黄霉素的特性及检测方法
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检测分析
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ
３２
饲料广角 ２００６年第 ９ 期
黄霉素的特性及检测方法
阮 静 刘晓玥 饶宏英
摘 要： 微生物法检测药物效价及高效液相色谱检测 药物的有效含量已成为药品生产企业中通用的分析手段， 两种方法各有所长。微生物检测药物效价能真实直接地体 现药物的生物抗菌能力， 但对鉴别药物组分显得有些力不 从心； 高效液相色谱法却能直观看到药物不同组分的分布 情况， 易于辨别产品的成分间差异。在生产和使用中， 将两 种检测方法合理地结合起来， 必将对药物产品质量控制起 到良好的监控作用。
２ 黄霉素含量检测方法的探讨 由于黄霉素在饲料领域的广泛应用， 对饲料
中黄霉素含量的检测工作也就越发重要， 目前国家 还有相关的检测标准出台。根据多年从事饲料抗 生素检测工作的经验， 加之多年来对黄霉素效价的 检测经验， 分别运用微生物抗生素效价检测法和高 效液相色谱检测法对黄霉素含量进行检测。 ２．１ 微生物检测法 ２．１．１ 原理
黄霉素为磷酸化多糖类抗生素， 其抗菌作用 机理是通过干扰细菌细胞壁结构物质肽聚糖的 生物合成从而抑制细菌繁殖， 黄霉素的促生长原 理可能在它能提高饲料中能量和蛋白质的消化， 能使肠壁变薄， 从而提高营养物质的吸收， 能有
阮 静： 天津正大饲料科技有限公司 刘晓玥、饶宏英： 单位同第一作者。
效地持续肠道菌群的平衡和瘤胃 ｐＨ 值的稳定。 细菌对黄霉素不易产生耐药性， 黄霉素也不容易 与其他抗生素产生交叉耐药性。黄霉素抗菌谱较 窄， 主要对革兰氏阳性菌有效， 且对其他抗生素 耐药的革兰氏阳性菌也有效， 但对革兰氏阴性菌 作用很弱。黄霉素经口投药后几乎不被消化道吸 收， ２４ｈ 后几乎全部由粪便排出。
长， 对于检测的样品中组分异常情况无法监测。 高效液相色谱法适用于检测饲料添加剂原料
和预混合饲料产品。此法可对黄霉素含量低的样 品进行检测。将黄霉素不同组分经过色谱柱的保 留时间不同进行分离， 呈现出 ２．２．４ 图谱的效果。 峰面积最大的组分为默诺霉素 Ａ， 其峰面积为黄 霉素 ５ 个组分峰面积之和的 ５０％以上， 黄霉素组 分 １、组分 ２、组分 ３ 和组分 ４ 峰分别为黄霉素 Ａ 峰相对保留时间的 ０．９、１．１、１．２ 和 １．３。根据一段 时间的检测发现， 不同黄霉素生产厂商生产的黄 霉素各组分分布比例是不完全相同的， 与对照品 中各组分的比例也不相同。由此可见， 高效液相色 谱法可直接鉴别多组分抗生素的组分分布情况， 直接了解多组分抗生素的质量情况， 同时可根据 图谱的特异性鉴别不良组分的干扰情况。
关键词： 黄霉素； 微生物法； 高效液相色谱法
１ 黄霉素的特性 １．１ 理化性质
黄霉素属于磷酸多糖类抗生素， 又名黄磷脂 素 （ Ｆｌａｖｏｐｈｏｓｐｈｌｉｐｏｌ） 、斑 伯 霉 素 （ Ｂａｍｂｅｒｍｙｃｉｎ） 、 默诺霉素（ Ａ Ｍｏｅｎｏｍｙｃｉｎ－ Ａ） 或黄磷脂醇。化学分 子式： Ｃ７０Ｈ１２１Ｎ５ＰＯ４０。
以上所介绍的方法是目前抗生素药物检测 中常用的两种方法。生物检测所需仪器设备简 单， 但要求操作者具备有一定的检测技能和试验 经验， 因为在此类检测方法中所存在的影响因素 较多， 控制其需要一定经验基础。对于高效液相 色谱检测法来讲， 要求实验室具备此类实验所需 的检测设备， 对于具有一定的 ＨＰＬＣ 检测经验的 人员讲， 实验条件操控起来相对较容易， 影响因 素易控制， 实验稳定性较好。由以上的图谱可看 到， 只要将主峰与其他峰分离开， 就可得到满意 的实验结果。
综上所述， 在黄霉素含量检测工作中将两种 方法结合起来十分必要。两种方法相互补充， 为 检测工作提供强有力的帮助。■
综上所述， 在黄霉素含量检测工作中将两种 方法结合起来是十分必要的。两种方法相互补 充， 为我们不存在较大相差， 含量比较见表 １。
表 １ 两种方法检测黄霉素的比较
编号 标示量 微生物法 微生物法相 高效液相色谱法／％ 高效液相色谱
／％ ／％ 对误差 （ 以默诺霉素计算） 法相对误差
ＦＬ０４ ８．００ ８．０７ ０．８７５
８．３５
４．３７５
００１１ ８．００ ８．０７ ０．８７５
８．２４
３．０００
０７６９－ ２ ８．００ ７．９０ １．２５０
８．１９
２．３７５
０７７０－ ２ ４．００ ４．１６ ４．０００
４．３４
８．５００
图 谱 中 分 别 在 １０．６６ｍｉｎ， １１．６５ｍｉｎ， １３．９３ｍｉｎ， １４．７３ｍｉｎ， １５．７５ｍｉｎ 被记录的峰为黄霉素的组分， 其中 １１．６５ｍｉｎ 的峰为黄 霉素组分中的默诺霉素 Ａ。
高效液相色谱仪 Ｗａｔｅｒｓ； 色谱柱： Ｄｉａｎｏｓｉｌ Ｃ１８ ５ｕｍ ２００×４．６ｍｍ； 流动相： 乙腈 ： 甲酸铵 ０．２％ 水溶液 ＝ ４５：５５ （ 用 １０％磷酸调 ｐＨ ４．９） ； 流速： ０．７ｍＬ／ｍｉｎ； 保留时间： １３ｍｉｎ； 进样量： ２０μＬ。 ２．２．３ 样品处理
３ 检测方法的比较 微生物效价检测法（ 以下简称为生测） 主要
适用的检测样品为饲料添加剂原料， 要求有效含 量较高， 不适于微量的检测。生测所体现的是药 物的生物学活性程度， 对于黄霉素来说， 生测所 体现的效价含量是黄霉素产品中所有药物组分 的生物效价之和（ 包括 Ａ、Ｂ１、ＢＡ、Ｃ， 其中 Ａ 为主 要成分） ， 有很强的实用性。但此方法所需时间较
根据 ＡＯＡＣ （ 美国公职分析化学家协会公定 分析方法） 上推荐的一剂量试验设计方法或中华 人民共和国兽药典推荐的二剂量试验设计方法 进行抗生素含量的微生物法检测。 ２．１．２ 试验条件
（ １） 试验菌种： 金黄色葡萄球菌 菌号： ２６００３ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉｎ ａｕｒｅｕｓ。
（ ２） 缓冲溶液： 磷酸缓冲溶液 ｐＨ ６．０８ｇ 磷酸 二氢钾和 ２ｇ 磷酸氢二钾溶解于 １ ０００ｍＬ 蒸馏水。
（ ３） 培养基： 营养琼脂培养基。 （ ４） 培养温度： ３７℃， １８￣２０ ｈ。 ２．１．３ 样品处理 称取适量对照品， 溶于甲醇， 贮存于棕色瓶， 可在 ４℃ 保存 １０ｄ。磷酸缓冲溶液作为稀释液， 稀 释到所需的适当浓度（ 推荐在 ２５￣５０ｍｇ／ｋｇ） 。
饲料广角 ２００６年第 ９ 期
称取适量对照品， 溶于甲醇， 贮存于棕色瓶， 可在 ４℃ 保存 １０ｄ。 磷酸缓冲溶液作为稀释液， 稀 释到所需的适当浓度（ 推荐 １００ｍｇ／ｋｇ） ； 称取适量待 测样品， 溶于 １：１ 甲醇水溶液， 磷酸缓冲溶液作为 稀释液， 稀释到所需的适当浓度（ 推荐 ８０ｍｇ／ｋｇ） 。 ２．２．４ 图谱
饲料添加剂为褐色或暗褐色无定形粉末， 有 特异气味， 溶于水、甲醇、二甲基甲酰胺， 不溶于 苯、氯仿， 无明确熔点， ２００℃分解。 １．２ 来源
１９６５ 年由美国赫司特（ Ｈｏｅｃｈｅｔ） 公司开发， 它是由 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｂａｍｂｅｒｇｉｅｎｓｉｓ 菌发酵而产生 的抗生素。它至少有 ４ 个组分， 有 Ａ、Ｂ１、ＢＡ、Ｃ， 以默诺霉素 Ａ 为主。 １．３ 药理
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检测分析
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ
称取适量待测样品， 溶于 １：１ 甲醇水溶液， 磷 酸缓冲溶液作为稀释液， 稀释到所需的适当浓度 （ 推荐在 ２５￣５０ｍｇ／ｋｇ） 。 ２．２ 高效液相检测法 ２．２．１ 原理
采用反相色谱柱进行分离， 并用紫外检测器 进行检测， 以与预测组分同质的物质作参照物， 根据样品量和参照物的量， 以及预测组分和参比 物的响应信号进行定量的方法— ——（ 外标法） 。 ２．２．２ 试验条件
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ
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饲料广角 ２００６年第 ９ 期
黄霉素的特性及检测方法
阮 静 刘晓玥 饶宏英
摘 要： 微生物法检测药物效价及高效液相色谱检测 药物的有效含量已成为药品生产企业中通用的分析手段， 两种方法各有所长。微生物检测药物效价能真实直接地体 现药物的生物抗菌能力， 但对鉴别药物组分显得有些力不 从心； 高效液相色谱法却能直观看到药物不同组分的分布 情况， 易于辨别产品的成分间差异。在生产和使用中， 将两 种检测方法合理地结合起来， 必将对药物产品质量控制起 到良好的监控作用。
２ 黄霉素含量检测方法的探讨 由于黄霉素在饲料领域的广泛应用， 对饲料
中黄霉素含量的检测工作也就越发重要， 目前国家 还有相关的检测标准出台。根据多年从事饲料抗 生素检测工作的经验， 加之多年来对黄霉素效价的 检测经验， 分别运用微生物抗生素效价检测法和高 效液相色谱检测法对黄霉素含量进行检测。 ２．１ 微生物检测法 ２．１．１ 原理
黄霉素为磷酸化多糖类抗生素， 其抗菌作用 机理是通过干扰细菌细胞壁结构物质肽聚糖的 生物合成从而抑制细菌繁殖， 黄霉素的促生长原 理可能在它能提高饲料中能量和蛋白质的消化， 能使肠壁变薄， 从而提高营养物质的吸收， 能有
阮 静： 天津正大饲料科技有限公司 刘晓玥、饶宏英： 单位同第一作者。
效地持续肠道菌群的平衡和瘤胃 ｐＨ 值的稳定。 细菌对黄霉素不易产生耐药性， 黄霉素也不容易 与其他抗生素产生交叉耐药性。黄霉素抗菌谱较 窄， 主要对革兰氏阳性菌有效， 且对其他抗生素 耐药的革兰氏阳性菌也有效， 但对革兰氏阴性菌 作用很弱。黄霉素经口投药后几乎不被消化道吸 收， ２４ｈ 后几乎全部由粪便排出。
长， 对于检测的样品中组分异常情况无法监测。 高效液相色谱法适用于检测饲料添加剂原料
和预混合饲料产品。此法可对黄霉素含量低的样 品进行检测。将黄霉素不同组分经过色谱柱的保 留时间不同进行分离， 呈现出 ２．２．４ 图谱的效果。 峰面积最大的组分为默诺霉素 Ａ， 其峰面积为黄 霉素 ５ 个组分峰面积之和的 ５０％以上， 黄霉素组 分 １、组分 ２、组分 ３ 和组分 ４ 峰分别为黄霉素 Ａ 峰相对保留时间的 ０．９、１．１、１．２ 和 １．３。根据一段 时间的检测发现， 不同黄霉素生产厂商生产的黄 霉素各组分分布比例是不完全相同的， 与对照品 中各组分的比例也不相同。由此可见， 高效液相色 谱法可直接鉴别多组分抗生素的组分分布情况， 直接了解多组分抗生素的质量情况， 同时可根据 图谱的特异性鉴别不良组分的干扰情况。
关键词： 黄霉素； 微生物法； 高效液相色谱法
１ 黄霉素的特性 １．１ 理化性质
黄霉素属于磷酸多糖类抗生素， 又名黄磷脂 素 （ Ｆｌａｖｏｐｈｏｓｐｈｌｉｐｏｌ） 、斑 伯 霉 素 （ Ｂａｍｂｅｒｍｙｃｉｎ） 、 默诺霉素（ Ａ Ｍｏｅｎｏｍｙｃｉｎ－ Ａ） 或黄磷脂醇。化学分 子式： Ｃ７０Ｈ１２１Ｎ５ＰＯ４０。
以上所介绍的方法是目前抗生素药物检测 中常用的两种方法。生物检测所需仪器设备简 单， 但要求操作者具备有一定的检测技能和试验 经验， 因为在此类检测方法中所存在的影响因素 较多， 控制其需要一定经验基础。对于高效液相 色谱检测法来讲， 要求实验室具备此类实验所需 的检测设备， 对于具有一定的 ＨＰＬＣ 检测经验的 人员讲， 实验条件操控起来相对较容易， 影响因 素易控制， 实验稳定性较好。由以上的图谱可看 到， 只要将主峰与其他峰分离开， 就可得到满意 的实验结果。
综上所述， 在黄霉素含量检测工作中将两种 方法结合起来十分必要。两种方法相互补充， 为 检测工作提供强有力的帮助。■
综上所述， 在黄霉素含量检测工作中将两种 方法结合起来是十分必要的。两种方法相互补 充， 为我们不存在较大相差， 含量比较见表 １。
表 １ 两种方法检测黄霉素的比较
编号 标示量 微生物法 微生物法相 高效液相色谱法／％ 高效液相色谱
／％ ／％ 对误差 （ 以默诺霉素计算） 法相对误差
ＦＬ０４ ８．００ ８．０７ ０．８７５
８．３５
４．３７５
００１１ ８．００ ８．０７ ０．８７５
８．２４
３．０００
０７６９－ ２ ８．００ ７．９０ １．２５０
８．１９
２．３７５
０７７０－ ２ ４．００ ４．１６ ４．０００
４．３４
８．５００
图 谱 中 分 别 在 １０．６６ｍｉｎ， １１．６５ｍｉｎ， １３．９３ｍｉｎ， １４．７３ｍｉｎ， １５．７５ｍｉｎ 被记录的峰为黄霉素的组分， 其中 １１．６５ｍｉｎ 的峰为黄 霉素组分中的默诺霉素 Ａ。
高效液相色谱仪 Ｗａｔｅｒｓ； 色谱柱： Ｄｉａｎｏｓｉｌ Ｃ１８ ５ｕｍ ２００×４．６ｍｍ； 流动相： 乙腈 ： 甲酸铵 ０．２％ 水溶液 ＝ ４５：５５ （ 用 １０％磷酸调 ｐＨ ４．９） ； 流速： ０．７ｍＬ／ｍｉｎ； 保留时间： １３ｍｉｎ； 进样量： ２０μＬ。 ２．２．３ 样品处理
３ 检测方法的比较 微生物效价检测法（ 以下简称为生测） 主要
适用的检测样品为饲料添加剂原料， 要求有效含 量较高， 不适于微量的检测。生测所体现的是药 物的生物学活性程度， 对于黄霉素来说， 生测所 体现的效价含量是黄霉素产品中所有药物组分 的生物效价之和（ 包括 Ａ、Ｂ１、ＢＡ、Ｃ， 其中 Ａ 为主 要成分） ， 有很强的实用性。但此方法所需时间较
根据 ＡＯＡＣ （ 美国公职分析化学家协会公定 分析方法） 上推荐的一剂量试验设计方法或中华 人民共和国兽药典推荐的二剂量试验设计方法 进行抗生素含量的微生物法检测。 ２．１．２ 试验条件
（ １） 试验菌种： 金黄色葡萄球菌 菌号： ２６００３ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉｎ ａｕｒｅｕｓ。
（ ２） 缓冲溶液： 磷酸缓冲溶液 ｐＨ ６．０８ｇ 磷酸 二氢钾和 ２ｇ 磷酸氢二钾溶解于 １ ０００ｍＬ 蒸馏水。
（ ３） 培养基： 营养琼脂培养基。 （ ４） 培养温度： ３７℃， １８￣２０ ｈ。 ２．１．３ 样品处理 称取适量对照品， 溶于甲醇， 贮存于棕色瓶， 可在 ４℃ 保存 １０ｄ。磷酸缓冲溶液作为稀释液， 稀 释到所需的适当浓度（ 推荐在 ２５￣５０ｍｇ／ｋｇ） 。
饲料广角 ２００６年第 ９ 期
称取适量对照品， 溶于甲醇， 贮存于棕色瓶， 可在 ４℃ 保存 １０ｄ。 磷酸缓冲溶液作为稀释液， 稀 释到所需的适当浓度（ 推荐 １００ｍｇ／ｋｇ） ； 称取适量待 测样品， 溶于 １：１ 甲醇水溶液， 磷酸缓冲溶液作为 稀释液， 稀释到所需的适当浓度（ 推荐 ８０ｍｇ／ｋｇ） 。 ２．２．４ 图谱
饲料添加剂为褐色或暗褐色无定形粉末， 有 特异气味， 溶于水、甲醇、二甲基甲酰胺， 不溶于 苯、氯仿， 无明确熔点， ２００℃分解。 １．２ 来源
１９６５ 年由美国赫司特（ Ｈｏｅｃｈｅｔ） 公司开发， 它是由 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｂａｍｂｅｒｇｉｅｎｓｉｓ 菌发酵而产生 的抗生素。它至少有 ４ 个组分， 有 Ａ、Ｂ１、ＢＡ、Ｃ， 以默诺霉素 Ａ 为主。 １．３ 药理
３３
检测分析
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ
称取适量待测样品， 溶于 １：１ 甲醇水溶液， 磷 酸缓冲溶液作为稀释液， 稀释到所需的适当浓度 （ 推荐在 ２５￣５０ｍｇ／ｋｇ） 。 ２．２ 高效液相检测法 ２．２．１ 原理
采用反相色谱柱进行分离， 并用紫外检测器 进行检测， 以与预测组分同质的物质作参照物， 根据样品量和参照物的量， 以及预测组分和参比 物的响应信号进行定量的方法— ——（ 外标法） 。 ２．２．２ 试验条件