剂溶液进行调零的原因。普通玻璃 对紫外线也有吸收，所以在普通分光光度计上
吸光度进行比较，可直接求出样品含量。如VB12 含量测定：精确吸VB12注射液Vml，加重蒸水稀 释n倍，使每含的标示量为30μg/ml，另外配 VB12标准液浓度为30μg/ml，蒸馏水调零，用 361nm测定吸光度A，计算：测定液中VB12含量 （μg/ml）=（A样品/A标准品）×30；注射液中 VB12含量（μg/ml）=（A样品/A标准品）×30 ×n （稀释倍数）÷V（取样量,ml） 2.混合物中两物质同时测定（两物质的最大吸 收峰有部分重合） 例四环素和金霉素混合物的测定：四环素在0.25
时，必须用相同的溶剂。所选择的溶剂在所研 究的光谱区域内应该没有明显的吸收；并且不 含有其它干扰物质；与溶质没有相互作用。否 则会使光谱线产生移动，低于此波长时，溶剂 的吸收不可忽略。
常用溶剂的波长范围如下： . 溶剂 使用波长范围 溶剂 使用波长范围 甲醇 >210 二氯甲烷 >235 . 乙醇 >215 氯仿 >245 . 水 >210 乙酸乙酯 >260 . 96%硫酸 >210 苯 >280 . 乙醚 >215 甲苯 >285 .
波长或最大吸收波长，表示为Emol~nm,max,1cm或 E%~nm，max，1cm。许多物质的吸光系数在书或资料 中可以查到，如药典规定VB12应该有278±1 nm、 361±1nm、550±2nm 3个吸收峰，其E1%361nm， 1cm=207。实际工作中，1mol/L的浓度太高，可 以配成1mmol/L或1μmol/L的浓度，相应地写成 Emmol（μmol）~nm，max，1cm。根据吸光系数的特性 ，它有3项用途： 1.可作为物质定性的参考：被测物质的光谱 特性和标准物如果一致，可粗略定性。如检查 VB12注射液是否变质，测定其光谱，结果为279
溶液厚度L（比色杯直径）
L· C 移项成： I /I =10 － K· L· C 式中 K 为常 I1=I0· 10 － K· 1 0 数，可因物质的吸光特性和采用单色光的波长 不同而有所不同，与溶液的厚度和浓度无关。 上式写成以10为底的对数，Iog(I1/I0)=－K· L· C， 再 以 透 光 度 T=I1/I0 时 ， 则 上 式 成 为 IogT= － K· L· C 或者－IogT=K· L· C 。 I1/I0 称为透光度或透 光率，表示透过光强度是入射光强度的百分之 几，其数值只能＜ 1 ，从 0~100% 。为了方便起 见，经常用透光度的负对数－ IogT 来表示溶液 吸收光线的情况，并称为吸光度(ABS)、消光度 (E)、或光密度(OD或D)，这样，ABS= K· L· C
2.检查纯度：紫外光谱法检查纯度是一种简 便有效的方法，用于许多化合物检测。如阿司 匹林在空气中容易吸收水分产生水杨酸，阿司 匹林在280nm处有强吸收峰，而水杨酸的吸收 峰迁移到312nm，只要检测在312nm处是否有吸 收峰，即可判断有无水杨酸。再如无水乙醇精 制过程中要用苯，测定无水乙醇中是否残留苯 ，测定其吸收光谱，乙醇在210 ~600nm之间无 吸收峰，而苯在250、254 nm有吸收峰，以纯无 水乙醇为参比，对样品进行光谱分析，如果在 250、254nm处出现吸收峰，则说明有苯残留。
±0、361.5±0、550.7±0.3nm3个吸收峰，完全 一致，可以判定该物质为VB12（未变质）。 一些苯衍生物的紫外光谱特征如下 ： 化合物 溶剂 吸收峰 吸收峰 吸收峰 Emolmax，1cm 苯 碳氢化合物254nm 250 204 8800 甲苯 碳氢化合物262 260 208 7900 六甲基苯 碳氢化合物 271 230 221 10000 氯苯 碳氢化合物 267 200 210 7400 苯酚 碳氢化合物 271 1260 213 6200 .
（三）作为光度计使用：有色的反应液可以用 普通的分光光度计（721、722、浓度计），也 可以用紫外分光光度计比色。某些溶液、反应 液无色，在200～400nm之间有特征性光吸收,就 只能用紫外分光光度计。 1.单一物质测定：先测定溶质的吸收光谱，一 般用最大吸收波长进行比色。常用方法有2种。 （1）标准曲线法：用标准液制作一系列标准管 的标准曲线，样品测定结果查标准曲线求知。 （2）对照管法：制作标准测定管和样品测定管， 在特征吸收峰（或最大吸收峰）处测定吸
正比关系时才能进行比色分析，如果溶液的吸 光度与浓度不成正比（不符合郎伯-比尔定律）， 则不能使用比色分析。有时，溶液的浓度只在 一定范围内和显色成直线正比关系，而浓度超 过一定限度时，失去正比关系，则不能一概地 用比色结果换算，通常都要研究测定方法中什 么浓度范围内二者成直线正比关系；或者绘制 一系列浓度和吸光度之间的标准曲线，发现浓 度增加到一定限度，标准曲线发生弯曲、变折， 说明超过该浓度时，要对溶液进行稀释才能用 来比色分析。
绿、蓝、青、紫等组成的光谱，称为发射光谱。 如果在白炽灯光与棱镜之间放一个有色溶液的 玻璃皿，则通过棱镜后的光谱上会出现一处或 几处暗带，这种带有暗带的光谱称为该有色溶 液的吸收光谱，吸收光谱显示该溶液对光的选 择性吸收的特性。溶液所呈现的颜色是它的吸 收光谱中透过最多、吸收最少的那部分波长光 线的颜色，而暗带部分则是它透过最少、吸收 最多的那部分波长光线的颜色。 不同分子的原子团和原子，它的发射光谱和 吸收光谱不同。因此可以根据其光谱的特征和
使用普通玻璃比色杯，而在紫外分光光度计上 必须用对紫外线无吸收的石英玻璃比色杯。 三. 可见—紫外分光光度计的应用 （一）光谱分析：有时候需要研究某物质在某 溶剂中的光谱特性，如Vc的乙酸溶液在252.0 nm和237.5nm处有吸收波峰。 大多数情况下，比色分析都提供了使用光的 波长（一般是最大吸收峰波长）。如果没有提 供使用波长的话，可以用紫外分光光度计从 200～1000nm范围内扫描吸收光谱，搜索到吸 收峰，再用吸收峰波长来比色分析。
咖啡因样品用紫外光谱ຫໍສະໝຸດ Baidu性和定量，上：标准 品；下：样品
（二）吸光系数：郎伯-比尔定律中的K称为吸 光系数。因比色杯的直径用cm为单位，因此K 的单位决定于浓度c用什么单位，如c以mol/L为 单位时K称为摩尔吸光系数，用Emol或εmol表示； 如果物质的分子量未知，浓度可用%为单位，K 称为百分吸光系数，用E%表示。 E的定义是：某波长光通过1cm杯、1mol/L或 1%浓度的某溶液时，该溶液对该波长光的吸光 度。E在特定波长、1mol/L或1%浓度、特定溶 剂条件下是该物质的一个特征常数，反映该物 质的吸光能力，资料和测定时都要标明其特征
（最大）吸收峰在540nm处，摩尔吸光系数是 11000，表示为Emolmax,540nm,HiCN=11000。 测定样品在同样条件下的吸光度，就可以计算 出含量。如：将血液0.02ml加入到5.0ml氰化高 铁试剂中，用540nm测定的吸光度为0.35，求血 液中Hb的含量(g/L)。第一步，计算血液稀释倍 数：5.02÷0.02=251（倍）；第二步，计算： 1mol∶11000=x mol∶0.35，x=0.35÷11000 mol/L，乘以分子量和稀释倍数变为g， x=0.35÷11000×16114.5× 251=128.7（g/L）。 如果有些物质不知分子量，用它的1%溶液在同