羟丙基化碱木质素的制备及其对纤维素酶水解的影响

第39卷第2期2019年4月林㊀产㊀化㊀学㊀与㊀工㊀业Chemistry and Industry of Forest Products Vol.39No.2Apr.2019doi:10.3969/j.issn.0253-2417.2019.02.016

羟丙基化碱木质素的制备及其对纤维素

酶水解的影响

㊀㊀收稿日期:2018-11-02㊀㊀基金项目:云南省农业基础研究联合专项(2017FG001(-025));国家自然科学基金资助项目(31760194)㊀㊀

作者简介:赵存异(1993 ㊀),男,四川广汉人,硕士生,主要从事生物质的转化与利用研究㊀∗通讯作者:杨静,教授,博士生导师,研究领域为生物质的转化与利用;E-mail :kmjingyang@㊂

ZHAO Cunyi㊀㊀赵存异1,应文俊2,史正军1,2,杨海艳1,2,郑志锋1,杨静1,2

∗(1.西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室,西南林业大学,云南昆明650224;

2.西南林业大学化学工程学院,云南昆明650224)摘㊀要:以碱木质素(AL )为原料制备羟丙基化碱木质素(HL ),研究HL 对纤维素酶的非生产性吸

附性能的影响机制,并进一步探讨其对纤维素的酶水解得率的影响㊂Zeta 电位滴定㊁X 射线光电子

能谱以及疏水性的测试结果表明:AL 经过羟丙基化改性后表面特性发生改变,表面负电荷增加

(Zeta 电位由+35.0mV 降至-44.8mV );表面元素分布及化学键组成发生了较大的变化,C O 和O C O 键强度增加,疏水性减弱(疏水度由106.60L /g 减小为4.30L /g ),使得木质纤维素底物对纤维素酶的非生产性吸附减弱,进而显著提高纤维素酶水解效率㊂以10U /g 纤维素酶水解0.4g /L 微晶纤维素72h ,添加4g /L 的HL 时游离酶蛋白质量分数为11.65%,相比4g /L 的AL 提高152%;添加4g /L 的HL 时酶水解得率为54.38%,相比4g /L 的AL 提高32.09%㊂关键词:碱木质素;羟丙基化改性;表面特性;纤维素酶水解

中图分类号:TQ35㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀文献标识码:A㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀文章编号:0253-2417(2019)02-0109-06引文格式:赵存异,应文俊,史正军,等.羟丙基化碱木质素的制备及其对纤维素酶水解的影响[J ].林产化学与工业,2019,39(2):109-114.

Preparation of Hydroxypropylated Alkali Lignin and Its Effect on Hydrolysis Efficiency of Cellulase ZHAO Cunyi 1,YING Wenjun 2,SHI Zhengjun 1,2,YANG Haiyan 1,2,ZHENG Zhifeng 1,YANG Jing 1,2

(1.Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Utilisation in the Southwest Mountains of China,Ministry of Education,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China;2.College of Chemical Engineering,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)

Abstract :Alkali lignin (AL)was modified by hydroxypropylationto obtain hydroxypropylated lignin (HL),and its effects on enzymatic hydrolysis and non-productive enzyme adsorption were further investigated.The results of Zeta potentials,X-ray photoelectron spectroscopy and hydrophobicity tests indicated that the surface charaoteristics of AL changed after hydroxypropylation.The surface negative charge increased and the surface elements distribution and chemical bonds composition changed greatly.The proportion of C O and C C O bond increased,as well as the hydrophobicity decreased,resulting in the reducing of non-productive adsorption of cellulase onto HL,which significantly increased the enzymatic hydrolysis pared with these of Avicel with AL,the free enzyme protein of Avicel with 4g /L HL increased by 152%and the 72h hydrolysis yield of glucose increased by 32.09%.Key word :alkali lignin;hydroxypropyl modification;surface properties;enzymatic hydrolysis

在木质纤维素生物炼制燃料乙醇及糖平台化合物的过程中,纤维素酶水解效率和成本是制约其产

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业化的瓶颈问题之一㊂在酶水解过程中,底物中残余的木质素能够不可逆的吸附纤维素酶,造成纤维素酶的活性降低和纤维素酶水解效率的降低[1]㊂虽然增加纤维素酶用量,在一定程度上可以弥补因非生产性吸附而带来的损失,提高水解效率和糖得率,但酶水解成本增加,经济上不可行㊂因此,如何减少水解过程中木质素对纤维素酶的非生产性吸附,从而提高可发酵糖得率和降低酶水解的生产成本是木质纤维素制备乙醇过程中亟待解决的问题之一㊂木质素与纤维素酶之间的不可逆吸附作用主要包括疏水作用㊁氢键结合以及静电作用[2-4]㊂应文俊等[5]研究发现,碱木质素经过聚乙氧基接枝共聚后,纤维素酶与改性后木质素间的不可逆吸附减少,72h葡萄糖得率较原料(碱木质素)增加了41.14%㊂朱杨苏[6]在酶水解体系中加入0.3g/g的磺酸盐木质素,当pH值为5.4时,可发酵糖的转化率为83.5%,这是由于pH值的提高使木质素与纤维素酶之间的静电排斥作用增强,最终减少纤维素酶与木质素之间的无效吸附㊂本研究通过对碱木质素进行羟丙基化改性,探讨其表面元素和官能团分布㊁亲水性及电负性等表面特性的变化,并且考察其对纤维素酶的非生产性吸附,以及纤维素酶水解效率的影响,以期为建立一种高效的木质纤维素生物质预处理工艺和模式提供理论依据㊂

1㊀材料与方法

1.1㊀实验材料

碱木质素(AL),购于上海源叶生物科技有限公司,木质素质量分数91.93%,葡聚糖质量分数0.08%,木聚糖质量分数0.04%;微晶纤维素Avicel和纤维素酶C2730,购于Sigma公司;纤维素酶UTA-8,购于湖南尤特尔生化有限公司㊂其中,纤维素酶C2730用于纤维素酶吸附,β-葡萄糖苷酶酶活为27U/mL,滤纸酶活为120U/mL;纤维素酶UTA-8用于纤维素水解,β-葡萄糖苷酶酶活为71.54U/mL,滤纸酶活为100U/mL㊂

1.2㊀实验方法

1.2.1㊀羟丙基化碱木质素(HL)的制备㊀称取18.9g碱木质素㊁21.21g环氧丙烷㊁2.06g无水甘油㊁0.25g氢氧化钾和16.8g丙酮装入高压反应釜,于150ħ反应2h㊂反应结束后将反应釜冷却至室温,固液分离;上清液于60ħ下旋转蒸发除去丙酮和未反应的环氧丙烷,即可得到羟丙基化碱木质素(HL)㊂1.2.2㊀纤维素酶水解㊀以微晶纤维素为底物(质量分数2%),分别加入4g/L AL以及不同质量浓度的HL进行纤维素酶水解反应,纤维素酶用量10U/g(以葡聚糖质量计),调节水解液pH值至4.8,于50ħ㊁150r/min的摇床中水解72h㊂水解结束后,样品经过离心(10min,5000r/min)后,取上清液1mL经0.22μm的滤膜过滤后,测定上清液中的糖组分和游离酶含量㊂

1.2.3㊀HL对纤维素酶的吸附㊀将0.1g微晶纤维素及不同的木质素样品与不同浓度的纤维素酶液混合,于150r/min㊁4ħ的条件下反应3h㊂反应结束后,取上清液于波长595nm处测定吸光值㊂

1.3㊀HL的表面特性

1.3.1㊀红外光谱(FT-IR)分析㊀用傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet iS50型,美国Thermo公司)分析AL和HL的红外光谱㊂扫描范围500~4000cm-1,扫描次数32次,分辨率2cm-1,于投射模式下采集数据㊂1.3.2㊀Zeta电位滴定㊀使用马尔文电位及粒度测量仪(Malvern Zetasizer Nano ZS,英国马尔文仪器有限公司),在(22ʃ1)ħ和pH值4.8的条件下测定木质素样品的Zeta电位5次,取其平均值㊂

1.3.3㊀X射线光电子能谱(XPS)分析㊀采用X射线光电子能谱(XPS,Thermo Scientific Escalab250Xi,美国赛默飞世尔科技公司)来分析各木质素样品的表面元素及官能团组成㊂具体测试条件为:测试管压15kV㊁测试管电流10mA,测试光斑面积500μm2,测试能量1486.8eV,分析室本底真空度2ˑ10-4mPa,辐射源Al Kα源㊂

1.3.4㊀疏水性测定㊀采用Rose Bengal[7]法测定样品疏水性,木质素样品(5㊁10㊁15㊁20㊁25mg)与3mL 玫瑰红溶液(40mg/L)于50ħ㊁150r/min下吸附2h㊂用紫外可见分光光度计于543nm处测定上清液吸光度,计算上清液中残留的染料质量和木质素吸附的染料质量㊂以被吸附染料质量与残余染料质量之比(分割熵,PQ)为纵坐标,样品质量浓度为横坐标通过线性拟合绘制曲线,其中,曲线斜率即为样品