关于目的基因的制备 (2)课件
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• 荧光实时定量PCR技术是指在PCR反应体系 中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监 测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知 模板进行定量分析的方法 。
目的基因的获取
1 基因组DNA片断化 2 PCR技术于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。
➢ 缺点：目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I BamH I
BamH I
gene
1.2 机械切割法
1）超声波 超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约
300bp的随机片断。 2）高速搅拌
1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机 片断。
低浓度引物
高浓度引物
4）RT-PCR:
• 提取组织或细胞中的总RNA
• 以其中的mRNA作为模 板，以 Oligo（dT）或 随 机引物 或 基因特异性为引 物，利用逆转录酶反转录 成cDNA。
• 以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检 测基因表达
5）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上 引物的PCR称，其结果是产生多个PCR产物， 用于检测特定基因序列的存在或缺失。
目的基因的获取
1 基因组DNA片断化 2 PCR技术se Chain Reaction
（1）反应体系：
含有目的基因或序列的DNA模板 热稳定的DNA聚合酶（Taq酶） 一对脱氧寡核苷酸引物（primer） 4种脱氧核苷三磷酸(dNTP) Buffer及Mg 2+等
粘性末端 连接
平末端
接头或
T-A
连接 衔接物分子 克隆
导入宿 主细胞
重组噬菌体 DNA的转染
重组质粒 的转化
重组噬菌体DNA或柯斯质粒 体外包装成噬菌体颗粒的转导
筛选
遗传标 记检测
转译 筛选
结构分 免疫学 析筛选 筛选
核酸杂 交筛选
免疫印 迹筛选
目的基因序列测定
经典原核克隆体系流程图
目的基因的获取
引物
电 泳
6）原位PCR
a. 将样品组织切片或细胞涂片，然后固定在载 玻片上；
b. 加热变性，加引物、dNTP、TaqDNA聚合酶 到载玻片上
c. 在原位 PCR仪内进行PCR扩增、检测。 d. 可以检测组织细胞中微量DNA或RNA，且可
精确定位
人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片
7）定量PCR：
的PCR ： 套式PCR、反向PCR、不对称PCR、 多重PCR、锚定PCR、
长程PCR、反转录PCR、荧光定量PCR 和原位PCR等。
1）Nested pcr （套式PCR）
特点: 需要设计两对引物，一对引物扩增稍长片 段，在这一扩增范围内再设计一对引物，扩增的 产物是以第一对引物的产物为模版
套式PCR 通过内外引物进行两次扩增，大大提
高了检测的敏感性
2） 反向PCR（Inverse PCR）
基本原理：
扩增一段已知序列旁侧的DNA，在引物外侧合成 DNA。
未知序列
已知序列
未知序列
连接酶
3）不对称PCR
目的：扩增产生特异长度的单链DNA。
方法：采用两种不同浓度的引物，最佳比例一 般是0.01∶0.5μM。
（2）基本工作原理
Template DNA 5
5 5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
5 5
5 5
Cycle 2
5 5
5
5
5
5
5 5
5 5
5 5
Cycle 355555
5
5
5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的 含量可以扩大100万倍以上。
（3）PCR的基本反应步骤
变性
95˚C
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
2 利用PCR扩增目的基因
如果知道目的基因的全序列或其两侧的序列，可 以合成一对与模板DNA 互补的引物，利用PCR技 术扩增出含目的基因的DNA 片段。
局限性：
必须知道侧接靶序列的核苷酸序列，以制备引物。
常规PCR 扩增片段一般在lkb 以内。 未知序列的目的基因和大片段基因的扩增，则需要特殊类型
关于目的基因的制备 (2)
目的基因：那些已被或者准备要分离、改 造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，编 码蛋白质（酶）的结构基因。
外源基因：插入到载体内的那个特定的片 段基因。
含目的基因 片段的获得
核酸限制 内切酶消化
机械切割
双链 cDNA合成
直接 化学合成
PCR 扩增
体外重组
同聚物加尾 法连接
3.2 DNA片断的组装
化学合成的DNA片断一般在200bp以内。 3.2.1 互补连接法 1）互补配对
预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同 片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。 2）5’端磷酸化
用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。 （合成的DNA单链的5’端是-OH）
3）连接酶连成完整双链
3 化学合成法获取目的基因
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
基因的化学合成
20世纪70年代，Khorana提出， 提出体外扩增DNA
1922-）印度-美国化学家 遗传密码的破译，获 得1968年诺贝尔医学 和生理学奖。
3.1 DNA合成仪的基 本工作原理是：
将要合成的DNA片段3’端的第一个核苷酸 固定于不溶性载体上．
该核苷酸开始与另一核苷酸进行缩合反应， 形成二核苷酸分子
通过酸或碱洗脱其一端的保护基团，再次 与另一个5 ’或3’保护的核苷酸分子进行第 二次缩合反应，形成三核苷酸分子；
再用同样的步骤与下一个核苷酸进行循环 反应。
接长的链始终被固定在不溶的固相载体上， 合成结束后，将寡核苷酸链从固相载体上 洗脱下来。
1 基因组DNA片断化 2 PCR技术.1 限制性内切核酸酶酶切法 该法适于从简单基因组中分离目的基因，如质粒和病
毒等DNA 。
BamH I 和EcoR I 酶切，可获得目的基因。
T4多核苷酸激酶 使5’-OH磷酸化 T4 DNA连接酶
完整的DNA双链
3.2.2 互补延伸连接法
目的基因的获取
1 基因组DNA片断化 2 PCR技术于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。
➢ 缺点：目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I BamH I
BamH I
gene
1.2 机械切割法
1）超声波 超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约
300bp的随机片断。 2）高速搅拌
1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机 片断。
低浓度引物
高浓度引物
4）RT-PCR:
• 提取组织或细胞中的总RNA
• 以其中的mRNA作为模 板，以 Oligo（dT）或 随 机引物 或 基因特异性为引 物，利用逆转录酶反转录 成cDNA。
• 以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检 测基因表达
5）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上 引物的PCR称，其结果是产生多个PCR产物， 用于检测特定基因序列的存在或缺失。
目的基因的获取
1 基因组DNA片断化 2 PCR技术se Chain Reaction
（1）反应体系：
含有目的基因或序列的DNA模板 热稳定的DNA聚合酶（Taq酶） 一对脱氧寡核苷酸引物（primer） 4种脱氧核苷三磷酸(dNTP) Buffer及Mg 2+等
粘性末端 连接
平末端
接头或
T-A
连接 衔接物分子 克隆
导入宿 主细胞
重组噬菌体 DNA的转染
重组质粒 的转化
重组噬菌体DNA或柯斯质粒 体外包装成噬菌体颗粒的转导
筛选
遗传标 记检测
转译 筛选
结构分 免疫学 析筛选 筛选
核酸杂 交筛选
免疫印 迹筛选
目的基因序列测定
经典原核克隆体系流程图
目的基因的获取
引物
电 泳
6）原位PCR
a. 将样品组织切片或细胞涂片，然后固定在载 玻片上；
b. 加热变性，加引物、dNTP、TaqDNA聚合酶 到载玻片上
c. 在原位 PCR仪内进行PCR扩增、检测。 d. 可以检测组织细胞中微量DNA或RNA，且可
精确定位
人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片
7）定量PCR：
的PCR ： 套式PCR、反向PCR、不对称PCR、 多重PCR、锚定PCR、
长程PCR、反转录PCR、荧光定量PCR 和原位PCR等。
1）Nested pcr （套式PCR）
特点: 需要设计两对引物，一对引物扩增稍长片 段，在这一扩增范围内再设计一对引物，扩增的 产物是以第一对引物的产物为模版
套式PCR 通过内外引物进行两次扩增，大大提
高了检测的敏感性
2） 反向PCR（Inverse PCR）
基本原理：
扩增一段已知序列旁侧的DNA，在引物外侧合成 DNA。
未知序列
已知序列
未知序列
连接酶
3）不对称PCR
目的：扩增产生特异长度的单链DNA。
方法：采用两种不同浓度的引物，最佳比例一 般是0.01∶0.5μM。
（2）基本工作原理
Template DNA 5
5 5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
5 5
5 5
Cycle 2
5 5
5
5
5
5
5 5
5 5
5 5
Cycle 355555
5
5
5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的 含量可以扩大100万倍以上。
（3）PCR的基本反应步骤
变性
95˚C
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
2 利用PCR扩增目的基因
如果知道目的基因的全序列或其两侧的序列，可 以合成一对与模板DNA 互补的引物，利用PCR技 术扩增出含目的基因的DNA 片段。
局限性：
必须知道侧接靶序列的核苷酸序列，以制备引物。
常规PCR 扩增片段一般在lkb 以内。 未知序列的目的基因和大片段基因的扩增，则需要特殊类型
关于目的基因的制备 (2)
目的基因：那些已被或者准备要分离、改 造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，编 码蛋白质（酶）的结构基因。
外源基因：插入到载体内的那个特定的片 段基因。
含目的基因 片段的获得
核酸限制 内切酶消化
机械切割
双链 cDNA合成
直接 化学合成
PCR 扩增
体外重组
同聚物加尾 法连接
3.2 DNA片断的组装
化学合成的DNA片断一般在200bp以内。 3.2.1 互补连接法 1）互补配对
预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同 片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。 2）5’端磷酸化
用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。 （合成的DNA单链的5’端是-OH）
3）连接酶连成完整双链
3 化学合成法获取目的基因
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
基因的化学合成
20世纪70年代，Khorana提出， 提出体外扩增DNA
1922-）印度-美国化学家 遗传密码的破译，获 得1968年诺贝尔医学 和生理学奖。
3.1 DNA合成仪的基 本工作原理是：
将要合成的DNA片段3’端的第一个核苷酸 固定于不溶性载体上．
该核苷酸开始与另一核苷酸进行缩合反应， 形成二核苷酸分子
通过酸或碱洗脱其一端的保护基团，再次 与另一个5 ’或3’保护的核苷酸分子进行第 二次缩合反应，形成三核苷酸分子；
再用同样的步骤与下一个核苷酸进行循环 反应。
接长的链始终被固定在不溶的固相载体上， 合成结束后，将寡核苷酸链从固相载体上 洗脱下来。
1 基因组DNA片断化 2 PCR技术.1 限制性内切核酸酶酶切法 该法适于从简单基因组中分离目的基因，如质粒和病
毒等DNA 。
BamH I 和EcoR I 酶切，可获得目的基因。
T4多核苷酸激酶 使5’-OH磷酸化 T4 DNA连接酶
完整的DNA双链
3.2.2 互补延伸连接法