引物设计总结

引物设计注意事项

引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在已知模板序列时进行PCR扩增的，在某些情况下，比如在构建文库时也会在不知模板的情况下进行设计。这时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。我们通常所指的引物设计都是在已知模板序列的情况下进行（注：首先要确定自己所要扩增的序列）。

引物设计的原则是在扩增特异性和扩增效率这两个标准间取得平衡，所有的引物设计软件都是在这一原则下进行引物设计的。同时，设计引物时也有一些其它的注意事项。

1.引物长度

一般引物长度为15~30bp，常用的为18~27bp（注：引物长度不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74o C，影响TaqDNA聚合酶活性）。决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物长度。有以下公示可以粗略估算引物的退火温度。

在引物长度小于20bp时，Tm=[4(G+C)+2(A+T)]-5℃

在引物长度大于20bp时，Tm=62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

另外，有许多软件也可对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的结果可能具一定差异。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54o C的最短引物可获得最好的效率和特异性。

在引物设计过程中，每增加一个核苷酸，引物的特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸（注：保证引物达到一定的特异性），引物长度的上限并不是很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，退火结合到靶DNA上形成稳定双链模板的效率越低（注：保证引物结合效率）。

2.GC含量：

一般引物中GC含量为40%~60%，过高或过低都不利于反应的发生，G+C 太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带（正反引物中GC含量差异不能过于悬殊）。ATGC最好随机分布（避免连续的GC富集区，GC富集区易引发错误反应），避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。一对引物的GC含量应与Tm值相协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向，则可以在引物的

5，端加适量的A，T或G，C尾巴。

3.退火温度

退火温度需要比解链温度低5o C，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使得PCR特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度。一对引物的退火温度相差4o C~6o C不会影响PCR的产率，但是理想的情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在550C~75O C之间变化。

4.避免扩增模板的二级结构区域

选择扩增片段时，最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验证明，待扩区域自由能（△G）小于58.61KJ/Mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

5.与靶DNA的错配

当被扩增的靶DNA序列较大的时候，一个引物就有可能与靶DNA的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。这个时候有必要先使用BLAST软件进行检测。如下图：

BLAST的使用方法也十分简单，如下图所示。

将引物序列粘贴到1区，将靶DNA序列粘贴到2区，这两者可以互换的，并且BLAST会计算互补、反义链等多种可能，所以不需要用户注意两条链是否都是有义链。如果知道序列在数据库中的GI号也可以直接输入GI号，这样就不用粘贴一大段的序列了。最后在3处点击Align就可以查看引物在靶DNA中是否有多个同源位点了。

可是使用BLAST还是有其不方便的地方。因为它一次只能比较两条序列，那么一对引物就需要分开进行比对。如果存在错配，还需自己计算由于错配形成的片段长度有多大。在下一篇中将介绍一个软件，可以直接将靶DNA和引物输入对产物片段进行预测。

6.引物末端

引物3，段是延伸开始的地方，因此要防止错配就要从这里开始。3，不应超过3个连续的G或C，因为这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。3，端也不能有任何形成二级结构的可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3，端不能发生错配。如扩增编码区域，引物3，端不要终止于密码子的第三位，因密码子的第三位易发生简并，会影响扩增特异性和效率。

7.引物的二级结构

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发卡状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连

续互补碱基不能大于3bp。两引物之间不应该存在互补性，尤其应该避免3，端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

8.为了下一步操作而产生的不完全匹配

5，端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5，修饰包括：加酶切位点；标记生物素，荧光等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一对启动子序列等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还会加大引物二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要做出适当的“牺牲”。

很多时候PCR只是初步克隆，之后我们还需将目的片段亚克隆到各种载体上，那么就需要在PCR这个步骤为下一步的操作设计额外的碱基。以下总结了一些为了亚克隆所要设计的序列：

8.1 添加限制性内切酶酶切位点

添加酶切位点是将PCR产物进行亚克隆使用得最多的手段。一般酶切位点是6个碱基，另外在酶切位点的5，端还需要加2~3个保护碱基。但是不同的酶需要的保护碱基的数目是不相同的，例如：SalI不需要保护碱基，EcorV需要1个，NotI需要2个,HindIII需要3个。其中，在原核表达设计引物时还有一些小技巧，大家可以参考：《原核表达之实验前的分析》，里面一些规则是所有表达都适用的。

有一种说法是在进行PCR反应的同时进行酶切，这样就需要注意一些内切酶在PCR反应中的酶切反应率，见附录。不过这种方法虽然方便但并不推荐，有时候就是把PCR产物回收后酶切再与载体连接效果都不尽理想，同时进行会使出现的原因变得更加复杂，一旦出现问题，分析起来就会更加麻烦

8.2 LIC添加尾巴

LIC的全称是Ligation-Independent cloning，它是Navogen公司专门为其部分的pET载体而发明的一种克隆方法。用LIC 法制备的pET 载体有不互补的12–15 碱基单链粘端，与目的插入片段上相应粘端互补。扩增目的插入片段的引物5'序列要与LIC载体互补。T4 DNA 聚合酶的3'→5'外切活性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。由于只能由制备好的插入片段和载体互相退火形成产