代谢组学技术以及在食品安全方面的应用

代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新
近发展起来的一门学科。

可以定义为：是对机体
受到病理刺激或基因修饰而产生的动态的多参数
代谢反应的定量测定[1]。

代谢组学主要研究的是作
为各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物
(MW<1000)。

代谢组学是对基因组学和蛋白质组学
预示的可能变化的真实结果的测定[2]。

代谢组学的
核心思想是强调外源性物质对生物体所产生的整
体性效应，以生物体内某一物质分子整体为研究对象，研究外源物质对机体刺激所产生的代谢物组对机体的系统作用。

其主要是利用核磁共振(NMR)技术和液相色谱质谱(HPLC-MS)连用等检测技术，结合统计分析方法对生物体液和组织进行系统测量和分析，对完整的生物体中随时间变化的代谢物进行动态跟踪检测和分类，然后将这些代谢信息与病理生理过程中的生物学信息相关联，
收稿日期：2008-06-24
基金项目：中科院知识创新重要方向项目(KSCX2-YW-N-035)。

作者简介：王世成(1966—)，男，副研究员，主要从事食品安全的研究工作。

王世成，王颜红，胡小燕，王姗姗
(中国科学院沈阳应用生态研究所，沈阳110016)
摘要：代谢组学的研究目的是定性和定量分析器官及生物样品中特定状态下所有低分子量代谢产物及外源性复合物对人体所有代谢产物的影响。

体液或组织的代谢谱可以作为重要的生理或病理状态的生物标志物。

在食品及其危害物残留对机体的影响可用代谢组学的技术进行全面分析。

主要介绍代谢组学的研究方法和在食品安全方面的应用。

关键词：代谢组学；分析技术；食品安全
中图分类号：TS 207文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2009)03-0122-04
代谢组学技术以及在
食品安全方面的应用
Metabonomics technology and its application in food safety
WANG Shi-cheng,WANG Yan-hong,HU Xiao-yan,WANG Shan-shan
(Institute of Applied Ecology,Chinese Academy of Sciences,Shenyang 110016)
Abstract:Metabonomics is concerned with the measurement of,global sets of low -molecular -weight metabolites.Metabolite profiles of body fluids or tissues can be regarded as important indicators of physiological or pathological states.The current applications for this field are,primarily,toxicological profiling and biomarker studies.The influence of food and toxin residus to organism can global analyse with Metabonomics technology.The purpose of the present review was to highlight some technology methods and its great potential application in food safety.
Key words:Metabonomics;analytical technology;food safety
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期确定发生这些变化的靶器官和作用位点，进而确定相关的生物标志物。

本文主要介绍代谢组学的研究方法和在食品安全方面的应用。

1代谢组学研究工作的主要流程根据生物学问题设计实验方案→收集样品→
制备分析样品→数据获得—原始数据差异峰列表
↓↓→数据处理→数据分析→生物标志物→从生物学角度解释2前期的样品制备2.1HPLC-MS 或MS 方法的样品前处理(1)样品的保存：为了阻止离体后细胞代谢化学反应的发生，一般是将样品迅速低温冷冻，储存于－80℃低温冰箱中或用液氮保存备用。

(2)用高氯酸或硝酸提取：针对核酸类等极性化合物，可采用一定浓度的高氯酸或硝酸提取。

如将样品冻干，冻干粉用6%的高氯酸(15mL/g 干物质)涡旋振荡30s ，放置10min ，离心(10000×g ，10min ，4℃)，用2mol/L K 2CO 3调pH 值7.2，离
心，储存于-80℃用于HPLC 分析[3]。

但此法容易导致一些代谢物氧化分解。

(3)用极性溶剂(甲醇、水)或弱极性溶剂(氯仿)提取，或采用二者的混合溶剂提取。

采用氯仿－甲醇混合溶剂提取，通过离心，使得代谢产物提取至有机相中，根据实验需要，还可将组织体液或组织用甲醇或乙腈除蛋白、庚烷除脂肪及冻干等处理。

例如，磷脂提取：氯仿－甲醇混合溶剂(3∶1)同时将BHT(50μg/mL)抗氧化剂加入含有50mg 组织(液)的离心管中，涡旋振荡提取1min ，加入0.1％的甲酸溶液100mL ，离心2min ，取下层的有机层冻干，-20℃贮存[4](4)采用热醇对微生物代谢物进行提取，得到高通量的样品。

一般情况下，样品不需要进一步分离，但是如果针对某一类目标化合物的分析，可以采用液液萃取、固相萃取、微固相萃取、亲和色谱等精制手段进一步分离净化。

2.2核磁(NMR)测试方法样品的前处理根据要提取成分的极性选择合适试剂将有效成分提取出，将提取液高速离心(10000r/min 以上)以除去固体颗粒不溶物以及大分子蛋白，所得上清液进行NMR 分析。

一般使用氘代试剂(如D 2O 、
CD 3OD 、CCL 3D)进行样品制备，加入缓冲溶液以减
小溶液pH 对化学位移的影响；还需根据所选氘代试剂加入内标(如TMS 、TSP 等)。

也可先用普通试剂提取有效成分后，将提取液冷冻干燥后所得的提取粉末用适当的氘代试剂溶解，所得的溶液用
NMR 分析。

3中期的样品检测、分析、鉴定
样品制备完成后，一般采用色谱-质谱联用(包括HPLC-MS ，GC-MS 等)，NMR ，直接经进样质谱(DIMS)等先进的分析技术对样品进行分析。

(1)HPLC 及HPLC-MS 法：选择色谱条件，包
括流动相，检测器，一般初时条件都选用二极管
检测器，选择不同的检测波长，发现色谱峰的差
异，亦可用高分辨质谱直接分析，进而通过质谱(以Q-TOF 为多见)，确证化合物，同时采用标准品对照的办法加以确证，或通过多级质谱加以确
证，找出生物标识物。

(2)直接进样质谱法(Direct-injection mass spec －trometry(DIMS))：样品提取后直接采用电喷雾离子化方式进样，通过m/z 与响应强度定性确定标志物，一般不能用来定量。

主要用于微生物和植物
代谢组研究，也有用于疾病诊断，药物方面的研究。

应用的质谱主要有：①单极四级杆质谱：可
以通过从低到高调节离子化条件的方式获得源内碰撞实现获得离子碎片，可以快速实现正负离子的转换[8]。

②电喷雾飞行时间质谱(ESI-TOF-MS)：其较单级四极质谱或离子阱质谱有较宽的质量范围和更高的质量准确度。

③混合型的四极杆飞行时间质谱仪(QTOF 或QqTOF)，它结合了2种分析技术的优点，具有显著的特点，质量准确度优于5m g/kg ，其分辨率在200质量数可达到4000，从而能够确定其分子式。

但由于色谱分离的峰叠加导致精度降低，出现了傅里叶变换回旋加速质谱
(FTICR)-MS ，精确度可以达到1mg/kg 。

(3)NMR 法：核磁技术常用于体液(尿液、血液)分析研究。

与MS 技术相比，NMR 技术应用的较为广泛。

以氢谱(1H NMR)为例，只需将准备好的生物标本(包括各种体液或组织提取液)，简单处
理，直接上样检测即可。

根据一定的规则或与标
准氢谱比照可以直接鉴定出代谢物的化学成分，
信号的相对强弱则反映了各成分的相对含量[3]。

根据代谢组学的研究需要，还有其他的一些分析技术，如气相色谱(GC)，高效毛细管电泳
(HPCE)等。

它们往往与NMR 或MS 技术联用，进
一步增加其灵敏性。

Mortuza.G.B.[4]等给小鼠喂食盐酸胺碘酮(amiodarone)(150mg/kg daily)7d，收集血液，肝、肺、淋巴等经氯仿甲醇提取分离，液相分析甲酸水和甲醇梯度洗脱，UV205nm检测，其空白和给药组的色谱见(图1)将色谱进行峰面积积分，将不同的保留时间的峰面积(或归一化的含量)输入到PCA处理软件中经过处理得到空白和加药组的得分散点图(图2)。

经统计处理后，有较多的峰发生了变化(升高或降低)，但更有统计学意义(0.95以上显著的差异)峰为2号峰。

进而对其进行了质谱分析和鉴定。

Williamsa应用HPLC–TOF/MS方法研究了左旋丝氨酸诱导的中毒性肾损伤(250mg/kg，4mL/kg ip，n=3)分别采集了正负离子模式，发现了诱导损伤生物标志物[5]。

4后期的生物信息技术平台
后期获得数据的处理信息技术平台以主成分分析为主，其他包括神经网络分析方法、非线形映射(nonlinear mapping，NLM)、簇类分析(Hierar－chical Cluster Analysis，HCA)等非监督(unsuper vised)学习方法；有监督(supervised)学习方法主要是基于PCA、偏最小二乘法(partial least squares，PLS)、神经网络(neural network，NN)的改进方法，主要有SIMCA(soft independent modeling of class analogy)和偏最小二乘法一显著性分析(PLS-dis－criminant analysis，PLSDA)。

常用的分析软件包括：SIM—CA—P10.0软件包(瑞典，Umetrics AB，UmeA)，The MarkerLynx Application Manager，PCA-PLSDA，Spass等。

5生物标志物的发现和确证
寻找生物标志物是代谢组研究的主要目的之一，首先可根据质谱或核磁数据判断可能的生物标志物，通过测定标志物的高分辨质谱的准分子离子，确定精确分子量，再通过网络或KEGG数据库检索，初步判断生物标示物的成分，通过文献检索加以确认。

对于通过检索未能确定化学结构的生物标志物，可以采用HPLC制备等方法少量制备，再应用FT-MS，或结合核磁(NMR)、红外(IR)、紫外(UV)等手段，确定生物标志物。

6代谢组学在食品及安全方面的应用
代谢组学作为一种新发展起来的技术，已经广泛应用到微生物、植物学、食品学、毒理学和药物学的研究中。

在食品安全方面，发现农兽药等在动植物体内的相关生物标志物将是代谢组学另一个热点研究领域。

通过建立生物标志物与违禁添加的农兽药之间的量效关系，作为指示物为相关预警监督提供一个预知平台。

作为一个重要的研究方向，氨基酸和脂质代谢研究已经在代谢组学定量方面得以应用。

Noguchi等应用基于相关性的分析方法分析某种代谢产物与摄入过量的蛋白质、氨基酸相关，以此确定适量安全的氨基酸摄入量。

进一步研究发现氨基酸代谢谱可以有助于揭示特定生理状态，揭示迄今最为全面的代谢关系[9]。

Hemmati应用HPLC荧光检测技术分析了小鼠脑部的14种氨基酸的含量，并确定了多巴胺拮抗的效果[10]。

另Solanky K S利用代谢组学的研究方法评价健康妇女每天服用一定量的大豆异黄酮前后对血浆脂蛋白、氨基酸和碳水化合物代谢谱的影响，表明摄食大豆可以改变能量代谢[11]。

Watkins SM应用代谢组技术绘制了脂类代谢的生
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物途径，鉴定了应用外源物质处理后代谢成分的变化，研究了膳食脂肪酸的摄入对心磷脂中二十二碳六烯酸(22∶6)和亚麻酸(18∶3)的形成机制[12]。

在食品安全方面，Stanton B 等通过给鸡分别和共同注射雌激素和2,3,7,8-四氯二苯并二恶英(TCDD)，分析了其对鸡肝中脂肪酸的生物合成的影响，阐述了TCDD 对脂肪酸、磷脂及胆固醇含量变化的影响[13]。

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食品科技
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