抗菌中药实验研究方法学应注意的几个问题_韩晓伟
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收稿日期： 2017 － 03 － 15 基金项目： 国家自然科学基金项目（ 81403208） 作者简介： 韩晓伟（ 1974 － ） ，女，河北卢龙人，副教授，硕士研究生
导师，研究方向： 中医药抗感染免疫研究。 通讯作者： 关洪全（ 1954 － ） ，男，辽宁本溪人，教授，博士研究生导
师，研 究 方 向： 中 医 药 免 疫 调 节 及 虚 证 的 免 疫 调 控。 E-mail： hongquanguan@ sina． com。
自古中医多用中药复方防治疾病，其中某些方剂治疗 感染性疾病具有较好的疗效，至今仍在临床应用。复方虽 然由单味中药组成，但其治疗效果并非各单味药的简单叠 加。目前单味药或其提取物的抗菌作用研究报道较多，对 复方的研究尚不够深入。中药的抗菌作用机制是非常复杂 的，有些方剂中的各种单味药虽无明显的抗菌活性，但将其 组合后的复方对某些微生物感染则有一定的治疗效果，而 研究这样的方剂，单纯靠体外抗菌实验往往得不到准确的
抗菌中药实验研究方法学应注意的几个问题
韩晓伟，徐铭，关洪全
（ 辽宁中医药大学 辽宁 沈阳 110847）
摘 要： 在分析前一阶段抗菌中药实验研究方法的基础上，提出今后进行其研究在方法学方面应注意的几个
问题： ①加强中药在机体水平上抗菌感染作用的研究。②加强中药复方抗菌作用的研究。③研究中药在动物体
内的抗菌作用时，要注意选择适合的感染性疾病动物模型及敏感的检测指标，并应扩大应用感染性疾病动物模型
Discussion on Methodology of Experimental Ｒesearch on Antibacterial Chinese Herbs
HAN Xiaowei，XU Ming，GUAN Hongquan
（ Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，Liaoning China）
在研究抗生素和化学合成抗菌药物抗菌作用的工作 中，为了控制误差，使实验结果准确、可重复性好，人们制定 了一些体外抗菌实验的标准供研究者参考。在中药抗菌作 用的研究中，由于影响中药抗菌作用的因素较多，难以制定 此类标准。卢祥婷［21］等在进行 10 种中药提取物抗念珠菌 体外药敏实验时，药物敏感终点判读参照 CLSI 推荐的微量 液基稀释法（ M27 － A3） 中对微量液体培养基稀释法的标 准，对唑类药物以 50% 抑制作为观察终点，判断最低抑菌 浓度，中药提取物的结果判断参照唑类药物进行的。今后 应根据中药本身以及其抗菌作用的特点，逐步创造条件，尽 早制定相应的中药体外抗菌实验标准。在研究中药体外的 抗细菌作用时应注意以下几个问题。 3． 1 供试菌的种类及株数 在研究抗菌的中药时，有些研 究选用供试菌的种类和株数偏少。虽然有研究表明同一种 中药对于相同菌的不同菌株可表现出几乎一致的抑菌活 性［22］，但大部分情况下，不同菌对同一种抗菌药物的敏感 性常不相同，甚至同一种菌的不同菌株对同一种药物的敏 感性也常有较大差异。因此，今后在研究有应用前景的抗 菌中药时，应进一步扩大供试菌的种类及株数。 3． 2 培养基的种类及含量 一些研究资料表明，培养基的 种类对某些抗菌药物在体外的抗菌活性有一定影响，国外 在研究药物的抗菌活性时，比较重视所使用培养基的种类， 常选用不同的培养基进行研究。所以，今后研究中药的抗 菌作用时，必须充分注意培养基的因素。另外，利用琼脂扩 散法研究抗菌中药时，平皿中培养基的含量也直接影响中 药的抗菌效果，在一定范围内，培养基越多，抑菌环往往就 越小。同时，还应注意培养基中琼脂的含量是否适宜，比如 对固体培养基其软硬度是否适宜，如过软划线接种时培养 基易被划破，过硬会影响菌对营养物质的吸收，不利于菌的 生长繁殖，直接影响抗菌实验的结果［23］。所以今后研究时 也应注意这一问题。 3． 3 接种菌的菌龄与菌量 同一种菌的菌龄不同，对药物 的敏感性常不一致，在研究药物的抗菌作用时，一般应使用
第 35 卷 第 7 期 2017 年7 月
中华中医药学刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 35 No． 7 Jul． 2 0 1 7
DOI： 10． 13193 / j． issn． 1673-7717． 2017． 07． 009
1 加强中药在机体水平上抗菌感染作用的研究 1． 1 提高利用感染性疾病动物模型研究抗菌中药重要性 的认识 研究中药抗菌作用药效的方法主要包括体外试验 和体内试验两大方面。前一阶段抗菌中药的研究，大多数 是在体外进行的［5 － 8］，而利用感染性疾病动物模型在机体 水平上的研究较少。一种抗菌新药的研制过程，在一般情 况下是先做体外试验，对有苗头的药物再进行动物体内试 验，然后再进入临床试验。但抗菌中药的研究与抗生素和 化学合成抗菌药物的研制过程有所不同，绝大多数中药是 经过多年临床应用证明有效的。由于体外抗菌试验的结果 有时与人体内试验的结果差别较大，而在动物体内试验与 人体内试验结果的差别则相对较小。在体外有效的中药进 入机体内未必都有效，相反某些在体外无明显抗菌作用的 药物，进入机体内则可能有明显的疗效。有实验研究结果 表明白矾、白鲜皮、连 翘、山 柰 等 药 材 并 未 检 测 到 抗 菌 活 性［9］，这 与《中 药 大 辞 典 》中 报 道 的 杀 菌 作 用 存 在 差
Key words： researching ideas and methods； Chinese herbs； antibacterial effect； methodology
中 华 中 医 药
1670
学 刊
自古以来，中药在防治感染性疾病中发挥了积极的作 用，为维护人类的健康做出了重大贡献。近年来，广大研究 者对中药的抗菌作用进行了大量实验研究，发现数百种中 草药和多个方剂对某些病原菌具有良好的抗菌作用，并将 这些中药或其有效成分制成了制剂［1 － 4］，用于临床防治感 染性疾病，推动了医疗卫生事业的发展。回顾几十年来抗 菌中药的实验研究工作，虽取得了巨大成就，但在方法学上 也存在着一些不足，本文仅就几个需要注意的问题谈谈粗 浅看法。
结果，必须利用动物感染性疾病模型进行研究［17］。有临床 研究证明，在中医辨证分型的基础上，尝试以益气养阴、清 肺化痰方剂联合西药抗生素治疗细菌性肺炎患者，取得了 较好效果［18］； 李光辉［19］等人采用葛根茯苓汤治疗 80 例结 肠炎患者，腹胀腹泻等临床症状得到了显著改善，总有效率 为 95% ； 关丽华［20］等人应用结肠康治疗经恶唑酮诱导的 溃疡性结肠炎小鼠时，发现经茯苓、白术、黄连等中药治疗 后，可以通过降低小鼠模型一氧化氮（ NO） 、诱导型一氧化 氮合酶（ i NOS） 表达水平而达到治疗作用。这些治疗效果 主要是中药复方的综合作用，如果单用其中的某种单味药， 其疗效可能不如复方。这一点充分表明加强中药复方抗微 生物研究的重要性与可行性。所以，今后除体外抗菌实验 外，还要加强利用感染性疾病动物模型从整体水平上评判 中药复方的疗效。 3 注意体外抗菌实验研究方法的标准化问题
目前国内外广为应用的感染性疾病动物模型的种类较 多，判断药物疗效的指标主要是生存保护率、平均存活天数 和靶器官病变的程度等。就目前常用的模型而言，动物感 染病原菌发病后的病情多较重，一般的中药疗效有限，很难 取得预期效果。因此，利用感染性疾病动物模型研究抗菌 中药时，一方面要注意选择病情相对较轻的模型进行研究， 另一方面还要选择较敏感的指标。据文献报道及笔者的体 会，选用平均存活天数、靶器官病变的程度、靶器官或血液 中活菌的数量作为判断中药疗效的指标比生存保护率易出 现阳性结果［15 － 16］。 1． 3 扩大应用病原菌感染动物模型的种类 从总体上说， 迄今利用病原菌感染动物模型研究中药的抗菌作用还不是 很深入。国内 外 报 道 的 病 原 菌 感 染 动 物 模 型 的 种 类 虽 较 多，但在抗菌中药研究中应用的相对较少。由于不同的病 原菌感染具有不同的特点，对药物的敏感性常有差别，单纯 利用某种模型研究并不能完全反映某一中药整体的抗菌疗 效。因此，今后应根据中药的抗菌谱以及临床应用等情况， 注意扩大应用病原菌感染动物模型的种类进行抗菌中药的 研究。 1． 4 进一步研制新的病原菌感染动物模型 目前研制的 病原菌感染动物模型从总体上来说，其发病后病情多较重， 而中药的作用多较慢，且治疗时会受到抗菌中药剂型的限 制，如水煎剂、丸、散或“粗提物”中抗菌有效成分的含量较 少，进入动物体内往往疗效不显著，其抗菌活性大多数不如 抗生素和化学合成的抗菌药物，所以现有的模型有些不太 适合抗菌中药的研究。因此，今后还要根据中药治疗疾病 的特点，进一步研制新的适合中药研究的病原菌感染动物 模型，尤其是慢性感染性疾病动物模型。 2 加强抗菌中药复方的研究
Abstract： Based on the analysis of the experimental research method of antibacterial Chinese herbs in the first stage， the paper puts forward some problems that should be paid attention to in the future． Study on the antibacterial effect of Chinese herbs in the human body should be focused on． Study on antibacterial action of Chinese herbal compound should be focused on． To study the antibacterial effect of traditional Chinese herbs in animals，the selection of suitable animal model and sensitive detection index should be paid attention to，and it is necessary to expand the application of animal model of infectious disease． To study the antibacterial effect of Chinese herbs in animal in vitro，the types and number of pathogens should be expanded； the type of culture medium，the amount of inoculums，the age of the bacteria and the time to determine the results after inoculation with pathogenic bacteria should be paid attention to． When using agar plate diffusion method，the content of the medium in the flat drawing should be paid attention to．
第 35 卷 第 7 期 2017 年7 月
中华中医药学刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 35 No． 7 Jul． 2 0 1 7
异［10 － 11］； 碘化钾在试管内虽无明显的抗真菌作用，但临床 证明其对某些真菌性疾病具有肯定的疗效［12］； 补中益气汤 主要通过调节机体的免疫功能延长小鼠感染沙门菌强毒株 的存活期，也能延长耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的并 经丝裂霉素处理的免疫抑制小鼠的存活期，并可抑制小鼠 体内细菌的繁殖［13］。由此可见，动物体内试验是检验中药 对感染性疾病的疗效及了解其毒性、吸收、分布、代谢等情 况不可缺少的环节［14］。因此，应进一步提高利用动物模型 在机体水平上研究抗菌中药重要性的认识，加强相关的基 础研究。 1． 2 注意选择适合的感染性疾病动物模型和敏感的指标
的种类进行研究。④研究中药在动物体外的抗菌作用时，应扩大供试菌的种类及株数，注意培养基的种类以及接
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种菌种的菌量、菌龄和接种菌后判定结果的时间，应用平板琼脂扩散法研究时要注意平板中培养基的含量等。
关键词： 研究思路与方法； 中药； 抗菌作用； 方法学
中图分类号： Ｒ285． 5
文献标志码： A
文章编号： 1673-7717（ 2017） 07-1670-03
导师，研究方向： 中医药抗感染免疫研究。 通讯作者： 关洪全（ 1954 － ） ，男，辽宁本溪人，教授，博士研究生导
师，研 究 方 向： 中 医 药 免 疫 调 节 及 虚 证 的 免 疫 调 控。 E-mail： hongquanguan@ sina． com。
自古中医多用中药复方防治疾病，其中某些方剂治疗 感染性疾病具有较好的疗效，至今仍在临床应用。复方虽 然由单味中药组成，但其治疗效果并非各单味药的简单叠 加。目前单味药或其提取物的抗菌作用研究报道较多，对 复方的研究尚不够深入。中药的抗菌作用机制是非常复杂 的，有些方剂中的各种单味药虽无明显的抗菌活性，但将其 组合后的复方对某些微生物感染则有一定的治疗效果，而 研究这样的方剂，单纯靠体外抗菌实验往往得不到准确的
抗菌中药实验研究方法学应注意的几个问题
韩晓伟，徐铭，关洪全
（ 辽宁中医药大学 辽宁 沈阳 110847）
摘 要： 在分析前一阶段抗菌中药实验研究方法的基础上，提出今后进行其研究在方法学方面应注意的几个
问题： ①加强中药在机体水平上抗菌感染作用的研究。②加强中药复方抗菌作用的研究。③研究中药在动物体
内的抗菌作用时，要注意选择适合的感染性疾病动物模型及敏感的检测指标，并应扩大应用感染性疾病动物模型
Discussion on Methodology of Experimental Ｒesearch on Antibacterial Chinese Herbs
HAN Xiaowei，XU Ming，GUAN Hongquan
（ Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，Liaoning China）
在研究抗生素和化学合成抗菌药物抗菌作用的工作 中，为了控制误差，使实验结果准确、可重复性好，人们制定 了一些体外抗菌实验的标准供研究者参考。在中药抗菌作 用的研究中，由于影响中药抗菌作用的因素较多，难以制定 此类标准。卢祥婷［21］等在进行 10 种中药提取物抗念珠菌 体外药敏实验时，药物敏感终点判读参照 CLSI 推荐的微量 液基稀释法（ M27 － A3） 中对微量液体培养基稀释法的标 准，对唑类药物以 50% 抑制作为观察终点，判断最低抑菌 浓度，中药提取物的结果判断参照唑类药物进行的。今后 应根据中药本身以及其抗菌作用的特点，逐步创造条件，尽 早制定相应的中药体外抗菌实验标准。在研究中药体外的 抗细菌作用时应注意以下几个问题。 3． 1 供试菌的种类及株数 在研究抗菌的中药时，有些研 究选用供试菌的种类和株数偏少。虽然有研究表明同一种 中药对于相同菌的不同菌株可表现出几乎一致的抑菌活 性［22］，但大部分情况下，不同菌对同一种抗菌药物的敏感 性常不相同，甚至同一种菌的不同菌株对同一种药物的敏 感性也常有较大差异。因此，今后在研究有应用前景的抗 菌中药时，应进一步扩大供试菌的种类及株数。 3． 2 培养基的种类及含量 一些研究资料表明，培养基的 种类对某些抗菌药物在体外的抗菌活性有一定影响，国外 在研究药物的抗菌活性时，比较重视所使用培养基的种类， 常选用不同的培养基进行研究。所以，今后研究中药的抗 菌作用时，必须充分注意培养基的因素。另外，利用琼脂扩 散法研究抗菌中药时，平皿中培养基的含量也直接影响中 药的抗菌效果，在一定范围内，培养基越多，抑菌环往往就 越小。同时，还应注意培养基中琼脂的含量是否适宜，比如 对固体培养基其软硬度是否适宜，如过软划线接种时培养 基易被划破，过硬会影响菌对营养物质的吸收，不利于菌的 生长繁殖，直接影响抗菌实验的结果［23］。所以今后研究时 也应注意这一问题。 3． 3 接种菌的菌龄与菌量 同一种菌的菌龄不同，对药物 的敏感性常不一致，在研究药物的抗菌作用时，一般应使用
第 35 卷 第 7 期 2017 年7 月
中华中医药学刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 35 No． 7 Jul． 2 0 1 7
DOI： 10． 13193 / j． issn． 1673-7717． 2017． 07． 009
1 加强中药在机体水平上抗菌感染作用的研究 1． 1 提高利用感染性疾病动物模型研究抗菌中药重要性 的认识 研究中药抗菌作用药效的方法主要包括体外试验 和体内试验两大方面。前一阶段抗菌中药的研究，大多数 是在体外进行的［5 － 8］，而利用感染性疾病动物模型在机体 水平上的研究较少。一种抗菌新药的研制过程，在一般情 况下是先做体外试验，对有苗头的药物再进行动物体内试 验，然后再进入临床试验。但抗菌中药的研究与抗生素和 化学合成抗菌药物的研制过程有所不同，绝大多数中药是 经过多年临床应用证明有效的。由于体外抗菌试验的结果 有时与人体内试验的结果差别较大，而在动物体内试验与 人体内试验结果的差别则相对较小。在体外有效的中药进 入机体内未必都有效，相反某些在体外无明显抗菌作用的 药物，进入机体内则可能有明显的疗效。有实验研究结果 表明白矾、白鲜皮、连 翘、山 柰 等 药 材 并 未 检 测 到 抗 菌 活 性［9］，这 与《中 药 大 辞 典 》中 报 道 的 杀 菌 作 用 存 在 差
Key words： researching ideas and methods； Chinese herbs； antibacterial effect； methodology
中 华 中 医 药
1670
学 刊
自古以来，中药在防治感染性疾病中发挥了积极的作 用，为维护人类的健康做出了重大贡献。近年来，广大研究 者对中药的抗菌作用进行了大量实验研究，发现数百种中 草药和多个方剂对某些病原菌具有良好的抗菌作用，并将 这些中药或其有效成分制成了制剂［1 － 4］，用于临床防治感 染性疾病，推动了医疗卫生事业的发展。回顾几十年来抗 菌中药的实验研究工作，虽取得了巨大成就，但在方法学上 也存在着一些不足，本文仅就几个需要注意的问题谈谈粗 浅看法。
结果，必须利用动物感染性疾病模型进行研究［17］。有临床 研究证明，在中医辨证分型的基础上，尝试以益气养阴、清 肺化痰方剂联合西药抗生素治疗细菌性肺炎患者，取得了 较好效果［18］； 李光辉［19］等人采用葛根茯苓汤治疗 80 例结 肠炎患者，腹胀腹泻等临床症状得到了显著改善，总有效率 为 95% ； 关丽华［20］等人应用结肠康治疗经恶唑酮诱导的 溃疡性结肠炎小鼠时，发现经茯苓、白术、黄连等中药治疗 后，可以通过降低小鼠模型一氧化氮（ NO） 、诱导型一氧化 氮合酶（ i NOS） 表达水平而达到治疗作用。这些治疗效果 主要是中药复方的综合作用，如果单用其中的某种单味药， 其疗效可能不如复方。这一点充分表明加强中药复方抗微 生物研究的重要性与可行性。所以，今后除体外抗菌实验 外，还要加强利用感染性疾病动物模型从整体水平上评判 中药复方的疗效。 3 注意体外抗菌实验研究方法的标准化问题
目前国内外广为应用的感染性疾病动物模型的种类较 多，判断药物疗效的指标主要是生存保护率、平均存活天数 和靶器官病变的程度等。就目前常用的模型而言，动物感 染病原菌发病后的病情多较重，一般的中药疗效有限，很难 取得预期效果。因此，利用感染性疾病动物模型研究抗菌 中药时，一方面要注意选择病情相对较轻的模型进行研究， 另一方面还要选择较敏感的指标。据文献报道及笔者的体 会，选用平均存活天数、靶器官病变的程度、靶器官或血液 中活菌的数量作为判断中药疗效的指标比生存保护率易出 现阳性结果［15 － 16］。 1． 3 扩大应用病原菌感染动物模型的种类 从总体上说， 迄今利用病原菌感染动物模型研究中药的抗菌作用还不是 很深入。国内 外 报 道 的 病 原 菌 感 染 动 物 模 型 的 种 类 虽 较 多，但在抗菌中药研究中应用的相对较少。由于不同的病 原菌感染具有不同的特点，对药物的敏感性常有差别，单纯 利用某种模型研究并不能完全反映某一中药整体的抗菌疗 效。因此，今后应根据中药的抗菌谱以及临床应用等情况， 注意扩大应用病原菌感染动物模型的种类进行抗菌中药的 研究。 1． 4 进一步研制新的病原菌感染动物模型 目前研制的 病原菌感染动物模型从总体上来说，其发病后病情多较重， 而中药的作用多较慢，且治疗时会受到抗菌中药剂型的限 制，如水煎剂、丸、散或“粗提物”中抗菌有效成分的含量较 少，进入动物体内往往疗效不显著，其抗菌活性大多数不如 抗生素和化学合成的抗菌药物，所以现有的模型有些不太 适合抗菌中药的研究。因此，今后还要根据中药治疗疾病 的特点，进一步研制新的适合中药研究的病原菌感染动物 模型，尤其是慢性感染性疾病动物模型。 2 加强抗菌中药复方的研究
Abstract： Based on the analysis of the experimental research method of antibacterial Chinese herbs in the first stage， the paper puts forward some problems that should be paid attention to in the future． Study on the antibacterial effect of Chinese herbs in the human body should be focused on． Study on antibacterial action of Chinese herbal compound should be focused on． To study the antibacterial effect of traditional Chinese herbs in animals，the selection of suitable animal model and sensitive detection index should be paid attention to，and it is necessary to expand the application of animal model of infectious disease． To study the antibacterial effect of Chinese herbs in animal in vitro，the types and number of pathogens should be expanded； the type of culture medium，the amount of inoculums，the age of the bacteria and the time to determine the results after inoculation with pathogenic bacteria should be paid attention to． When using agar plate diffusion method，the content of the medium in the flat drawing should be paid attention to．
第 35 卷 第 7 期 2017 年7 月
中华中医药学刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 35 No． 7 Jul． 2 0 1 7
异［10 － 11］； 碘化钾在试管内虽无明显的抗真菌作用，但临床 证明其对某些真菌性疾病具有肯定的疗效［12］； 补中益气汤 主要通过调节机体的免疫功能延长小鼠感染沙门菌强毒株 的存活期，也能延长耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的并 经丝裂霉素处理的免疫抑制小鼠的存活期，并可抑制小鼠 体内细菌的繁殖［13］。由此可见，动物体内试验是检验中药 对感染性疾病的疗效及了解其毒性、吸收、分布、代谢等情 况不可缺少的环节［14］。因此，应进一步提高利用动物模型 在机体水平上研究抗菌中药重要性的认识，加强相关的基 础研究。 1． 2 注意选择适合的感染性疾病动物模型和敏感的指标
的种类进行研究。④研究中药在动物体外的抗菌作用时，应扩大供试菌的种类及株数，注意培养基的种类以及接
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种菌种的菌量、菌龄和接种菌后判定结果的时间，应用平板琼脂扩散法研究时要注意平板中培养基的含量等。
关键词： 研究思路与方法； 中药； 抗菌作用； 方法学
中图分类号： Ｒ285． 5
文献标志码： A
文章编号： 1673-7717（ 2017） 07-1670-03