第五章 DNA的安全保障体系

Ionizing radiation causes three types of damage to
DNA: Single-strand breaks - mostly sealed by DNA ligase so don't contribute to lethality Double-strand breaks - often lethal because can't be resealed by ligase so degraded by nucleases Alteration of bases - this type of oxidative damage is usually lethal because forms a replication barrier at that site
UV radiation - 260 nm is wavelength at which maximum
absorption occurs for DNA UV - major photoproduct is intrastrand linkage of adjacent pyrimidines, usually thymines, called thymine dimers. Creates distortion in helix and affects replication and transcription. Pol III can't replicate past T-dimer because if puts in A across from dimer, recognizes the weak H-bonding as a mismatch and proofreads. Tries to put in another A, fails. Causes stuttering of Pol III at this site. Block in replication isn't permanent; can have dimer repaired.
第二节 单个碱基位点损伤的修复
自发损伤：碱基脱氨基、脱嘌呤、脱嘧啶；活性氧 诱发损伤：如亚硝酸氧化脱氨等。 小的损伤位点可能不能被uvrABC系统识别。
一、碱基丢失及其修复 DNA糖苷键的稳定性低于RNA。双螺旋 结构克服了这一缺陷，但嘌呤碱基仍容易自 发水解，这一过程称为脱嘌呤作用 （depurination). 自发脱嘧啶的速度则要低20倍。
DNA错配修复系统 (DNA mismatch repair system, MMR) 是指由特异修复DNA碱基错配的酶 分子组成. 这套系统的存在，可保证遗传物质的完 整性和稳定性，避免遗传物质的突变产生，保证 DNA复制的高保真度. 1993年Fishel et al克隆到第一个人类MMR基 因-hMSH2. hMSH2位于人类染色体2p21-22，其基 因组全长73kb，含16个外显子，cDNA全长3111bp 含有2727的开放阅读框架，翻译后编码一种由 9099氨基酸组成的蛋白质，与酵母MSH2蛋白有 41%的一致性，最保守区位于573～764氨基酸序 列处，与酵母蛋白的相应区域有85%的一致性，
二、非标准碱基及其修复——
碱基切除修复（base excision repair, BER）
1. 非标准碱基的生成 除尿嘧啶的复制掺入外，还有其他的 碱基衍生物也会出现于DNA链中，如3-甲基 腺嘌呤，6-氢-5，6-二羟胸腺嘧啶等。
胞嘧啶和腺嘌呤的氧化脱氨。
脱氨基（deamination）:C或A被脱掉氨基后分别
三、尿嘧啶-N-糖基酶系统 若大肠杆菌DNA聚合酶不能区分dUTP和 dTTP，则A·T→A·U 生物体内dUTP的产生：由dNDP+ATP(核苷 二磷酸激酶) →dNTP+ADP RNA、DNA皆不需要dUTP 。 dUTP dUMP 少数dUTP仍会渗入DNA链, Pol Ш无法校 对U=A 。 另：胞嘧啶自发脱氨氧化也会形成U。
hMLH位于3p21,3-23, 全长约58kb,与酵母的 MLH1蛋白有41%的同源性，与鼠的MLH1蛋白有 74%的同源性. hPMS1和hPMS2分别位于3q3133和7p22，hPMS1基因的cDNA有2795bp的开放 阅读框架，其编码蛋白由932个氨基酸组成，蛋 白的氨基末端与酵母PMS1蛋白的氨基末端有 30%的一致性，羧基末端有22%的一致性， hPMS2的cDNA有一2586bp的开放阅读框架，编 码蛋白在氨基末端与酵母PMS2蛋白有40%的一 致性，羧基末端有47%的一致性. 目前研究认为MMR的基因突变或失活是造 成MSI的原因.
MutS recognizes and binds at the site of a base pair
mismatch. MutH binds at a hemimethyalted GATC sequence and cleaves the nonmethylated strand. MutL is thought to act as a linker protein which binds MutS and MutH in a complex.
① 互变异构的形式 i）酮式-烯醇式（keto-enol） 互变。 ii）氨基-亚氨基（amino-imino）互变。
② 互变异构引起 的配对错误
亚氨基 形式
由DNA聚合酶的校对功能校 对后,配对错误率下降到约10-7.
二、错配修复系统 复制中错误率的降低
存在第二次纠正。
错配矫正酶：由基因mut H, mut L , mut S 和mut U编码。错配修复还 涉及到其它蛋白质。 错配矫正酶相互配合识别、切除 新生链上包含错配碱基的一段DNA, 然后由DNA pol III和DNA ligase修补。
5,6 hydrated thymines
Each type of modified base has a
corresponding DNA glycosylases which removes the base leaving an apurinic or apyrimidinic site in the DNA. These sites are then recognized by AP endonucleases which remove the ribose-phosphate moiety from the backbone. The resulting gap can be reapired by DNA polymerase I and DNA ligase.
不具AP内切酶活性((如尿嘧啶糖基酶；
次黄嘌呤糖基 酶）
DNA糖基酶
具有内在的AP内切酶活性（如水合胸腺嘧 啶糖基酶）。
DNA糖基酶修复系统十分重要。如果这些酶的基 因突变，则细菌生长状况很差。
Glycosylase Ura-DNA glycosylase Hmu-DNA glycosylase 5-mC-DNA glycosylase
AP 位点（AP site, apurine / apyrimidine） 无碱基位点使互补位的碱基变得不确定。
由AP内切酶（AP endonuclease）、 DNA 聚合酶I、DNA连接酶等修复。
另外也发现细胞内有一种直接将合适的 碱基插入到AP位点的酶，即碱基插入酶 （insertase), 目前只发现嘌呤碱基插入酶，专 一性强，只作用于双链DNA上的AP位点，不 能作用于单链上的AP位点。根据碱基互补规 则插入。
associated with defects in a human counterpart to MutS (HNPCC Type 1) or MutL (HNPCC Type 2).
微卫星(microsatellite, MS)是指基因组中小 于10个核苷酸的简单重复序列，是一类呈高度多 态的遗传标记，突变率为5×10-４～5×10-5在家 系中可以稳定的遗传，是一种很好的遗传标志. 微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI)指由于复制错误(replication error, RER)引起 的简单重复序列的增加或丢失. 造成微卫星基因 的突变. 又有学者将MSI分为高频率MSI(MSI-H) 与低频率MSI(MSI-L)，但对MSI-H与MSI-L目前 尚无公认的标准.
第五章 DNA的安全保障体系
第一节 复制修复
复制修复：复制进程中或复制完成后的 较短时间之内完成的修复。 一、DNA复制中的错误 复制错误的原因主要是碱基的互变异构 体（tautomers）形成的碱基错配。1953年， Watson和Crick就提出DNA中的嘌呤和嘧啶 存在互变异构体，与错误的碱基配对就会导 致互变异构变化。
Definition of AP endonuclease : endonuclease that initiates excision repair at apurinic and apyrimidinic sites on DNA.
小
结
复制修复：
① 校对 ②错配修复系统 ③尿嘧啶-N-糖基酶系统
DNA碱基的甲基化通常在A和C上：
N6-甲基腺嘌呤
腺嘌呤的甲基化是错配修复系统的识别标志。
5-甲基胞嘧啶
甲 基 化 指 导 的 错 配 修 复
胃癌中微卫星不稳定性及 DNA错配修复系统 康燕婕 王林娜 张振科 河北医科大学第二医院消化 内科 河北省石家庄市 050000
Human nonpolyposis colorectal cancer is
变成U或H（hypoxanthine，次黄嘌呤）。
C的自发脱氨 作用，变成U
A→H， ∴ T· → T·H →C·H →C· A G
2. 修复
Bases which have been modified by alkylation or deamination may be removed from DNA by special DNA glycosylases.对这些非标准碱基，均已发现相应的糖基酶 （glycosylases).
5-甲基化的胞嘧啶常常是突变的热点。5甲基胞嘧啶也常发生自发脱氨基作用。
第三节 胸腺嘧啶二聚体的修复
外界因素（电离辐射，UV，烷化剂、氧化剂等）对 DNA分子的损伤。
化学诱变因素
烷化剂
亚硝酸
嵌入剂等
物理诱变因素
电离辐射(x射线、射线) UV辐射
DNA损源自文库的化学及物理因素
几种化学诱变剂结构图
Base(s) recognized Uracil Hydroxymethyl uracil 5-methylcytosine Formamidopyrimidines 8 hydroxyguanine
FaPy-DNA glycosylase
5,6-HT--DNA glycosylase (endonuclease III)
尿嘧啶-N-糖基酶系统包括： 尿嘧啶-N-糖基酶 AP内切核酸酶 Pol I DNA连接酶 过程：尿嘧啶-N-糖基酶将U切下; AP内切 核酸酶在相应的位点切开磷酸二酯键；Pol I 从5'→3'方向补上；DNA连接酶连接。
修复过程
i）糖基酶识别错配位点， 并切除碱基。 ii）AP内切酶切除戊糖。 iii）DNA 聚合酶、 DNA 连接酶修补 缺口。
问题：如何识别新生链和模板链？
C．Dohet 1980-1985年实验
建成一个含错配的异源双链，引入E.coli. 若异源双链的只有一股GATC顺序完全甲基 化，则修复发生在未甲基化的那一股上；若 两股GATC顺序均已甲基化，则不发生修复.。
合成刚结束时，新生链甲基化程度 尚低，亲本链的甲基化程度高。新生链 的甲基化程度小，越靠近复制叉越小， 此为识别机制。 一般在GATC这样的顺序中，dam基 因编码DNA腺嘌呤甲基化酶，甲基供 体为S-腺苷甲硫氨酸。