比较蛋白质组学及系统研究方法

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第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法
生物楼五楼509
生物楼五楼511对面
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Thank you !
请老师同学批评指正
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细胞 粘液层 荚膜层
样品的分级处理 可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。 当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按 样品溶解度不同进行分离。
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第二部分：比较蛋白质组学系统研究Байду номын сангаас法
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心 完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。 表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少 一种表面活性剂来溶解疏水基团。。 还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的 Introduction 蛋白质展开更完全，溶解更彻底。
样品的制备及溶解

膜蛋白疏水性强
初步分离 高丰度蛋白、碱性蛋白及大分子量蛋白 灵敏度及可重复性
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第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法
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蛋白质样品的分析
生物质谱分析 ：返回的数据是分子量。可以和已知的蛋白 （数据库）比对，告诉你是什么蛋白。称为Protein Identification by MS。
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质谱结果
A. ferrooxidans 胞外蛋白质斑点的肽指纹图
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第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法
蛋白质质谱检索常用软件
软件名称 软件类型 数据格式
Mascot 商业软件
SEQUEST 商业软件
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第一部分：基本概念
蛋白质的合成受时空等多种因素调控，在不同的组织细胞 中蛋白质合成及表达的种类和数量有很大的差异，即使在 细胞发育的不同阶段，因不同时期、不同条件，蛋白质组 的构成也在不断的变化，是动态的过程
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第一部分：基本概念
蛋白质组(Proteome) 指由一个基因组，或一个细胞、组织表 达的所有蛋白质。 比较蛋白质组学：蛋白质组间差异蛋白的研究。
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第一部分：基本概念
比较蛋白质组学基本技术路线
生物学问 题的提出 实验模型 的设计
感兴趣 蛋白点 的切取
实验组和对照 组样品的制备
蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离 图像扫描和初步分析
第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法
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第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法
ProtParam
蛋白质序列的物理-化学参数 （氨基酸、原子组成，等电点， 消光系数等）
MultiIdent
通过等电点、分子量、氨基酸 组成、序列标签、肽指纹数据 等识别蛋白
蛋白质氨基酸组成与数据库进 行对比分析 通过氨基酸组成识别蛋白质 蛋白质三维构象展示
AACompSim
AACompIdent
3D Protein Display and Sequence Analysis for the PC (UIUC)
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第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法
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验证
1.蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot
▪ 试剂准备 ▪ 样品制备 ▪ 含量测定 ▪ SDS－PAGE电泳 ▪ 转膜 ▪ 免疫反应 ▪ 化学发光 ▪ 凝胶图象分析
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第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法
硫转运膜蛋白质的有效分离和提取
—水浴加热处理 —Triton X-114相分离法提取膜蛋白 —蛋白质沉淀及透析除杂 —真空冷冻干燥
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双向电泳分离膜蛋白
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检索的数据库，可以知道数据库大小 匹配的结果
大于70分即成功鉴定(可靠性达到显著水平) 纵坐标：匹配的蛋白数目
阴影线：区分匹配结果 可靠与不可靠的分界线 小红柱：匹配的结果
横坐标：匹配的蛋白得分
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胰酶对脱色后蛋白质消化
质谱的多肽指纹图、微测序分析
质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现 其它实验 的进一步 验证
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1 2 3
Introduction 蛋白质的提取
蛋白质的分离 蛋白质样品的分析
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验证
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凝胶图像的扫描 图像加工 斑点检测和定量 凝胶配比 数据分析 数据呈递和解释 2-DE数据库的建立 差异蛋白质点的挖取 胶内酶切
Image Master 2d Platinum 图像分析软件可 用于胶的图像分析
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进样系统
•1.气体扩散 •2.直接进样 •3.色谱
离子源
•1.电子轰击 •2.化学电离 •3.场致电离 •4.激光
质量分析器
•1.单聚焦 •2.双聚焦 •3.飞行时间 •4.四极杆
检测器
MALDI-TOF 一级质谱仪，二级质谱，MALDI-TOF-TOF 串联质谱仪， LC-MS/MS 色谱质谱连用
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•
蛋白质的提取
样品制备对于获得可靠、准确的2D电泳结果至关重要
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋 白），且制备方法应具有可重现性。 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化 Introduction 学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白 的可检测性。
N-端测序： 得到的是序列。未知蛋白测序。称为Protein Sequencing 。
比较蛋白质组学主流手段是生物质谱分析 ，价格便宜， 分析速度快。
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质谱分析原理
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XANES光谱：对提取蛋白中硫的形态进行分析， 发现其中含硫氨基酸主要是半胱氨酸，这也进一 步验证了该蛋白中的确富含巯基结构。 其他验证方法 基因敲除 核磁共振，蛋白质结构验 酶活检验 DNA芯片技术 转基因技术 ……
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2.荧光实时定量PCR（Real-time qPCR）
实时荧光定量 PCR 就 是 通过对 PCR 扩增反应 中每一个循环产物荧光信 号的实时检测从而实现对 起始模板定量及定性的分 析。
RT-PCR结果
未知样品的 Ct 值，从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
X!Tandem 免费开源软件 DTA 、PKL、 MGF、mzXML
MGF、DTA、 RAW、 DTA PKL
注：在线检索均为免费
常用的是Mascot
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IPG条重泡涨及上样 第一向：IEF IPG条平衡

平衡缓冲液Ⅰ(还原) 平衡缓冲液Ⅱ(巯烷基化)
第二向：SDS-PAGE
胶条染色及脱色 凝胶成像及图像分析
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凝胶的图像处理分析和差异蛋白质点的挖取及胶内酶切
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双向电泳具体步骤
蛋白预处理（裂解，水化）

蛋白质上样缓冲液的配制：一定量 的 蛋白质样品溶解在 缓冲液含 7 mol/L 尿素， 2 mol/L 硫脲， 4% CHAPS，1% NP-40， 2% IPG 缓冲液，65 mmol/L DTT ，0.002%溴酚蓝
差异蛋白质点的挖取及脱色、胶内酶切
Introduction
元素硫基质中膜蛋白2-DE图谱
亚铁基质中膜蛋白2-DE图谱
选取差异表达的蛋白质点，经过脱色处理后用胰蛋白酶（Trypsin ）进行特异性酶切，最后进行质谱分析得到相关肽指纹图谱
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第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法 目前双向电泳需解决的问题