第8章(下)-分子生物学基本研究法

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步骤：
（1）选择特定的限制内切酶分离转录产物中这些 代表基因特异性的9-10个碱基的核苷酸序列并制
成标签。
（2）将这些标签连接在一起、克隆和测序。
（3）根据其占总标签的比例即可分析其对应编码 基因的表达频率。（图P194）
AE？TE？双标签？如何分离3’端酶切片段？
Ti质粒：是根癌农杆菌染色体外的物质，为双股共价闭 合的环状DNA分子。
报告基因：是一种编码可被检测的蛋白或酶的基因，是 一个表达产物非常容易被鉴定的基因。
利用农杆菌T-DNA介导转化，将一段带有报 告基因的DNA序列整合到基因组DNA上，如插入 目的基因内部或附近，就会影响基因的表达，从 而使基因失活。
靶（gene targeting）。这种技术是通过基因工程 的方法将一个结构已知但功能未知的基因去除， 或用其他序列相近的基因取代（又称基因敲 入），然后从整体上观察实验动物，从而推测相 应基因的功能。这种人为地把实验动物某一种有 功能的基因完全缺失的技术称为基因敲除技术。
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酵母双杂交由Fields在1989 年提出。其产生是 基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子 GAL4性质的研究。
GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构 域. 位于N 端1-174 位氨基酸残基区段的DNA 结合域(DNA binding domain，BD)和位于C 端 768-881位氨基酸残基区段的转录激活域 (Activation domain,AD)。
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Cre-loxP 重组系统进行条件性基因剔除的程序：
构建打靶载体
同源重组
体外培养
显微注射 筛选中靶ES
杂交删除neor基因
特定阶段诱导Cre酶 切除目的片段
动物观察分析
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需消除靶基因活性时：
通过与带有重组酶基因ES细胞杂交，可 以把两个LoxP位点中间的DNA片段切除， 使靶基因失活。
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荧光原位杂交(FISH)： 对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，用
原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列 结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆 抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。
优点：不需要放射性同位素，实验周期短， 检测灵敏度高。
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胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养 的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术 基础。
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(2)条件型基因敲除
条件型基因剔除是指某一特定细胞类型或细胞 发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。
常用的条件型基因敲除有： 噬菌体的Cre/LoxP系统、Gin/Gix系统 酵母细胞的FLP/FRT系统、R/RS系统
使用引物F2和R2扩增 全长突变DNA片段
PCR4
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3、大引物诱变法
已知序列DNA模板
反向引物 （R1）
正向诱变 引物（M）
退火温度PCR2>PCR1
PCR1产物 双链大引物 退火和野生型基因复性
正向引物（F2） PCR2
全长突变DNA片段
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插入基因包括正向选择标记基因和负向选择标记基 因。
正向选择标记基因neor(新霉素抗性基因)通常被插 入到靶基因功能最关键的外显子中，或通过同源重 组置换靶基因最重要的功能域，以使靶基因彻底失 活。
利用筛选培养基检测是否存在正向选择标记基因， 可以判定打靶载体是否整合到细胞的基因组中。
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负向选择标记基因HSV-tk(疱疹病毒胸苷激酶基因)：
如打靶载体是随机整合到细胞基因组上时，HSVtk基因也被整合到基因组上，故细胞就不能在含有
负筛选药物(丙氧鸟苷)的培养基中存活。
疱疹病毒胸苷激酶蛋白可使无毒的丙氧鸟苷 （GANC）转变为毒性的核苷酸，而杀死细胞，因 而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。
原位杂交是分子杂交的一种，是在切片上进 行的，能显微定位 。
可分为：RNA原位杂交和染色体原位杂交。
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RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛 生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织 切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分 子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记 或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定 性定量分析。
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基因敲除技术分为：
完全基因敲除：用同源重组法完全消除细胞或者 动植物个体中的靶基因活性。
条件型基因敲除：用定位重组系统实现特定时间 和空间的基因敲除。
同源重组：是指发生在非姐妹染色单体之间或 同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或
分子之内的重新组合。
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（1）完全基因敲除策略
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平衡剪接
5′ss
3′ss
类型
5′ss
5′选择性剪接
5′ss
3 ′选择性剪接
5′ss
外显子遗漏 剪接 相互排斥剪接 5′ss
5′ss
3′ss
3′ss 3′ss 3′ss
3′ss
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3、原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）
用标记的核酸探针，经放射自显影（放射性 同位素，如3H、35S、32P）或非放射（如生 物素、地高辛等）检测体系（酶促免疫显色）， 在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行 定位和相对定量研究的一种手段。
外显子插有新霉素 抗性基因 （neor） 作为正选择的标志
疱疹病毒胸苷激 酶(HSV-tk)基因
作为负选择
将重组体导入ES细胞 体外培养
新霉素(G418)和致死核苷类似物(GANC)作双重筛选
存活的ES细胞
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真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重 组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组 DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干 细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载
将标记基因的两侧也连入LoxP序列可在 它影响靶基因转录时，将其删除。
从理论上说，可根据实验需要，设计在 不同发育时期、不同空间任意敲除任何一个 靶基因。
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（3）植物基因敲除技术
T-DNA：是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下 来转移到植物细胞的一段DNA。
定点突变
模板
人工合成一段引物
DNA聚合酶
延伸诱变寡核苷酸引物
细菌转化
筛选引入突变的环状DNA
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2、重叠延伸技术
已知序列DNA模板
反向 引物
正向
反 向
反向
互
诱变 补 诱变
正向 引物
引物
引物
R2
FM P RM
F2
产物 1 C 2 产物
R
在重叠区发生退火
PCR3 形成全长双链突变DNA
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Cre重组酶：能介导两个含34bp的LoxP位点 之间的特异性重组，使LoxP位点间序列或 基因被删除。
LoxP位点：是由两个13bp反向重复序列和 中间间隔的8bp序列共同组成，13bp反向重 复序列是Cre酶的结合域。
首先通过同源重组把正向选择标记基 因neo置于靶基因的内含子中，并在靶基因 重要功能域两侧内含子中插入同向的LoxP 位点。 （图见P202）
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BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但 是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的 GAL4转录因子活性并可激活启动子,使启动子下 游基因得到转录.
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Fields 建立了一个双杂交系统，DB与X蛋白融 合，AD与Y蛋白融合，如果X、Y之间形成蛋白蛋白复合物，使GAL4 两个结构域重新构成，启 动特异基因序列的转录。 一般地，将DB-X 的融合蛋白称作诱饵(bait),X 往往是已知蛋白，AD-Y 称作猎物(prey),能显示 诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因,通过对 报告基因的检测，反过来可判断诱饵和猎物之间
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基因敲除的意义： ① 研究基因功能 ② 转基因动物的制备 ③ 转基因动物可作为“生物反应器”生产药物
6.3 蛋白质及RNA相互作用技术
1、酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）
蛋白质和蛋白质的相互作用是很多生命现象的 基础.
酵母双杂交(yeast two hybrid) 技术是利用酵母 遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用，该方 法建立以来，经过不断的完善和发展，不但可 以检测已知蛋白质之间的相互作用，更重要的 在于发现新的与已知蛋白相互作用的未知蛋白。
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寡核苷酸介导的DNA突变技术（P198图6-6）
以PCR为基础：重叠延伸技术（P199图6-7）
大引物诱变法（P200图6-8） 以上三种方法虽不同，但原理都一致。
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1、寡聚核苷酸介导的DNA突变技术
已知序列的环状DNA 变性
体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。
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方法
构建载体 同源重组 筛选X被敲除的ES细胞
显微注射
回交得到X被敲除的动物 表型分析
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显微注射命中率较高，技术难度相对大 些。电穿孔法命中率比显微注射低，操 作使用方便。
第六章
分子生物学研究法 （下）
本章主要内容
基因表达研究技术 基因敲除技术 蛋白质及RNA相互作用技术 基因芯片技术 其他分子生物学技术
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6.1 基因表达研究技术
1、基因表达系列分析技术（SAGE） P193 （serial analysis of gene expression）
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SAGE是基因表达定性和定量研究的一种 有效工具，非常适合于比较不同发育状 态或疾病状态的生物基因表达。
另外SAGE能够接近完整地获得基因组表 达信息，能够直接读出任何一种类型细 胞或组织的基因表达信息。
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2. RNA选择性剪接
如打靶载体是通过同源重组整合到靶位点上，
HSV-tk不能被整合到基因组中，细胞得以在含有正
负筛选药物的培养基中存活下来。（图见P203）
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图6-10 正负筛选法（PNS法)筛选已发生同源重组的 细胞
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源自文库 基本原理:
构建与靶基因同源 (10～15kb)的载体
RNA选择性剪接是指用不同的剪接方式（选择不同 的剪切位点组合）从一个mRNA前体产生不同的mRNA 剪接异构体的过程。 mRNA前体的选择性剪接，使一个基因翻译为多种 蛋白质序列，极大地增加了蛋白质的多样性和基因 表达的复杂程度，是基因表达多样性的重要表现形 式。
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人肌糖原磷酸酶 基因在11号染色 体的定位结果。
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4、基因定点突变（site-directed mutagenesis）
技术
通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编 码的氨基酸序列。
常用于研究某个氨基酸残基对蛋白质的结构、 催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于 改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、 引入新的酶切位点等。
是一种以测序为基础定量分析基因组表达模式的技术， 能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信 息。
SAGE的主要依据:
1.一个9～10碱基的短核苷酸序列标签包含有足够的 信息，能够唯一确认一种转录物。
2.如果能将9碱基的标签集中于一个克隆中进行测序， 并将得到的短序列核苷酸顺序以连续的数据形式输入 计算机中进行处理，就能对数以千计的mRNA转录物 进行分析。
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PCR介导的基因定点突变方法的优势？ 1、突变体回收率高。 2、能用双链DNA作为模板，可以在任何
位 点引入突变。
3、可在同一试管中完成所有反应。 4、快速、简便。
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6.2 基因敲除技术 P200
概念： 基因敲除技术（gene knockout)又称基因打