植物代谢组学的研究方法及其应用

植物代谢组学的研究方法及其应用

近年来，随着生命科学研究的发展，尤其是在完成拟南芥(Arabidopsis thaliana) 和水稻(Oryza sativa) 等植物的基因组测序后，植物生物学发生了翻天覆地的变化。人们已经把目光从基因的测序转移到了基因的功能研究。在研究DNA 的基因组学、mRNA 的转录组学及蛋白质的蛋白组学后，接踵而来的是研究代谢物的代谢组学(Hall et al.，2002)。代谢组学的概念来源于代谢组，代谢组是指某一生物或细胞在一特定生理时期内所有的低分子量代谢产物，代谢组学则是对某一生物或细胞在一特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门新学科(Goodacre，2004)。它是以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以信息建模与系统整合为目标的系统生物学的一个分支。

代谢物是细胞调控过程的终产物，它们的种类和数量变化被视为生物系统对基因或环境变化的最终响应(Fiehn，2002)。植物内源代谢物对植物的生长发育有重要作用(Pichersky and Gang，2000)。植物中代谢物超过20万种，有维持植物生命活动和生长发育所必需的初生代谢物；还有利用初生代谢物生成的与植物抗病和抗逆关系密切的次生代谢物，所以对植物代谢物进行分析是十分必要的。

但是，由于植物代谢物在时间和空间都具有高度的动态性(stitt and Fernie，2003)。尤其是次生代谢物种类繁多、结构迥异，且产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性，难于进行分离分析，所以人们一直在寻找更为强大的检测分析工具。在代谢物分析领域，人们已经提出了目标分析、代谢产物指纹分析、代谢产物轮廓分析和代谢表型分析、代谢组学分析等概念。20世纪90年代初，Sauter 等(1991)首先将代谢组分析引入植物系统诊断，此后关于植物代谢组学的研究逐年增多。随着拟南芥等植物的基因组测序完成以及代谢物分析手段的改进和提高，今后几年进入此研究领域的科学家和研究机构将越来越多。

1研究方法

代谢组学分析流程包括样品制备、代谢物成分分析鉴定和数据分析与解释。由于植物中代谢物的种类繁多，而目前可用的成分检测和数据分析方法又多种多样，所以根据研究对象不同，采用的样品制备、分离鉴定手段及数据分析方法各不相同。

1.1样品制备

植物代谢物样品制备分为组织取样、匀浆、抽提、保存和样品预处理等步骤(Weckwerth and Fiehn，2002)。代谢产物通常用水或有机溶剂(如甲醇和己烷等)分别提取，获得水提取物和有机溶剂提取物，从而把非极性的亲脂相和极性相分开。分析之前，通常先用固相微萃取、固相萃取和亲和色谱等方法进行预处理(邱德有和黄璐琦，2004)。然而植物代谢物千差万别，其中很多物质稍受干扰结构就会发生改变，且对其分析鉴定所采用的设备也不同。目前还没有适合所有代谢物的抽提方法，通常只能根据所要分析的代谢物特性及使用的鉴定手段选择合适的提取方法。而抽提时间、温度、溶剂成分和质量及实验者的技巧等诸多因素也将影响样品制备的水平。

1.2成分分析鉴定

对获得的样品中所有代谢物进行分析鉴定是代谢组学研究的关键步骤，也是最困难和多变的步骤。与原有的各种组学技术只分析特定类型的物质不同，代谢组学分析对象的大小、数量、官能团、挥发性、带电性、电迁移率、极性以及其他物理化学参数差异很大，要对它们进行无偏向的全面分析，单一的分离分析手段往往难以保证。色谱、质谱、核磁共振、红外光谱、库仑分析、紫外吸收、荧光散射、发射性检测和光散射等分离分析手段及其组合都被应用于代谢组学的研究(许国旰和杨军，2003)，一般根据样品的特性和实验目的，可选择最合适的分析方法。目前最常用的分离分析手段是气相色谱和质谱联用(GCMs)、液相色谱和质谱联用(LCMS)、核磁共振(NMR) 以及傅里叶变换红外光谱与质谱联用(FTIRMS)。

1.2.1气相色谱和质谱联用，液相色谱和质谱联用色谱是最常用和有效的分离分析工具，其与质谱的联用则可以完成从成分分离到鉴定的一整套工作。GCMS 和LCMS 可以同时检测出数百种化合物，包括糖类、有机酸、氨基酸、脂肪酸和大量不同的次生代谢物(Taylor et al.，2002；Tolstikov and Fiehn，2002)。GCMS有很好的分离效率且相对较为经济，但需要对样品进行衍生化预处理，这一步骤会耗费额外的时间，甚至引起样品的变化。受此限制。GCMS 无法分析膜脂等热不稳定性的物质和分子量较大的代谢产物。Roessner 等(2000，2001a，2001b)利用GCMS 对马铃薯(Solanum tuberosum 'Desiree') 进行高通量代谢物分析，同时检测到150种化合物，其中77种被鉴定为氨基酸、有机酸或糖。利用GCMS 进行代谢组学研究的代表性工作是Fiehn 等(2000) 的一系列有关植物代谢的研究。他们用GCMS 对模式植物拟南芥的叶子提取物进行了研究，定量分析了326个化合物，并确定了其中部分化合物的结构。

LCMS 中目前应用较广的是高效液相色谱和质谱联用(HPLCMs)。HPLC 与GC 原理相似，但在进样前不需进行衍生化处理，适合那些不稳定、不易衍生化、不易挥发和分子量较大的化合物。HPLCMS 选择性和灵敏度都较好，但分析的时间相对较长，且需依赖纯的参照物。Fiehn (2003)利用HPLCMS 检测笋瓜(Cucurbita maxima 'Gelber Zentner')叶柄和叶片抽提物，检测到了超过400种代谢物，有90种被定性，其中大部分是氦基酸、糖和糖苷。Huhman 和Sumner (2002)在紫花苜蓿(Medicago sativa，Polish V ariety Kleszczewska) 和蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula) 中各鉴定出15个和27个皂角甙，并在紫花苜蓿中找到了2个新的乙二酸皂角甙。

最近，由LCMS 发展而来的毛细管电泳质谱联用技术(CEMS) 也被应用到代谢组学研究中。CEMS 分离样品效率比普通的色谱质谱联用要高得多，更为便利的是其耗时很短，往往在10分钟内就能完成一个样品的分析过程。Tolstikov 等(2003)用CEMs 对拟南芥进行代谢组分析，分离效果远远超过了Fiehn 等用GCMS 进行的先期工作，检测到超过700个不同的色谱峰值，其中包括许多以前未检测到的脂类化合物及次生代谢物。

色谱质谱连用技术是目前植物代谢组学研究中应用最多的方法，它具有分离效率高、灵敏度好及经济实用等优点。但需要解决的主要问题是：大量色谱峰的识别问题以及方法的重现性问题。

1.2.2核磁共振在代谢组学领域，核磁共振最初被用于病理生理学和药理毒理学方面(Nicholson et al.，1999)，但目前也已被广泛用于植物代谢组学研究(Blingly and Douce,2001)，