绿色荧光蛋白GFP-南开大学

2、试剂与材料 3、仪器及用具
紫外检测仪、超声波细胞粉碎机、垂直 板式电泳系统、半干式蛋白质印迹电转 移系统等。
三、实验原理与方法
（一）质粒的提取、酶切及琼脂糖凝胶电泳检测
质粒 DNA：细菌细胞中小的共价闭合环状双链 DNA。 （1kb～200kb） 共价闭环 DNA ，超螺旋 开环 DNA ，两条链中有一条发生一处或多处断裂 线性 DNA ，两条链在同一处断裂

酶切片断的电泳检测
制备0.8％琼脂糖凝胶板，加入适量的EB。 向酶切管里加入适量溴酚蓝，全部取出点样。

1
7000bp 5500bp 3500bp 2000bp 5400bp
2
3
4
5 1 2 3 4 5 DNA分子量Marker pETH 质粒DNA pETH 质粒DNA经 EcoRI酶切 pETH－GFP质粒 pETH－GFP质粒经 EcoRI酶切
免 疫 学 实 验
南开大学生命科学院
授课教师：白钢、严冰、杨建华
教材：《微生物学实验》杨文博主编
实验76 绿色荧光蛋白（GFP）的转化表达 及免疫印迹检测
实验77 干扰素（IFN）的转化表达 及双抗体夹心法检测
实验76 绿色荧光蛋白（GFP）的转化表达 及免疫印迹检测
本实验以绿色荧光蛋白（ Green fluorescent protein, GFP）为实验材料，通过免疫印迹杂交方 法分析GFP在大肠杆菌中的表达，在分离检测的全
碱裂解法提取质粒DNA的原理
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学
上的差异来分离它们。
在溶菌酶和SDS破壁释放DNA后，在强碱条件下，DNA变 性成单链，当加醋酸钠(NaAc)适当中和pH时，质粒DNA 复性；而Ch-DNA和大分子RNA仍为单链并与蛋白质-SDS 复合物被高盐沉淀，质粒DNA留在溶液中。 再经酚 / 氯仿抽提乙醇沉淀等步骤获得质粒 DNA 。
GFP的发光原理
GFP的开放阅读框架长度约为 740bp，编码238个氨基酸残基。GFP表达后折叠环化， 在氧存在下，由65～67位的氨基酸残基环化，形成发色 基团，无需添加任何酶和底物，在长紫外或蓝光激发下 就能发荧光。
转GFP基因线虫

构成生色基团的3个氨基酸:Ser-dehy-droTyr-Gly
位于第65—67位，生色基团由丝氨酸—脱水酪氨酸— 甘氨酸形成的对羟苯甲基咪唑环酮(4-P-hydroxybene-
5-imidazolinone)构成。
GFP能在不同的细胞内稳定表达，无种属、 组织和位置特异性，对细胞无毒性且检测方法 简单，将其作为报告基因已广泛应用于细胞生 物学和分子生物学领域。
1000bp 500bp
740bp
（二）感受态细胞的制备及转化
转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受
体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它
是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域 的基本实验技术。
对数生长期的细菌（受体细胞）经过一些理化方
法(如电击法、CaCl2 法)的处理后，细胞膜的通
过程中（细胞裂解，电泳，电转移），均可通过
紫外灯清晰地检测到颜色亮丽的绿色荧光蛋白。

绿色荧光蛋白（GFP）
是一种源于水母 ( Aequorea Victoria ) 等
海洋无脊椎动物的蛋白，分子量为 26.9KD ，其 内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时可发 射出清晰可见的绿光荧光，且荧光性质稳定。
§1、用试剂盒提取质粒DNA
接种单菌落于4 mL LB（含Amp）
37 ℃ ，250rpm，过夜
收集菌体于5ml 离心管内
12000rpm，15s，去上清
加入 150ul 溶液I
Vortex，使菌体散开
加入 250ul 溶液II，
缓慢颠倒离心管5－8次，溶液变透明。 RT放置 3－4 min
加入 400ul 溶液III，
透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子 进入的感受态细胞(Competent cells)。
1.熟悉转化表达的过程。 2.掌握免疫印迹的原理、 学习免疫印迹的操作方法。 3.了解免疫印迹的用途。
二、实验材料与用具
1、 菌种
（1） E.coli DH5α(pETH）菌株 （2）E.coli DH5α(pETH-GFP)菌株 （3）E.coli BL21菌株 （4）E.coli BL21 (pETH）菌株 （5）E.coli BL21 (pETH-GFP）菌株
GFP 实验流程图
基因工程技术
超 声 粉 碎 细 胞 、 提 取 表 达 蛋 白
免疫印迹
在 膜 上 进 行 定 性 分 析 及 定 量 检 测
提 取 含 GFP 基 因 的 质 粒
转Fra Baidu bibliotek化 感 受 态 细 胞
诱 导 GFP 表 达
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳
半 干 式 电 转 移
一、实验目的
小心取出离心柱，置于1.5ml离心管上
注意不能沾漂洗液，否则应再离心。
加入 50ul 洗脱液于离心柱底层的膜上，放置1－2min
12000rpm，1min
所得液体即为提取的质粒DNA。 －20℃保存。
酶切反应
每 20ul 酶切体系所需材料 无菌ddH2O 2ul 质粒DNA 15ul 10×Buffer 2ul EcoRI 1ul 总计 20ul 置37℃温箱酶切2hr。
GFP作为报告基因的优点： 1、不需加任何底物，荧光性质稳定。（可保持10min以上） 2、无背景，即在大多数受体细胞内（细菌、植物、动物） 无相似的内源性表达产物。 3、相对分子量小，对目的基因的结构功能没有影响。 （融合蛋白质具有GFP的荧光性质和配体蛋白质的生物功能） 4、其产物表达量能定量检测，检测方法简单便捷。 （紫外检测仪，荧光显微镜，流式细胞仪等） 5、作为荧光靶，可直接用于活体测定。 （可进行活细胞实时定位观察，更能接近自然真实的状态）
缓慢颠倒离心管5－8次，白色絮状物产生。静置3－10min
12000rpm，10min。取上清转入离心柱中，不要吸入沉淀。
将离心柱置于收集管内，静置1－2min
12000rpm，15s，倒弃液体。
加入 700ul 漂洗液
12000rpm，15s，倒弃液体
加入 400ul 漂洗液，
12000rpm，2min。