子宫内膜腺上皮及基质细胞分离_培养作为子宫内膜异位症体外细胞模型的探索

・论著・子宫内膜腺上皮及基质细胞分离、培养作为

子宫内膜异位症体外细胞模型的探索Ξ

谭先杰,刘东远,郎景和,沈　铿,冷金花,孙大为,朱　兰,刘珠凤,许秀英

(北京协和医院妇产科,北京　100730)

【摘要】　目的:探索在位子宫内膜腺上皮及基质细胞的分离、培养作为子宫内膜异位

症(E Ms)的体外细胞模型。方法:通过酶解、系列过滤、沉降及贴壁纯化等技术,分离、纯

化及培养15份E Ms患者的在位子宫内膜腺上皮细胞及其基质细胞,并拟传代。结果:11

份标本获得成功;每1g新鲜子宫内膜组织可得到(8～12)×106个原代基质细胞及(4～8)

×106个原代腺上皮细胞;基质细胞纯度率可达95%以上,腺上皮细胞的纯度率约为

90%。基质细胞可以有限的传代,腺上皮细胞不能传代。通过改良步骤,可提高基质细胞

的产量。结论:在位子宫内膜腺上皮及其基质细胞的分离、培养可作为E Ms的体外细胞

模型之一。

【关键词】子宫内膜异位症;子宫内膜;上皮细胞;基质细胞;体外细胞模型

中图分类号:R711.71　文献标识码:A　文章编号:1004-7379(2002)01-0030-03

The exploration of the isolation and culture of eutopic endometrial glandular epithelial cell

and its strom al cell as an in vitro model of endometriosis.Tan Xianjie,Liu Dongyuan,Lang

Jinghe,et al.Department o f Obstetrics and Gynecology,Peking Union Medical College Hospital,Bei2

jing100730

【Abstract】Objective:T o explore the division and culture of eutopic endometrial glandular

cells and their stromal cells as the in vitro cell m odel of endometriois(E Ms).Methods:Enzym olysis,

serial filtration,sedimentation,and pasted wall purification were used to is olate,purify and culture

the endometrial stromal cells in15sam ples of endometrium from patients with E Ms.R esults:The

endometrial cell culture was success fully established in11of15endometrium sam ples.From one

gramme of fresh endometrial tissue,the yields of primary culture of stromal cells and glandular ep2

ithelial cells were about(8～12)×106and(4～8)×106respectively.The purities of stromal cells

and glandular epithelial cells were95%and90%respectively.Stromal cell could be trans ferred into

several passage.H owever,glandular epithelial cells could not be trans ferred.The yields of stromal

cells could be significantly increased by m odification of the procedure.Conclusion:The is olation

and culture of endometrial glandular epithelial cells and their stromal cell can be used as one of the

in vitro cell m odels of E Ms.

【K ey w ords】Endometriosis;Endometrium;E pithelial cell;Stromal cell;In vitro cell m odel

子宫内膜异位症(end ometriosis,E Ms)的发病机理迄今未明。E Ms的体外模型是研究其发病机理的重要手段,国外学者对此进行了探索,但尚未得到明确的结果[125]。本研究的目的是分离和培养E Ms患者在位子宫内膜组织的腺上皮细胞及其基质细胞,探讨以此作为E Ms体外细胞培养模型的合理性及价值。

1　资料与方法

1.1　临床资料及子宫内膜组织标本的获取　留取1999年5月至1999年7月在本院妇产科因E Ms接受手术15例的子宫内膜,20～44岁,无内科合并症,月经规律,术前3个月内未用过激素治疗。5例子宫内膜标本是在腹腔镜手术前经阴道刮

03现代妇产科进展2002年1月第11卷第1期　Prog Obstet G ynecol,Jan.2002,V ol.11,N o.1

Ξ国家自然科学基金资助课题(39830350)

宫获得,10例标本是在剖腹手术切除子宫后直接刮取。将子宫内膜标本用无菌盐水冲洗后,放入冰浴的F212/DME M培养液(F D培养液)中,尽快(<2h)进行分离培养操作。

1.2　主要试剂及仪器　F212培养基、DME M培养基、胶原酶等购自美国G ibco/Brl公司。DNaseⅠ系美国S igma公司产。超净工作台为北京半导体设备一厂产,细胞离心机为北京医疗仪器厂产,C O2细胞培养箱为美国Reveco公司产,倒置相差显微镜系日本Olympus公司产,细胞过滤网购自浙江宁海精密仪器厂,细胞培养瓶、皿、多孔板等为美国C ostar公司产。鼠抗人波形蛋白(vimentin)抗体、鼠抗人细胞角蛋白(cy2 tokeratin)抗体、异硫氰酸荧光素(FIT C)标记的羊抗小鼠抗体均购自北京中山生物公司。

1.3　方法　参照Ryan等[5]及中国科学院动物研究所的方法,略有改动。

1.3.1　子宫内膜腺上皮细胞及其基质细胞的分离和原代培养　(1)将子宫内膜组织剪成约1mm3,加入胶原酶(终浓度1mg/ml),37℃恒温水浴摇床中消化1h后,加入DNaseⅠ(终浓度15U/ml),继续消化30min;(2)700r/min离心7min,弃上清液,用FD培养液洗涤2次,经100目(孔径150μm)和200目(孔径74μm)细胞滤网过滤。200目滤网上的细胞团(主要为腺体细胞)的处理见后;(3)将滤液(主要为基质细胞)经1000r/min离心7min,用适量FD培养液悬浮细胞。制作

3.0%及1.5%的牛血清白蛋白(BS A)梯度,将细胞悬液铺于梯度层上,室温沉降20～30min。吸弃上层BS A液,用FD培养液洗涤2遍;(4)用适量FD培养液悬浮细胞,过360目(孔径40μm)及500目(孔径30μm)不锈钢滤网。1000r/min离心滤液7min,弃上清,再用5～10ml FD培养液悬浮,计数细胞,并用台盼蓝外排实验测定细胞活力。为提高基质细胞产量,对5份子宫内膜组织标本不进行步骤(4)的操作,即不再进行更小孔径的细胞筛过滤(改良法)。将细胞以5×105/ml的密度接种于含10%胎牛血清的FD培养液中,置37℃5% C O2细胞培养箱中培养;(5)反洗200目滤网上的细胞(主要为腺上皮细胞),700r/min离心5min,弃上清,适量FD悬浮。将细胞悬液铺于装有8ml FD培养液的15ml玻璃离心管中,反复重力沉降3～4次,每次10min,使腺细胞团沉降到底层;

(6)用含10%胎牛血清的FD培养液悬浮腺体细胞团后,接种于玻璃培养皿中,待混杂其中的基质细胞贴壁,3h后吸出腺细胞团,磷酸盐缓冲液(P BS)离心洗3遍,用含0.02%乙二胺四乙酸(E DT A)的0.025%的胰酶消化数分钟,使腺细胞团分散成单个细胞。以5×105/ml的密度将细胞接种于含有10%胎牛血清的FD培养液中,置37℃5%C O2细胞培养箱中培养。

1.3.2　子宫内膜腺上皮及基质细胞的形态及纯度鉴定　(1)倒置相差显微镜观察上述细胞,比较腺上皮细胞与间质细胞的形态学差异;(2)免疫细胞化学鉴定:用细胞角蛋白及波形蛋白抗体对腺上皮细胞及间质细胞进行免疫染色。操作按照说明书进行。一抗波形蛋白抗体的工作浓度为1: 400,细胞角蛋白抗体的工作浓度为1:800。二抗FIT C标记的羊抗小鼠抗体的工作浓度为1:100。

1.3.3　子宫内膜腺上皮细胞及基质细胞的传代　当基质细胞铺满生长后,用0.03%E DT A进行传代。腺上皮细胞则用含0.03%E DT A的0.025%胰酶进行传代。2　结　果

2.1　子宫内膜基质细胞及腺上皮细胞分离、培养成功率及细胞产量　分离培养了15份子宫内膜标本, 11份成功。4份不成功的原因为:污染的2份均为通过刮宫取得的子宫内膜标本;细胞损失多1份,细胞存活低(<5%)1份。每1g子宫内膜组织经酶解、系列过滤及沉降后,可得到(8～12)×106个基质细胞及(4～8)×106个腺上皮细胞,细胞成活率均约90%。从增殖期子宫内膜分离得到的细胞中基质细胞比例较多,从分泌期子宫内膜分离得到的细胞中主要为腺上皮细胞。使用改良法分离基质细胞,每1g子宫内膜组织能得到(15～20)×106个基质细胞,细胞存活率≥95%。

2.2　子宫内膜上皮细胞及基质细胞的形态学特点　倒置相差显微镜检查显示,腺上皮细胞外形似蝌蚪,细胞轮廓清晰,核较大且明显,细胞之间有小丝状物连接,且常围绕成细胞小团。基质细胞较扁平,呈纺锤状,外形轮廓不甚清楚,核不明显,细胞之间平行排列居多。

2.3　子宫内膜上皮细胞及基质细胞的免疫细胞化学鉴定　用对上皮细胞特异的细胞角蛋白及对基质细胞特异的骨架蛋白波形蛋白抗体进行染色,结果表明,原代培养的子宫内膜腺上皮细胞中,细胞角蛋白染色阳性占绝大多数,波形蛋白染色阳性细胞很少,纯度率约90%。原代培养的基质细胞中,细胞角蛋白染色阴性,波形蛋白染色阳性,纯度率达95%以上。改良法分离并培养的原代基质细胞,其纯度率为85%,经过2次传代后,纯度率可达95%以上。

2.4　分离培养的子宫内膜基质细胞及腺上皮细胞的生物学特点　原代培养的子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞在接种后3～8天接近铺满。基质细胞可用0.03%E DT A传代,传代后3～5天铺满,10代以内其形态基本不变。如果不对原代培养的细胞传代,则细胞铺满后其形态会发生改变,5天后外形难以辨认。腺上皮细胞的传代未能成功,即使分瓶培养,细胞数亦不增加,反而逐渐减少。腺上皮细胞在铺满6天后,失去典型的外形。

3　讨　论

3.1　子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞的分离培养作为E Ms体外细胞模型的合理性及其意义　疾病的体外模型是研究发病机理的重要手段。在猕猴中建立E Ms整体模型是理想的途径,但价格昂贵且实验动物缺乏,应用受到限制。异位或在位子宫内膜组织块的培养亦是E Ms体外模型之一[6],它能提供细胞在组织原位的某些信息,对研究异位病灶的侵袭和粘附过程有一定价值。但由于异位和在位子宫内膜组织均由腺上皮细胞、基质细胞及免疫细胞等

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