电化学发光测定原理

电化学发光免疫测定

电化学发光免疫测定

电化学发光反应：电化学发光（electro－chemiluminescence，ECL)是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光两个过程。化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+(图1）和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面同时各失去一个电子发生氧化反应（图2）。二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，后者是一种强氧化剂。TPA 被氧化成阳离子自由基TPA+*（参见图2），后者很不稳定，自发地失去一个质子（H+），形成自由基TPA*，这是一种非常强的还原剂。这两个高反应基团在电极表面迅速反应，三价的[Ru(bpy)3]3+被还原形成激发态的二价

[Ru(bpy)3]2+*，能量来源于[Ru(bpy)3]3+和TPA*之间存在的高电化学电位差。TPA*自身被氧化成二丙胺和丙醛。接着激发态的 [Ru(bpy)3]2+*衰减成基态的[Ru(bpy)3]2+，同时发射一个波长620nm的光子。这一过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号得以增强。

图1 三联吡啶钌NHS

Ru2＋*

-H+光子

TPA* Ru3+ Ru2＋

TPA+*

TPA

＋ -e -e ＋

图2 在电极表面的ECL反应

Ru2＋: [ Ru(bpy)3] 2+基态

Ru3＋: [Ru(bpy)3]3+氧化态

Ru2＋*: [Ru(bpy)3]2+* 激发态

二、电化学发光免疫测定

以三联吡啶钌作为标记物，标记抗原或抗体，通过免疫反应及ECL反应，即可进行电化学发光免疫测定（ECLIA）。在实际应用中则尚有特定的仪器和试剂。瑞士罗氏公司（ROCHE）的Elecsys ECLIA系统，综合了各种先进技术，具有独特的优越性，已在医学检验中取得广泛应用。

Elecsys全自动分析仪分成两个部分：在试管内化学反应部分和在流动池内的ECL反应部分。

（一）试管内的化学反应

1、试剂的组成

在Elecsys试剂的制备中，包括电化学发光剂的标记和抗原或抗体的固相化，应用了多种先进技术，简述如下：

（1）电化学发光剂的标记

[Ru(bpy)3]2+需经化学修饰形成活化的衍生物后才能与抗体或抗原形成结合物。有多种活性基团可与[Ru(bpy)3]2+分子中的砒啶基反应。在Elecsys试剂中采用的是N羟基琥珀酰胺酯（NHS）（图1）。该衍生物具有水溶性，可与抗体、蛋白质抗原、半抗原、激素、核酸等各种分子结合形成稳定的标记物。而且[Ru(bpy)3]2＋NHS分子量很小，与免疫球蛋白结合的分子比超过20仍不会影响抗体的可溶性和免疫活性。

（2）固相载体

Elecsys中采用的固相载体是带有磁性的直径约2.8μm的聚苯乙烯微粒。其特点是表面积极大，吸附效率高；在液体中形成均匀的悬液，参与反应时类似液相，反应速度快。由于带有磁性，在游离标记物与结合标记物分离时，只需用磁铁吸引，方便迅速。

（3）链霉亲和素与生物素系统的应用

链霉亲和素（streptoavidin，SA）和生物素（biotin，B）是具有很强的非共价相互作用的一对化合物。一分子SA 可与4分子B相结合。在Elecsys的试剂中，SA通过特殊的蛋白结合物均匀牢固地包被在磁性微粒上，形成通用的能与B结合的固相载体。另一试剂为与经活化的B衍生物化合的抗原或抗体。两种试剂混合时，B化合的抗原或抗体即结合在磁性微粒上。

2、在试管中的反应

反应分两个步骤。以双抗体夹心法测抗原为例，试剂含以下组分：

a、[Ru(bpy)3]2+标记的抗体

b、生物素化合的抗体

c、SA磁性微粒

d、TPA溶液

e、洗涤液

（1）步骤一

在试管中加试剂a、b及待测标本（含抗原），反应式如下（图3）。反应在液相中进行，37o C下5－10分钟内完成。

（2）步骤二：在上述反应液中加入试剂c，反应式如下（图4）。

反应在接近液相的条件中进行，37OC下5－10分钟内完成。下一个步骤为结合的标记抗体与游离的标记抗体相分离，此步骤及以下的电化学发光反应，在Elecsys的流动池中进行。

（二）流动池中的电化学发光反应

1、流动池的基本结构

流动池是电化学发光过程中所有电化学发光反应进行的场所（图5）。反应液由蠕动泵运送入流动池，反应后由流动池流出。一个激发电极在流动池的下方，两个测定电极安装在激发电极上方的两侧，留出一个清晰的窗口以便使发射的光子被光电倍增管收集。在流动池下装置可移动的用以吸引磁性微粒的磁铁。

2、电化学发光反应的步骤

（1）将试管内两步反应结束的反应液输入流动池，由于磁铁吸引，磁性微粒被吸着在电极上，其余反应物流出流动池，完成游离的和结合的标记抗体的分离。

（2）将TPA溶液送入流动池,将残余的游离标记抗体排出流动池,在流动池中充满TPA溶液。

（3）撤下磁铁，电极上通电，三联吡啶钌与TPA发生电化学发光反应，发出的光被光电倍增管收集，测定光强度。

（4）通过换算得出待测标本中的抗原浓度。

（5）在流动池中送入清洗液，将反应物彻底冲洗，即可测定下一个标本。

一、主要技术特点

1、电化学发光反应原理

化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+和电子供体（TPA）在阳极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，这是一种很强的氧化剂。TPA失去电子后被氧化成阳离子自由基TPA+*，它很不稳定，可自发地失去一个质子（H+），形成自由基TPA*，这是一种很强的还原剂，可将一个电子递给三价的[Ru(bpy)3]3+使其形成激发态的[Ru(bpy)3]2+*。激发态的三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+*不稳定，很快发射出一个波长

620nm的光子，回复成基态的三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+。这一过程可以在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号增强。

2、电化学发光的标记物

电化学发光的标记物-三联吡啶钌的分子结构简单，分子量小，可以标记于任何抗原、抗体及核酸，在一个抗体等分子上可同时标记>20个标记物分子，不影响抗体的活性，用于核酸标记亦不影响探针杂交活性。三联吡啶钌是水溶性，高稳定的小分子，它可以确保电化学发光的高效性和稳定性，并无噪音干扰。

3、专利的包被技术

罗氏公司应用了专利的链霉亲和素-生物素包被技术。链霉亲和素-生物素是最牢固特异的结合，因此可以达到牢固和均一的包被效果。一个链霉素亲和素可以和四个生物素结合，因此可以成倍增加生物素化抗体（抗原）的包被量，具有信号放大的作用，提高了检测灵敏度。

4、独特的载体

由聚苯乙烯包被的直径为2.8微米的磁性微球作为载体，大而均一的表面积能包被最大量的链霉亲和素，载体悬浮在反应体系中，使异相反应类似均相反应，大大加快反应速度。

5、磁性分离技术