天然产物糖基化修饰及应用

天然产物糖基化修饰及应用
摘要：天然产物广泛存在于自然界中，其数量种类繁多且结构复杂多样，具有许多生理与药理活性。

糖基化修饰能增加天然产物结构和功能的多样性，已成为当今新药开发的研究热点。

本文简单介绍了天然产物糖基化的基本概念，以及天然产物糖基化修饰的研究方法和在各方面的应用。

关键词：天然产物，糖基化，修饰方法，应用
天然产物广泛存在于自然界中，其数量种类繁多且结构复杂多样，许多天然产物活性成分现在已经作为治疗各类疾病的药物，还有一些作为潜在的药物，具有抗炎抑菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、抗辐射和免疫调节等诸多活性，已成为国内外天然药物开发利用研究的热点。

糖基化反应可以使许多外源化合物的理化性质与生物活性发生较大的变化，例如将不溶于水的化合物转变为水溶性化合物，降低化合物的毒性，增强稳定性等[1]。

本文对天然产物糖基化修饰和应用作简单综述。

糖基化是生物细胞中最重要的反应之一，与多种生理病理过程有直接关系。

在微生物和植物的次级代谢过程中，糖基化也是重要的反应，即生物为了使有机分子更有效地发挥作用而进行的一种结构修饰[2]。

这种天然的修饰存在于多种生物学活性不一样的天然化合物中，包括抗生素、抗癌药物、激素、甜料、生物碱以及黄酮等多种代谢产物[3]。

1 天然产物简介
天然产物是指动物、植物、昆虫、海洋生物和微生物体内的组成成分或其代谢产物以及人和动物体内许许多多内源性的化学成分统称作天然产物，其中主要包括蛋白质、多肽、氨基酸、核酸、各种酶类、单糖、寡糖、多糖、糖蛋白、树脂、胶体物、木质素、维生素、脂肪、油脂、蜡、生物碱、挥发油、黄酮、糖苷类、萜类、苯丙素类、有机酸、酚类、醌类、内酯、甾体化合物、鞣酸类、抗生素类等天然存在的化学成分。

1.1植物源天然产物成分
来源于植物界的有效成分主要有黄酮类、生物碱类、多糖类、挥发油类、醌类、萜类、木脂素类、香豆素类、皂苷类、强心苷类、酚酸类及氨基酸与酶等。

1.2微生物及其发酵液天然产物成分
微生物是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活密切相关。

能够提供有效成分的主要是真核生物中的真菌与藻类，以及其他微生物的代谢（发酵）产物。

来源于微生物及发酵液的有效成分主要有多糖类、酶类、抗生素类、色素类、氨基酸类、有机酸类、醇酮类、维生素类、核酸类等等。

1.3海洋天然产物有效成分
海洋占地球表面积的71%，生物量约占地球生物总量的87%，生物种类20多万种，是地球上最大的资源能源宝库，目前人们对海洋生物的认识仍相当有限，利用率仅1%左右。

到目前为止海洋天然产物有效成分主要有甾醇、萜类、皂甙、
不饱和脂肪酸、多糖和糖苷、大环内酯、聚醚类化合物和多肽等。

2 糖基化的机制
糖基化是在酶的作用下，在蛋白质或脂质等生物大分子上附加糖类的过程，常发生于内质网。

在生物细胞中，糖基化是糖基转移酶(glycosyhransferase)以糖基供体和受体(亲核物质)为底物，把糖基供体转移到受体上的过程。

特定的受体分子包括蛋白、核酸、寡糖、脂和其他小分子物质。

糖基供体是核苷二磷酸活化形式(NDP-)的各种糖基，主要是一些NDP-六碳糖，其中UDP-葡萄糖最为常见。

另外还包括一些NDP-脱氧六碳糖以及许多稀有的NDP-糖胺等[4]。

糖基与不同糖基受体的结合不仅能大大增加天然产物的结构多样性，在功能上，这些糖组分通常参与靶细胞的分子识别，直接或间接影响到化合物的生物学活性[5]。

2.1 糖基化的修饰及应用
糖基化可以改善化合物的水溶性，且通常直接参与天然产物与靶点的相互作用，去糖基化的天然产物生物活性会受到很大影响，因而糖基化修饰在天然产物生物活性中起到重要的作用。

经糖基化后，蛋白质分子表面的糖链可对蛋白质分子的结构产生深远的影响。

糖基化可增加蛋白质对于各种变性条件(如变性剂、热等)的稳定性，防止蛋白质的相互聚集。

同时，蛋白质表面的糖链还可覆盖蛋白质分子中的某些蛋白酶降解位点，从而增加蛋白质对于蛋白酶的抗性[6]。

研究结果表明，蛋白质表面的糖链可增加蛋白质分子的溶解性。

据报道，当天然的来普汀通过糖基化工程连接上5个N-连接糖链时，其溶解度增加了15倍[7]。

来普汀是一种非糖基化的蛋白，与控制体重有关。

利用糖基化工程制备来普汀五个糖链的类似物(GE—LeptinL4-58)，与使用重组人来普汀(rHuLeptin)相比，利用GE-LeptinL4-58处理肥胖小鼠可以减掉更多的体重并可以维持更长时间。

进一步研究表明，对正常小鼠，10倍量的rHuLeptin依然不能赶上使用GE—LeptinL4-58减轻的体重。

经研究，氯霉素经糖基化修饰后其水溶性显著增加，并且促进了药物的吸收利用，同时降低了原药的毒副作用。

据报道，重组人红细胞生成素的高度糖基化类似物，具有与重组人红细胞生成素类似的结构和稳定性，但是由于其33和88位各增加了一个N-糖基化位点，所以该药物在鼠和犬体内的半衰期延长了3倍，目前，该产品已经研制成功并上市[7]。

另有报道，糖基化的IL-3可以被细胞外基质捕获并缓慢释放到循环系统中，其血浆半衰期延长了2倍，从而使骨髓中组氨酸羧化酶活性的能力提高了30%-40%。

3 天然产物糖基化修饰的研究
随着越来越多的糖基合成基因簇及糖基转移酶基因被鉴定, 研究者开始尝试组合使用这些功能元件来获得新糖基修饰的天然产物。

3.1体内(In vivo)基因工程方法改造糖基侧链修饰
3.1.1 体内基因缺失技术
研究糖基合成基因功能经典的策略就是对糖基合成基因进行缺失,通过检测突变株中积累的代谢产物结构的变化来鉴定突变基因的功能。

杰多霉素(Jadomycin)是委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae ISP5230)在乙醇刺激等特殊环境压力产生的一种非典型角蒽环类抗生素。

当缺失糖基合成基因jadO (NDP-糖2,3-脱水酶)后，令人意外地产生了一种新糖基修饰产物6-脱氧-L-altrose修饰杰多霉素(图1)。

理论上jadO 缺失突变株积累的中间体糖基应该为NDP-4-酮基-6-脱氧-D-葡萄糖，推测该中间体糖可被下游JadU (异构酶)和JadV (酮基还原酶)继续催化生成NDP-6-脱氧-L-altrose，继而被糖基转移酶JadS识别生成新糖基修饰的产物，该结果也表明JadS对糖基底物具有一定的宽容性。

类似的情况在Urdamycin、Methymycin 等中也有报道[8]。

图1 体内基因缺失技术改造红霉素和杰多霉素糖基侧链修饰Fig.1 Formation of new glycosylated derivatives of erythromycin and jadomycin
by gene inactivation
此外, 通过缺失GTs 也是获得不同糖基侧链化合物的常用途径，该方法常用于含有多个GT 的天然产物合成途径。

Landomycin A 是Streptomyces cyanogenus S136产生的一种含有六糖侧链的角蒽环类抗生素，该六糖侧链由4 个GT（糖基转移酶）负责合成。

通过分别缺失其合成途径中的3 个GT 基因lanGT1、lanGT4和lanGT3 获得了多种含不同糖基侧链的Landomycin 衍生物[9]。

Zhang等近来鉴定了Tiacumicin B (产生菌为Dactylosporangium aurantiacum subsp. Hamdenensis NRRL 18085)的生物合成基因簇，通过对其合成途径中的两个GT编码基因tiaG1 和tiaG2 分别进行缺失，获得了多种不同糖基侧链的Tiacumicin 衍生物，同时该工作表明TiaG1 和TiaG2 对非天然的糖基底物具有一定的识别利用能力[10]。

这些工作的深入开展，不仅可以从体内鉴定糖基合成基因以及GTs 编码基因的功能，还可以发现具有宽泛糖基底物识别能力的糖基转移酶和糖基合成酶，为合成新结构糖基以及新糖基修饰天然产物打下坚实的基础。

3.1.2 体内组合生物合成技术
体内组合生物合成技术主要是通过对糖基合成途径进行代谢工程改造，来获得新糖基修饰产物。

红霉素(Erythromycin)是红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)产生的一种大环内酯类抗生素，缺失其碳霉糖糖基转移酶(Mycarosyltransferase)基因eryBV，然后在该突变株中表达外源GT（糖基转移酶）oleandrosyltransferase(OleG2, 来源于Oleandomycin 合成途径)，成功获得了新糖基修饰产物3-O-L-rhamnosyl erythronolide[11]。

在Sac.erythraea SGT2中表达多杀菌素合成途径中GT SpnP (Forosaminyltransferase)，同时外源添加多杀菌素假配糖体(Spinosyn pseudoaglycon)，最终获得了新糖基修饰多杀菌素17-O-α-L-mycarosyl-spinosyn A[12]，说明SpnP可以识别异源宿主菌所合成的糖基NDP-L-mycarose，并修饰至多杀菌素假配糖体上。

这些工作提示我们：当原始宿主无法合成目标糖基时，可选择目标糖基产生菌进行遗传改造，除去其天然配糖体产生能力，再通过外源添加拟修饰的配糖体，可实现天然产物糖基侧链结构改造。

为了更方便快捷地在不同宿主中合成新的糖基，Salas等构建了一系列糖基合成载体(Sugar bisynthesis plasmids)。

他们首先使用PCR方法扩增糖基合成所需各个基因，再使用特定的限制性酶切位点将各个基因进行连接，构建获得一个游离型载体，并使用红霉素抗性基因启动子ermEp*来启动这些糖基合成基因的表达[13]。

对这些糖基合成载体的改造也非常容易，为合成特定的目标糖基，可通过引入或剔除不同功能的糖基合成基因，快速构建目标糖基的合成途径。

Salas 等对Oleandomycin (Streptomyces antibioticus ATCC11891 产生)中L-oleandrose 合成基因进行重新整合得到载体pLN2 (图2)。

图2 糖基合成载体的构建以及运用糖基合成载体来对8-Demethyltetracenomycin
C (8-DMTC)进行新糖基侧链修饰改造
Fig. 2 Construction of sugar cassette plasmids and generation of new glycosylated 8-demethyltetracenomycin C(8-DMTC) derivatives by using these sugar cassette
plasmids
由于pLN2 含有NDP-L-olivose合成所需的所有基因，推测可以合成NDP-L-olivose。

并以此载体为基础根据不同糖基合成途径构建了NDP-D-olivose，NDP-Lrhamnose，NDP-L-rhodinose 的合成载体。

重组菌Streptomyces albus 16F4 含有Elloramycin 配糖体8-Demethyltetracenomycin C (8-DMTC)的合成基因，同时含有GT ElmGT 的编码基因。

将上述4 个载体导入S. albus 16F4，分析重组菌代谢产物，成功检测到上述4 种不同糖基修饰的8-DMTC 衍生物，从而证明了所构建的糖基合成载体在体内可以合成目标糖基，同时也表明ElmGT 具有较为宽泛的糖基底物识别能力。

3.2 体外(In vitro)酶学法改造糖基侧链及应用
为了深入细致地研究各种糖基合成基因以及GTs 的功能，人们开始把目光投向体外酶学的研究，并在此基础上发展出了天然产物糖基侧链体外酶学改造法。

体外酶学改造法的实现，首先是需要从体外合成活化的底物NDP-糖，表达具有底物宽容性的GTs，进而建立酶学水平的糖基转移反应，最终获得新糖基修饰的天然产物。

经典体外酶学法对天然产物进行糖基侧链改造：体外制备不同种类NDP-糖并纯化GTs，具有底物宽容性的GTs 催化配糖体和不同NDP-糖基发生连接反应，从而对天然产物进行糖基侧链改造(图3A)。

这种策略首先成功应用于酒霉素/苦霉素(Methymycin/picromycin)以及万古霉素(Vancomycin)等糖基修饰改造[14]。

图3A：糖基转移酶催化的经典反应
Fig. 3A：Classical reaction catalyzed by GTs
运用糖基转移酶催化的逆向反应进行天然产物糖基侧链修饰改造：在刺孢霉素(Calicheamicin) 中GT CalG1 的研究工作中，Thorson 等发现CalG1 可以催化糖基转移的逆向反应，即在TDP（胸苷二磷酸）存在的条件下，CalG1 催化已发生糖基修饰的天然产物发生去糖基化反应，生成对应的TDP-糖和配糖体[15](图3B)。

图3B：CalG1 催化糖基转移逆向反应并可同时催化对新糖基的转移反应
Fig.3B:CalG1 catalyzed reverse glycosyl transfer reaction and glycosyl transfer
reaction toward new TDP-sugar
4 常见的天然产物糖基化修饰及应用
4.1 黄酮类化合物的糖基化修饰
黄酮类化合物是多种药用植物的有效成分，以游离态或与糖结合为苷的形式广泛存在于自然界中，由于大多数黄酮苷元及部分黄酮苷类在水相中溶解度低，限制了其制剂的开发，同时复杂的结构也给利用化学合成方法进行结构修饰带来了巨大挑战。

将来源于自然界的植物细胞、微生物和游离酶对黄酮类化合物进行糖基化修饰，可在糖基连接位置、糖基种类以及糖基数目等方面实现定向转化，因此目前对黄酮类化合物进行分子修饰主要是以糖基化反应来改善其水溶性[16]。

已报道槲皮素可被多种糖基转移酶及微生物细胞进行糖基化反应，糖基化位置分别是槲皮素3、7、3位和4位羟基[17]。

Ko等以来源于蜡状芽孢杆菌的糖基转移酶对槲皮素进行糖基化反应，糖基化位置在槲皮素3位及7位羟基，分别得到槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-7-O-葡萄糖苷。

Ko等[18]以来源于蜡状芽孢杆菌的糖基转移酶对染料木素进行糖基化反应，糖基化位置在染料木素7位羟基。

染料木素的7位或4位羟基经糖基修饰后具有防止紫外线损伤、抑制黑素瘤细胞的生长、提高生物利用率、降低谷丙转氨酶及提高抗癌活性等作用。

4.2 维生素类化合物的糖基化修饰
维生素B l和它的一、二、三磷酸盐广泛存在于自然界，特别是作为脱羧酶、转羟乙醛酶、转酮醇酶、羰基裂解酶等的组成部分的二磷酸盐。

大多数维生素B1的衍生物是人工合成的，Suzuki等[19]于1994年首次用曲霉蛋白酶对维生素B1进行生物转化，得到维生素B1-β-D-半乳糖。

该实验室分别由糊精和维生素B1在嗜热脂肪芽孢杆菌环状糊精葡萄糖基转移酶和根霉葡糖淀粉酶的作用下，以及由β-硝基苯基-D-2-脱氧-2-乙酰-吡喃葡萄糖和维生素B1在曲霉蛋白酶β-N-乙酰己醣胺的作用下合成了维生素B1的第二和第三种糖基化产物(维生素B1-α-D-吡喃葡萄糖和维生素B1-β-D-2-脱氧-2-乙酰-吡喃葡萄糖)。

维生素B1的糖基化产物，尤其是维生素B1-α-葡萄糖苷，可以作为一种食品添加剂、化妆品添加剂或应用于制药。

4.3甾体类化合物的糖基化修饰
洋地黄毒苷元糖基化后其药理活性更强，副作用更小。

Kawaguchi等[20]用夹竹桃科的旋花羊角拗Strophanthus gratus(Wal1. et Hook. ex Benth.) Baill.和S.amboensis DC. 混合悬浮细胞培养，将洋地黄毒苷元同时羟化和糖基化，生成洋地黄毒苷的异构体17-β-H-杠柳苷元-β-D-葡萄糖洋地黄毒苷。

4.4核苷类化合物的糖基化修饰
Suzuki等[19]以黑曲霉菌中的α-葡糖苷酶对腺苷进行生物转化，得到O-葡糖基-核苷，5’-O-( α-D-吡喃葡糖苷)腺苷。

他们发现利用含有乳糖和阿糖胞苷的单一掷孢酵母菌培养基可以有选择性地大量生产1-β-D-吡喃阿糖胶-胞嘧啶(阿糖胞苷)、{3’-O-(β-D-吡喃葡糖苷)-阿糖胞苷和3’-O-[β-D-吡喃葡糖苷-(1→4) –β-D-吡喃葡糖苷]-阿糖胞苷}，这是一种重要的抗癌药物的两种新衍生物。

5 讨论
糖基化在天然产物化学中的应用已取得不凡的成就，而且其工业发展潜力非常巨大。

来源于自然界的植物细胞、微生物和游离酶对天然产物进行糖基化修饰，可在糖基连接位置，糖基种类以及糖基数目等方面实现定向转化。

这为以天然活性成分为先导化合物，通过生物转化方法寻找和开发新药提供了行之有效的途径。

但是目前人们对天然产物糖基化的研究还多集中于生物催化的生物、植物细胞及其酶的筛选上，对生物转化的机制、酶的分离及酶的性质研究还不多，生物转化的底物选择性、立体选择性的深入的规律性研究就更少，还很难达到有目的地进行定向转化的应用境地。

可喜的是，随着现代分析技术、现代生物技术(尤其是分子生物学与结构生物学)的飞速发展，这些新兴技术已经开始渗透到传统的生物转化研究中来。

可以预见，糖基化的研究将是今后生物转化的研究热点与发展趋势；生物转化也将与化学方法更紧密地结合。

我们有理由相信，随着研究的深入，生物催化剂的数量和多样性会激增，糖基化将在天然药物研究与开发中发挥更为重要的作用。

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