组培工作中影响植物生根因素的探究

毕业论文

（2012届）

题目：组培工作中影响植物生根因素的探究学生姓名杜万双李仕椿李荣彭俊杰

代剑楠李鑫

所在学院重庆工贸职业技术学院

专业：生物制药

指导老师：熊竹

2011年11月

组培工作中影响植物生根因素的探究

专业：生物制药技术指导教师熊竹

（重庆工贸职业技术学院生物化学工程系09级制药）

摘要：实验以两种青属植物品种的腋芽为外植体，研究不同外源激素以及光质对青属植物离体生根快繁的影响，为组培行业对大批量植物快速培养提供了基础数据。实验采用的是单因素法，即分析每个试样以及所对应的外激素含量，光质对生根速度和质量的影响。过程中做了大量对照实验，根部还原糖的测定，生根情况的对照，并做了相应的分析，结果表明：光对对愈伤组织诱导、分化的作用不明显，生长调节物质对愈伤组织诱导、分化的作用十分显著，青属植物试管苗生根培养基为1／2MS+6一BA 0．1 mol/ L+IBA0.2mol/L+NAA 1.0 mol/L ，繁殖情况最好，平均生根率达76.8％。

关键词：组织培养；外源激素；光质；还原糖测定；

Tissue culture of plant root on factors of influence

Major: Biopharmaceutical Technology Supervisor:xiongzhu (chongqing industry&trade vocational technical college of biolog ical chemistry engineering09 level pharmaceutical)

Abstract: t Experiment with two green plants varieties of axillary buds as the explants, different light quality on the study of exogenous hormones and green plants in vitro rooting of tissue culture rapid propagation effect, industry of large quantities of plant rapid culture provides basic data. Experiment is the single factor method, namely the analysis of each specimen and the corresponding external hormone content, quality on rooting rate and mass effect. In the process to do a large number of control experiment, the root for

determination of reducing sugar, rooting condition control, and the corresponding analysis, the results show that: the light on callus induction, differentiation and the effect is not apparent, growth regulating substances on callus induction, differentiation of the role is very significant, green is a genus of rooting medium for tube seedling for the1 / 2MS+6BA0.1 mol/ L+IBA0.2mol/L+NAA 1mol/L, multiply situation best, average rooting rate was 83.33%,.

Keywords:Tissue culture; exogenous hormone; light quality; Determination of reducing sugar;

植物组织培养是20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术。它是在人工配制的培养基上，于无菌状态下培养植物器官、组织、细胞、原生质体等材料的方法。植物细胞的全能性是植物组织培养的理论基础。20世纪初，曾有人提出能否将植物的薄壁细胞培养成完整植株？研究者从胡萝卜根的韧皮部取下一块组织，并在液体培养基中培养，使其分化出了愈伤组织，从愈伤组织又得到胚状体，胚状体转移到固体培养基上继续培养后，获得了完整的胡萝卜试管植株。植物组织培养作为一种有效的技术手段已被广泛应用于生产实践的各个领域。根据植物组织培养技术的应用现状,和植物组织培养在植物学研究、育种学研究的基础地位和在林木花卉育苗产业中的科技支撑与保障作用，我国研究工作者通过对植物组织培养中存在的问题进行分析,结合当前国内外在这一领域的一些范例,提出了我国植物组织培养的发展对策与展望。

园艺植物组培苗工厂化生产能快速将优良品种转化为现实生产力，在遗传育种、种质资源保护、次生代谢物利用上也将有很大的发展潜力。只要选好优良品种，合理布局、节约成本，组培产业将会有蓬勃的发展和广阔的前景。组培行业不仅缩短了生长周期，节约了生产成本，增加就业岗位，使社会和谐、安定、团结。

1 材料和方法

1.1 实验材料

金银花腋芽，栀子花腋芽；MS培养基；6-BA,IBA,NAA;光照培养箱；超净工作台;紫外分光光度计；灭菌锅; 电子天平; 三角瓶；酸度计；蒸馏装置；游标卡尺（直尺）；葡萄糖标液，硫酸铜，酒石酸钠，亚铁氰

化钾，氢氧化钠

1.2 实验步骤及方法

1.2.1MS培养基的配置：

母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1 L。

母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O 分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至6.5左右，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。

MS培养基中还需要加入：萘乙酸(NAA)、6-苄基嘌呤(6-BA)等植物生长调节物质，并且分别配成母液(1 mg/mL)待用。其配制方法是：分别称取这3种物质各10 mg，将2，4-D和NAA用少量(1 mL)无水乙醇预溶，将6-BA用少量(1 mL)的物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100 mL，即得质量浓度为0.1 mg/mL的母液。

表一植物激素种类和浓度

1.2.3腋芽的前处理：

取下金银花和栀子花的腋芽组织，漂洗上面的杂质，将洗好的材料放入75%的酒精中30S，然后放入蒸馏水中漂洗干净后，放在灭菌纱布上沥干；

1.2.4.培养原理与方法：

1.2.5.外源激素的研究：

将灭好菌的培养基放入超净工作台，当培养基降到45℃左右并贴好标签，将处理好的材料按标签所示接种培养基中，做正交实验。放入26℃的光照培养箱中培养7天，观察生根繁殖情况，做记录。

1.2.5.光质的探究：

选正交实验第一组外源激素的配比的培养基，将处理好的金银花，和栀子花腋芽接种到培养基中。分别放入培养箱带有白色LED灯（相当于强光），和没有开白色LED灯(相当于自然光条件下)，以及黑暗条件下中26℃培养7天，观察光生根繁殖情况，做记录。

表三实验结果记录

1.2.3还原糖的测定

1.2.4.1实验原理

还原糖是指含有自由醛基（如葡萄糖）或酮基（如果糖）的单糖和某些二糖（如乳糖和麦芽糖）。在碱性溶液中，还原糖能将Cu2+Hg2+、Fe3+、Ag+等金属离子还原，而糖本身被氧化成糖酸及其他产物。糖类的这种性质常被用于糖的定性和定量测定。

1.2.4.2费林试剂：

1.2.4.2.1试剂的组成

甲液：称取15g硫酸铜（CuSO4.5H2O）及0.05g亚甲基蓝，溶于蒸馏水中

并稀释到1000ml。

乙液：称取50g酒石酸钠及75gNaOH,溶于蒸馏水中，再加入4g亚铁氰化钾【K4Fe(CN)6】，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000Ml,贮存于橡皮塞玻璃瓶中。

0.1%葡萄糖标准溶液：准确称取1.000g经98~100°C干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入1000mL容量瓶中，加入5mL浓HCL(防止微生物生长)，蒸馏水稀释到1000mL.

6moI/LNCI:取250mL浓HCL（35%~38%）用蒸馏水稀释到500mL。

碘-碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100mL蒸馏水中。

费林试剂由甲、乙两种容易组成。甲液含硫酸铜和亚甲基蓝（氧化还原指示剂）；乙液含

氢氧化钠，酒石酸钾钠和亚铁氰化钾。将一定量的甲液和乙液等体积混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀：2NaOH+CuSO4=Cu(OH)2+Na2SO4在碱性溶液中，所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钠反应，生成可溶性的络合物酒石酸钾钠铜：

在加热条件下，用样液滴定，样液中的还原糖于酒石酸钾钠铜反应，酒石酸钾钠铜被还原糖还原，产生红色氧化亚铜沉淀，其反应如下：反应生成的氧化亚铜沉淀；与费林试剂中的亚铁氰化钾（黄血盐）反应生成可溶性复盐，便于观察滴定终点。Cu2O+K4Fe(CN)6+H2OCu2O+ K4Fe(CN)6+H2OK2Cu2Fe(CN)6+2KOH滴定时以亚甲基蓝氧化-还原指示剂。因为亚甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜离子全部被还原后，稍过量的还原糖可使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型的亚甲基蓝，即达滴定终点。根据样液量可计算出还原糖含量。

1.2.4.2.2器材

试管3.0*20cm(*1);移液管5 ml（*1）；烧杯100 ml（*1）；250 ml锥形瓶；调温电炉；滴定管25ml(*1)

1.2.4.2.3操作方法

以样品中还原糖的提取，准确称取1g药渣，放在100ml烧杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加入约40ml蒸馏水，混匀，于50°C恒温水浴中保温20min,不时搅拌，使还原糖侵出混。过滤，将滤液全部收集在50ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。

1.2.4.3样品中总糖的水解及提取

准确称取1g药渣，放在大试管中，加入6mol/LHCI10ml,蒸馏水15ml，在沸水浴中加热0.5h，取出1~2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕。冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6mol/LNaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100ml，过滤去滤液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。

1.2.4.4空白滴定

准确吸取费林试剂甲液和乙液各5.00ml，置于250ml锥形瓶中，蒸馏水10ml。从滴定管滴加约9ml葡萄糖标准溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2s1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。平行操作3次，取其平均值，按以下式计算：

1.2.4.5样品糖的定量测定

（1）样品溶液预测定：吸取费林试剂甲液及乙液各5.00ml，置于250ml 锥形瓶中，加蒸馏水10ml，加热使其在2.min内沸腾，准确沸腾30s,趁热以先快后慢的速度从滴定管中加样品溶液，滴定时要保持溶液呈沸腾状态。待溶液由蓝色变浅时，以每2s1滴的速度滴定，直至溶液的蓝色刚好褪去为终点。记录样品溶液消耗的体积。

（2）样品溶液测定：吸取费林试剂甲液及乙液各5.00ml，置于锥形瓶中，加蒸馏水10ml，加玻璃珠3粒，从滴定管中加入比与测试样品溶液消耗的总体积少1ml的样品溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2s1滴的速度继续滴加样液，直至蓝色刚好褪去为终点。记录消耗样品溶液的总体积。平行操作3次，取其平均值。

3 结论与讨论

3.1.0.不同外源激素对植物生根的影响：

结论：在离体组织培养过程中外源激6-BA：IBA：NAA=1：2：10的配比下，青属植物金银花栀子花生根情况最后，还原糖含量最高。

3.1.1.不同光质对植物生根的影响：

繁殖情况不明显。

3.1.2实验结论：

根据如上的数据，图表可以看出，在离体条件下，外源激素对植株生长分化效果十分显著，而光质效果在短期来看无多大影响。光质对细胞的作用仅是一种诱导作用。光控制的形态建成是一个非常复杂的过程，不仅有光质的影响，还有光强和光周期的影响。光质的效应不是简单的相互叠加，而是相互影响的。在调节植物对光的反应中起关键性用的是光敏色素和隐花素。光质通过这2种受体影响愈伤组织的诱导、分化以及细胞内含物的合成。植株生长分化的环境是复杂多样的，每一种植物都有最适合其自身生长发育的外界环境，单纯研究光对植株的影响没有太大的价值，而必须与其他环境调控因子相结合进行研究。生长调节物质对愈伤组织诱导、分化的作用十分显著，在研究过程中更应把光质与其结合起来。目前光影响作物的很多生理生化机理还不十分清楚，只有从分子水平进行研究才能更好的对各种光质加以利用。

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