功能型生物有机肥研制与开发

客观现象3
烟草土传病害爆发，呈现一支独秀！
2、透过现象看本质1
？
？
拮
抗
病原菌
拮抗菌
2、透过现象看本质2
3、研究获得拮抗菌菌种
第一步：确定病原菌
选择主产区，寻找连作土传病害发生严重田块 寻找典型植株 取样：发病植株 （细菌病害、真菌病害） 分离病原菌 回接试验 症状比较→菌体形态比较→分子鉴定 确定病原菌 研究 保存方法 从菌种保藏中心 研究单位 收集
全国部分省市经济作物种植面积一览
全国部分省经济作物种植面积粗略统计表
省 份 主要经济作物 种植面积 （万亩） 2634.8 5828 2853 1127 288.7 2537 1729.4 2748 16974.3 1351 ≈ 3.8亿亩 市场预测 生物有机肥 (市场占有率1%) （吨） 19647.75 69652 10210 5135 1678.5 20285 15772 13740 91121.5 7200 商品有机肥 (市场占有率2%) （吨） 119233 243360 62590 28840 10281 127710 95472 82578 541362 32680
b
c 香蕉枯萎病病原菌形态特征
d 分离到得的香蕉巴拿马枯萎 病原菌德回接试验
a, b菌落形态；c, d显微镜下形态； c菌丝形态；d大型分生孢子和小型分生孢子
属 4号生理小种 (Fusarium oxysporum f.sp. cubense)
香蕉巴拿马枯萎病发病时病原菌浓度
Nanjing Agricultural University
Nanjing Agricultural University
功能型生物有机肥研制与开发
南 京 农 业 大 学 江苏省产业技术创新战略联盟 国家有机（类）肥料产业技术创新战略联盟
南京农业大学有机（类）肥料研究团队 报告人：杨兴明
Nanjing Agricultural University
目
录
★ 什么是生物有机肥？ ★ 生物有机肥的市场需求？
拮抗菌株的初筛
L-9菌株的拮抗效果
L-25菌株的拮抗效果 L-26菌株的拮抗效果
所筛选的三株效果最好的拮抗菌分别为一株放线菌（L-9菌株）， 两株革兰氏阳性细菌，经生理生化（表 ）与16S rDNA共同鉴定该两 株细菌分别为苏云金芽孢杆菌（L-25）和短短芽孢杆菌(L-26)。
发病机理研究
防治烟草青枯病专性微生物有机肥效果（2008，安徽），收获时， 对照田块（右边-常规复合肥）烟草青枯病发生率78.3%， 施用防病生物有机肥田块（左边-生物有机肥）发生率8.9%。
点接喷雾法初筛
喷雾牛津杯法复筛
拮抗菌筛选
连作土中三株菌QL-5、QL-18、QL-20及它们的混合菌对番茄青枯病的防治能力
施用微生物有机肥防治番茄青枯病的效果
※ 高效拮抗抑制青枯病的菌种-----烟草
a
b
c
d
烟草青枯病病原菌形态特征：a,b菌落形态；c显微镜下形态； d 病灶茎部溢出菌脓
烟草青枯病病 原菌回接实验及 鉴定
Nanjing Agricultural University
南农大团队技术创新点
南农大技术 筛选 技术 发酵 技术 从效果—生态—营养三个层次 综合评价筛选高效菌株 （创新点） 从富营养---粗营养---寡营养 三个层次进行发酵培养、营养 能力适应性驯化 （创新点） 国内外同类技术 仅从实验室效果 筛选高效菌株 仅从富营养状态 下发酵含菌量角 度考虑
≠生物有机肥
☆ 生物有机肥＞高效菌种（菌剂）+有机营养载体
（1+1＞2）
4、思考2：分清生物有机肥难易程度
☆ 最难：抗病生物有机肥（土传病害）
☆ 次之：促生生物有机肥（促进根系活力）
☆ 最容易：提高肥料利用率 （难度：溶磷＞ 解钾＞固氮 ）
Nanjing Agricultural University
★ 怎么研究开发生物有机肥？
★ 如何发挥联盟优势开发生物有机肥？
Nanjing Agricultural University
一、什么是生物有机肥
1、生物有机肥的定义
生物有机肥料是指含有明确功能微生物菌种的一种特 殊肥料，产品中不仅含有腐熟有机肥，而且含有规定数量
的功能菌，是微生物肥料和有机肥的有机统一体，属于微生
高效生防真菌（木霉）菌种资源
Trichoderma pseudokoningii T084
Trichoderma aureoviride T115
Trichoderma spp. 19种，300多株
Trichoderma spp.菌种资源库明细
Clade Harzianum Species Trichoderma aggressivum Hypocrea lixii/Trichoderma harzianum Trichoderma cerinum Hypocrea virens/Trichoderma virens Hypocrea crassa/Trichoderma crassum Trichoderma asperellum Trichoderma hamatum Hypocrea flaviconidia Hypocrea muroiana Hypocrea viridescens/Trichoderma viridescens Hypocrea atroviridis/Trichoderma atroviride Hypocrea koningii/Trichoderma koningii Hypocrea rufa/Trichoderma viride Hypocrea stilbohypoxyli Hypocrea phyllostachydis/Trichoderma phyllostahydis Trichoderma spirale Hypocrea voglmayrii Hypocrea chlorospora/Trichoderma chlorosporum Hypocrea psychrophila Amount 1 12 1 3 1？ 9 2 2 1？ 1？ 3 5 13 1 1？ 1 1？ 1 1
江苏 山东 河南 安徽 浙江 广东 海南 广西 云南 贵州
合 计
≈25万吨
≈135万吨
Nanjing Agricultural University
三、如何研发生物有机肥
1、客观现象1
？
西瓜土传枯萎病爆发、死亡呈现半边疯！
客观现象2
？
山药土传病原菌爆发，死亡呈现簇状分布！
客观现象3
香蕉枯萎病爆发，一支独秀！
4、思考4：生物肥料（菌种接种剂）
我国推广几十年为什么没有很好解决生产中问题！ 功能性菌种在土壤定植技术没有很好解决！ 土壤环境是否合适----？？？ 菌种在土壤里是否有营养------???? 菌种生态竞争能力如何、定植能力如何------???? 生物有机肥技术能够解决功能性微生物菌种 在土壤定植技术难题
多种形式保存→长期保存→定期复壮，分批使用
第二步：寻找高效接抗菌
在主产区，连作土传病害发生严重田块 寻找健康生长植株
健康植株 根系 健康植株 根际土壤 根系表面 消毒处理 选择性培养基 分离单菌落
土壤系列稀释选择性培养基 分离获得单菌落
“＋” 对峙法 试验
初筛 ↓ 复筛 ↓ 盆栽 ↓ 小区试验 ↓ 确定 高效菌株
专门的检测方 法
（简单方法无效）
◇ 有效期≥6个月 （至少6个月）
-------产品在常温条件下，保存6个月后，检测其登记的 菌种数量≥0.2亿个/g。
3、次要技术指标的理解:
◇ 有机质（已经登记的、功能明确的微生物菌种的口粮）
-------不是简单的有机肥吸附，更不是“拉郎配”； 是适合菌种生长、根部定植、功能发挥的口粮、 营养套餐； 是根据研究结果，按照配方调配而成。
物肥料范畴，在农业部登记。
2、生物有机肥技术指标
主要技术指标:
◇ 含有具体明确功能（抗病、促生、溶磷、解钾）菌种 ◇ 有效活菌数（cfu）≥0.2亿个/g ；
；
◇ 有效期≥6个月。
次要技术指标:
◇ 有机质含量≥25％； ◇ 含水量≤30%。
安全指标:
◇ 蛔虫卵、大肠杆菌数、重金属含量等。
3、关键技术指标的理解
◇ 含水量（保证功能菌种存活而设定的必须的含水量）
-------非有机肥指标中含水量的内涵， 事实上腐熟有机肥的含水量应该调整到30%±， 不可以利用生物有机肥水分缓解有机肥水分压力。
4、思考1：生物有机肥是（1+1＞2）
☆ 菌种（菌剂、生物肥料、生物菌剂） ≠生物有机肥
☆ 腐熟有机肥（精致有机肥、商品有机肥）
T5：接种病原菌+香蕉专性微生物有机肥（6号+11号拮抗菌）
防治黄瓜枯萎病盆栽效果
※ 高效拮抗抑制棉花黄萎病菌种
A：原病原菌菌落形态
B：病原菌分生孢子梗及分生孢子形态
棉花黄 萎病发病 浓度
拮抗棉花黄萎病拮抗菌筛选
黄萎病 病原菌
黄萎病 病原菌
HJ-5
DF14
HJ5和DF14菌体透射电镜图，经生理生化和分子鉴定，HJ5、DF14菌株均为芽胞杆菌属
解决问题思路：研制生物有机肥技术路线
抑制土传病原菌菌种资源库
功能菌特征性C、N源的研究
各种腐熟有机肥资源
腐熟有机肥的C、N源营养组成研究
以功能菌的营养特征 为依据 设计筛选营养载体配方 二次发酵技术 （工艺和控制）
活菌数检测
产品制造工艺 （干燥、造粒等）
产品保存期活菌数跟踪
田间试验效果分析
成熟生物有机肥产品生产技术
功能菌在根际定植情况
研制生物有机肥需要解决以下技术问题：
★ 寻找高效菌株 （建立菌种资源库）
-------高效菌株的分离筛选技术 -------功能菌的营养特征和发酵条件研究
★ 功能菌生长营养载体
（有机肥资源利用）
------有机肥快速腐熟及其营养状况分析 ------功能菌生长的有机营养载体配伍技术
载体 技术
根据功能菌的特征性碳源、氮 随机与有机肥进 源筛选合适有机营养载体的配 行简单的混合配 方，进行二次发酵磨合 制 （创新点）
第三步：建立高效拮抗微生物菌种库
南农大团队 长期研究建立的高效拮抗微生物 菌种库
※ 高效拮抗抑制土传枯萎病菌种
病原菌
拮 抗 菌
普通菌株
抑制西瓜枯萎病
盆栽效果
a
T. harzianum SQR-T037 对黄瓜、西瓜枯萎病病原菌菌丝 体的寄生作用
30d
黄瓜、西瓜枯萎病病原菌
菌丝寄生形成空洞
抗病菌种
枯萎病病原菌菌丝 褶皱、变形
枯萎病病原菌
扫描电镜下木霉菌丝体缠绕病原菌菌丝体
抗病菌种菌丝体
枯萎病病原菌细胞质渗漏 细胞裂解死亡
枯萎病 病原菌
抗病菌种 寄生病原菌
◇ 明确功能的菌种（登记时，明确的菌种）
-------不包括堆肥发酵腐熟菌株 （投机取巧？？？） 不包括空气杂菌、土壤杂菌 （乱理解？？？） 不包括功能说不清楚的菌种（如：EM不予登记）。
◇ 有效活菌数
（登记的、明确的、活的菌种数量）
-------非登记的菌种一概不算， 功能不明确的菌种， 死的菌种不算。
拮抗菌株的初筛
拮抗菌株的复筛
N-6菌株的拮抗效果
N-11菌株的拮抗效果
经生理生化与16SrDNA共同鉴定所筛选的两株拮抗菌均为枯草芽孢杆菌
T1：接种病原菌 T2：接种病原菌+广谱性微生物有机肥 T3：接种病原菌+香蕉专性微生物有机肥（6号拮抗菌）
T4：接种病原菌+香蕉专性微生物有机肥（11号拮抗菌）
※ 高效拮抗抑制青枯病的菌种-----番茄
病原菌：茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）菌株QL-Rs1115，从 南京麒麟镇番茄青枯病发病田块发病植株根际和茎部。
图 南京麒麟镇番茄种植地开花坐果期植株受青枯菌侵染后整株萎蔫 （左）；收获期青枯病发病率在90%以上，经济损失严重（右）。
※ 防治山药褐皮病菌种
山药褐皮病菌病菌
抗山药褐皮病菌种研究
L-9菌株的拮抗效果
L-25菌株的拮抗效果 L-26菌株的拮抗效果
※ 高效竞争抑制土传病害真菌菌种（木霉）
病原菌
木霉T117 抑制黄瓜、西瓜病原菌尖孢镰刀菌高效菌株T117 病原菌
木霉T98 粘帚霉G108 木霉抑制尖孢镰刀菌高效菌株T98 粘帚霉抑制尖孢镰刀菌高效菌株G108
★ 功能菌与有机营养的适应性 ------二次发酵技术 （建立合适生产工艺）
Fra Baidu bibliotek
Nanjing Agricultural University
二、生物有机肥市场需求
全国每年有5亿亩左右经济作物种植面积
(土豆、棉花、花生、瓜果蔬菜)
全国每年有2.7亿亩左右瓜果蔬菜种植面积
连作障碍日趋严重、土传病害不断爆发