第五章酶的固定化

2） 内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后 传递到酶活性部位时的一种扩散阻力，它与催化 反应同时进行。
载体小而弯曲的细孔是产生内扩散阻力的主 要原因。因此使用低分子量底物，小的粒径、载 体孔尽可能大而直且互相连通，或仅仅将酶固定 在载体表面都可以降低这种内扩散阻力。
对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。
1953年 1969年 1971年 1973年
Grubhofer,Schleith 以聚氨基苯乙烯固定羧肽酶、 淀粉酶、胃蛋白酶
千火田一郎
固定化氨基酰化酶，DL-氨基 酸拆分
第一届国际酶工程 固定化酶：Immobilized
大会
Enzyme
日本
固定大肠杆菌生产天冬氨酸
1979年 1982年 日本
固定化植物细胞：长春花和毛 地黄细胞
Serratia marcescens Aectobcter.sp. 乳酸杆菌与酵母 Bacillus substilis Bacill sp. Clostridium butyicum Rhodospirillium rubrum
（1）离子结合法：通过离子键使酶与载体结 合的固定化方法。
+ -+
+-+ -
-
-
++++++-++ -
--
-
-+-+++++++
载体：DEAE纤维素、 TEAE纤维素、 DEAE葡聚糖凝胶 ……
（2）共价结合法：通过共价键将酶与载体结 合的固定化方法。
载体：纤维素 琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶 甲壳质 氨基酸共聚物 ……
（2）半透膜包埋法 将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小
球内，制成固定化酶. 制备方法： 酶， 水， 乙二胺
癸二酰氯+氯仿
包埋法 优点：结合力牢、活力回收高、底物专一性不变。
缺点：制备较难，载体无法回收、扩散限制。
3.结合法
选择适宜载体，使之通过共价键或离子键 与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。
3
4
Hale Waihona Puke Baidu5 6
7
游离酶：
固定化酶：
四、固定化酶的应用
Go 1.在工、农业生产上的应用 Go 2.在医药、治疗上的应用 Go 3.在分析化学中的应用
1、固定化酶在工农业生产上的应用
产物
酶或细胞
L-氨基酸 果糖浆
氨基酰化酶 葡萄糖异构酶或含该酶菌体
6-APA L-门冬氨酸 L-苹果酸 低乳糖牛奶
优点：操作简单、条件温和、 载体廉价易得、可反复使用。
缺点：结合力不劳、容易脱落。
2.包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中， 使酶固定化的方法称为包埋法。
载体：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、 聚丙烯酰胺……
（1）凝胶包埋法：以各种多孔凝胶为载体，将酶、 细胞或原生质体包埋在凝胶的微孔内的固 定化方法。
原料
乙酰-DL-氨基酸 葡萄糖 青霉素G 反丁烯二酸 反丁烯二酸 牛奶 牛奶 蛋白 桔类果汁 生啤酒 植物油 植物油
产物
类固醇 L-丙氨酸
D-苯甘氨酸 ATP 核苷酸类味 精 乙醇
啤酒
L-亮氨酸 乙酸 乳酸 淀粉酶 杆菌肽 氢气
酶或细胞
固定化方法
原料
含脱氢酶及羟化酶的菌体 含有L-门冬氨酸、β-脱羧酶的菌 体 氨基酰化酶 乙酰激酶 5’-磷酸二酯酶，5’-腺苷酸脱氨酶 Sacharomyces carlsbergensie 或S.Cerevisiae 同上
效应。
3、扩散限制效应
酶固定化使生物催化反应从均相转 化为多相，于是产生了扩散阻力：
1） 外扩散阻力是底物从宏观环 境向酶颗粒表面传递过程中的一种扩 散限制效应，它发生在反应之前，发 生在固定化颗粒周围的液膜层。
它会使底物在固相酶周围形成浓 度梯度，通过增加搅拌速度和底物流 速的方法可以减少外扩散效应。
固定原生质体生产谷氨酸
二、固定化酶的制备
（一）、酶的固定化方法
吸附法
包埋法 结合法
胶体包埋法 半透膜包埋法 离子键结合法 共价键结合法
交联法
热处理法
1.吸附法
吸附法是利用各种固体吸附剂将酶或含酶 菌体吸附在其表面上而使酶固定化的方法。
活性炭、氧化铝、硅藻 土、多孔陶瓷、多孔玻 璃、硅胶、羟基磷灰石。
三 固定化酶的性质
1、分配效应
由于载体和底物的性 质差异引起了微环境和宏 观环境之间的性质不同。 微环境是在固定化酶附近 的局部环境，而将主体溶 液称为宏观环境。由这种 不同造成的底物、产物和 各种效应物在两个环境之 间的不同分配，被称为分 配效应。
2、空间障碍效应
固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体 的空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部 位造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易于底物或效 应物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用, 所造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍
第五章 酶固定化
Go 一、固定化酶发展简史 Go 二、固定化酶制备 Go 三、固定化酶的性质 Go 四、固定化酶反应器 Go 五、固定化酶的应用
游离酶的缺点
1.酶的稳定性较差，在温度、pH、和无 机离子等外界因素的影响下，容易变 性失活。
2.酶一般都是在水溶液中与底物反应， 反应结束后酶难以回收。
3.反应结束后，酶成为产物的杂质。
概念
固定化酶是指固定在载体上并在一定的 空间范围内进行催化反应的酶。固定化酶既 保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不 足之处，具有增强稳定性，可反复或连续使 用以及易于和反应产物分开等显著特点。直 接固定菌体或菌体碎片的，称为固定化菌体 或固定化死细胞。
一、酶固定化的历史
青霉素酰胺酶 含有门冬氨酸的菌体 含有反丁烯二酸酶的菌体 乳糖酶
乳糖
碱性蛋白酶
干蛋白
葡萄糖氧化酶和氧化氢酶
果汁脱苦 啤酒
柚苷酶 木瓜蛋白酶
植物白脱 脂肪酶
脂肪酸
脂肪酶
固定化方法
载体结合法 载体结合法或交联法 载体结合法 胶格包埋法 胶格包埋法 载体结合法 载体结合法 胶格包埋法 载体结合法 载体结合法或包埋法 胶格包埋法 载体结合法
酶分子中可以形成共价键的基团：
氨基、羧基、巯基、羟基、酚基、咪唑基
载体 活泼基团
载体活化的方法
1. 活化
酶辅助蛋白交联法
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
固定化方法与载体的选择
1.必须注意维持酶的催化活性和专一性 2.酶与载体结合牢固 3.载体的机械强度 4.固定化酶要有最小的空间位阻 5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应 6.固定化酶要廉价