目的基因的制备基因文库法
目的基因的4种获取方法
目的基因的4种获取方法
1、从基因文库中获取目的基因；
2、cDNA文库；
3、反转录法；
4、人工合成法。
目的基因，也称靶标基因，是指在实验中研究或操纵的特定基因。
在基因克隆过程中目的基因就是要分离、纯化、克隆并转化到生物体的那个可以带来预期表型性状如抗虫或耐除草剂的基因。
目的基因获得方法是取得含有所需生物学功能或编码所需产物结构基因的DNA片段的方法。
1969年贝克威思等从大肠杆菌中分离出了乳糖操纵子DNA，以后有不少科学家用生物学方法、物理化学方法分离出许多纯化的基因。
但总的来看为数不多。
1970年首次完成了77对碱基的酵母丙氨酸tRNA基因的全合成；1973年又合成了126对碱基的酪氨酸tRNA的结构基因。
但上述两次合成的基因都不能得到表达。
1976年8月成功地合成了能表达功能的人工基因——193对碱基的大肠杆菌酪氨酸tRNA基因。
自此以后人工合成基因的报道不断出现。
目的基因的制备基因文库法ppt课件
组织或细胞染色体DNA 限带的所有基 因组DNA片段的集合.
克隆载体 重组DNA分子
受体菌 含重组分子的转化菌
genomic library
每个细胞含有一个基因组 DNA片段与载体的重组DNA分 子，许多细胞组成一个含有基 因组的色概率基因 该种生物所有基因 应用范围 ◆ 基因原始结构功能的研究 ◆ 对比分析内含子、外显子及调控区域 ◆ /46
逆转录
以单链RNA为模板合成双链DNA的反应。
DNA mRNA
14/46
逆转录病毒细胞内的逆转录现象：
RNA 模板 逆转录酶
RNA酶
DNA-RNA 杂化双链
Байду номын сангаас
单链DNA
双链DNA
逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样具
有遗传物质的传代与表达功能。
15/46
逆转录酶的应用:
应用于基因工程
基因
mRNA 蛋白质多肽链
7/46
2.经验值
Transcription 从cDNA中获得的是经过剪切去除内含子的基因。
ln(1－P)
start codon Plasmid or phage
N=
非翻译区的序列特征对基因的表达具有重要的调控作用，编码序列则是合成基因产物—蛋白质模板。
ln(1－f/g) 某细胞的mRNA分子数为500 000，某个丰度为3500拷贝/细胞的mRNA基因，最小值为500 000/3500=143，丰度为14拷贝/细胞的mRNA
58330
人
3.2×109
320000
1473652
128000
589459
71111
327476
10/46
目的基因的制备和基因克隆的筛选
contents
目录
• 引言 • 目的基因的制备 • 筛选策略与方法 • 实验结果与数据分析 • 结论与展望
01 引言
目的基因的重要性
决定生物性状
目的基因是生物体内控制特定性 状表达的关键基因，其序列和表 达水平直接影响生物的表型特征。
潜在应用价值
目的基因往往与生物体的生长、 发育、代谢等关键过程密切相关， 因此具有潜在的应用价值，如用 于基因工程、生物制药等领域。
限制性内切酶酶切分析
利用限制性内切酶对DNA进行酶切，通过凝胶电泳分析酶切片段的大小和数量，判断 目的基因是否插入到载体中。
Southern杂交分析
将酶切后的DNA片段转移到固相支持物上，与特异性探针进行杂交，通过放射自显影 或化学发光等方法检测杂交信号，确定目的基因的存在和位置。
PCR筛选
菌落PCR筛选
05 结论与展望
实验结论总结
成功制备了目的基因
通过PCR扩增和基因合成等方法，成功获得了所需的目的 基因片段，为后续实验提供了基础。
建立了基因克隆筛选体系
通过构建重组质粒、转化宿主细胞、筛选阳性克隆等步骤， 成功建立了基因克隆的筛选体系，为后续基因功能研究提 供了有效手段。
验证了基因功能
通过基因表达分析、蛋白互作研究等方法，初步验证了目 的基因在细胞中的功能和作用机制。
重组DNA的转化与扩增
重组DNA的转化
将重组DNA分子导入到合适的宿主细胞中，如细菌、酵母或哺乳动物细胞等，使其获得新的遗传特性 。
重组DNA的扩增
通过选择培养基筛选阳性克隆，并进行扩大培养，以获得足够的重组DNA分子用于后续实验。同时， 可以通过PCR等方法对重组DNA进行进一步验证和鉴定。
目的基因的克隆与基因文库的构建
mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，
分离纯化困难
仅限于克隆蛋白质编e Chain Reaction）法，又称为聚合酶
链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序
使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的
基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必
需的双引物
PCR法定向扩增目的基因的基本原理
C PCR法
5‘
5‘
目的基因
5‘
变性
加热
5‘
5‘
引物
退火
5‘
5‘
底物
聚合
5‘
5‘
5‘
5‘
加热
变性
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
克隆入合适的载体
Klenow酶聚合
化学合成法的基本战略
全基因合成
1
混合退火
2
T4-DNA连接酶连接
3
克隆入合适的载体
4
Klenow酶聚合
5
大片段酶促法： 根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段
6
化学合成法的基本战略
全基因合成
上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%
DNA文库的构建和目的基因的筛选
按照外源DNA片段的来源来分：基因组、 片段的来源来分：基因组、 按照外电泳
色 体 文 库 构 建
红色Ura+,Try+转化子菌落（四）基因组的筛选利用同源探针克隆基因
三、cDNA的构建 的构建构建cDNA应满足的条的筛选（一）构建cDNA应满足的条件 构建 应满足的条件
的代表性 重组cDNA的序列完整性 的序制备 的制备 细胞总 及mRNA的分离 的分离 cDNA第一链的合 第一链的合 成 双链cDNA链的合 链的合 双链 成 与载体的连接 噬菌体颗粒的大于研究基因的平均长度 含有相邻DNA片段的独立克隆间 片段的独立克隆间 含有相邻 克隆片段易于从载体上完整卸下最好不带任何载体序列 重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。 重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。ຫໍສະໝຸດ （二）基因组的构建过程
基因组DNA的分离制备 的分离制备 基因组 基因组DNA的片段化 基因组 的片段化 载体制备 重组连接 噬菌体离体包装 重组噬菌体感 X
B
Ori
X
ARS1
pYAC4
酵 母
TRP1 CEN4 Sup4 S E
Sm
胰岛素目的基因的获取方法
胰岛素目的基因的获取方法一、基因文库法基因文库法是一种通过构建基因文库来获取目的基因的方法。
基因文库是指将基因组或特定基因的DNA片段克隆到表达载体上，形成的基因重组分子集合。
通过筛选文库，可以获得特定的目的基因。
基因文库法包括基因组文库和cDNA文库，其中cDNA文库构建较为简单，应用更为广泛。
二、化学合成法化学合成法是一种通过化学手段合成目的基因的方法。
在已知目的基因序列的基础上，利用DNA合成仪，按照碱基互补配对原则，合成目的基因的DNA片段。
化学合成法的优点是快速、准确、特异性高，适用于小片段DNA 的合成。
但是，对于大片段DNA的合成，化学合成法存在难度和限制。
三、RT-PCR法RT-PCR法（逆转录-聚合酶链式反应）是一种通过逆转录和PCR技术获取目的基因的方法。
该方法首先将RNA逆转录为cDNA，然后利用PCR技术扩增目的基因片段。
RT-PCR法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，广泛应用于基因克隆、基因表达和基因突变研究等领域。
四、基因定点诱变技术基因定点诱变技术是一种通过诱变手段获取目的基因的方法。
该方法利用定点诱变技术，如寡核苷酸定向诱变技术（ODT）和锌指核酸酶技术（ZFNs），对特定基因位点进行突变，从而获取具有特定变异特征的目的基因。
基因定点诱变技术广泛应用于基因功能研究和遗传性疾病治疗等领域。
五、基因重组技术基因重组技术是一种通过构建重组载体获取目的基因的方法。
该方法将目的基因插入到载体中，形成重组分子，然后将重组分子导入到宿主细胞中，通过筛选和分离，获得含有目的基因的表达产物。
基因重组技术广泛应用于基因克隆、基因表达和蛋白质工程等领域。
六、基因合成技术基因合成技术是一种通过合成手段获取目的基因的方法。
该方法利用化学合成或酶促合成技术，按照目的基因的序列，合成完整的基因片段。
基因合成技术具有快速、准确、特异性高等优点，适用于小片段DNA的合成，广泛应用于基因克隆、基因表达和蛋白质工程等领域。
基因工程 第五章目的基因的获取
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入1220个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶 合成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA mRNA 5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶 Oligo dT引物
5’
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ：
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。
随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法 （1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I
BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。 （1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。
基因文库构建的过程、原理及方法
基因⽂库构建的过程、原理及⽅法基因⽂库构建的过程、原理及⽅法1 cDNA ⽂库的构建1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。
经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物，或者⽤随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得⽂库。
其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定)，要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库，获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。
由于RNA 酶存在所有的⽣物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。
在获得⾼质量的 mRNA 后，⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(⽤ RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应)，合成接头的加⼊、将双链DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断，扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。
这⾥强调的是对载体的选择，常规⽤的是λ噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可⽤来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。
1.2 cDNA 全长⽂库经典 cDNA ⽂库的构建虽然⾼效、简便，但⽂库克隆的⽚段⼀般较⼩，单个克隆上的 DNA⽚段太短，所能提供的基因信息很少，⼤多需要⼏个克隆才能覆盖⼀个完整的全基因的 cDNA。
为了克隆到真正的 cDNA 全长，建⽴富含全长的 cDNA⽂库具有重要意义。
为此，必须克服仅⽤ mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作⽤特点所导致的局限性。
基因文库的构建
（2）cDNA与载体相连
cDNA与一个载体在T4连接酶作用下以粘末端 互相连接，即为重组DNA 分子。
（3）导入宿主细胞 重组体在一定条件下导入宿主细胞培
养或保存。 宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆
体的寡核苷酸链为探针）
2. mRNA比基因组中基因少, 因此筛选某一特 定功能基因工作量较小。
3. mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利 于获得较多的模板。（转录特征）
4. 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白
5. 不同种类不同状态的细胞的cDNA不同 6. 不能研究基因组的结构功能
构建cDNA1.制备mRNA凝胶阻滞法
DNase Ⅰ足迹法
4.7.1 凝胶阻滞实验
又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出现的用于 在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊 的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点， 也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质定长度的DNA片段克隆到某种载体上发育时期所转录的mRNA 经逆转录形成的cDNA片段与某种载体ene pool)：某一生物群体所拥有的全部基因。
4. 筛选目的基因
原核细胞不可用来作为基因的表达系统 （无转录后加工）。
原核细胞基因库——只能用核酸探针杂 交筛选目反转录酶的作 用下将点：
1. cDNA无内含子, 长度较基因组基因小, 使操皿内所形成的菌落或噬菌斑）转印到硝酸 纤维素膜上，碱解后加带标记的探针进行杂交，能显 示特异结合探针的点（克隆）便是目的基因所在处。 确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取，再用限制性 酶切出cDNA基因片断，即为目的基因。（如图）
溶菌、使DNA 暴露
第四章 目的基因的制取
一个自身环化的插入物不会带来麻烦。因为它 不会产生氨苄抗性，而那些在转化过程中获得
环化DNA的菌株将无法在氨苄平板上生长。
2.片段与载体的连接形成重组DNA分子
相容性末端直接连接 不匹配末端的连接
非互补粘性末端DNA分子间的连接
在一定的反应条件下，用T4 DNA连接酶仍然可以 将平末端的DNA片段连接起来。
重组DNA分子 受体菌
含重组分子的转化菌
1.染色体DNA的切断
超声波处理：片段长度均一，大小可控，
平头末端。
全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于
连接，但有可能使目的基因断开，大小不 可控
DNA的限制酶切
基因组DNA的片段化
a.不同的限制酶酶切基因组产生不同长度的片段
b. 不同的限制酶酶切同一个基因组产生不同数目的DNA片段
Four-base enzyme
Six-base enzyme
Eight-base enzyme
限制酶切位点
cos L R cos
真核生物染 色体DNA
限制酶消化
cos L 左臂
限制酶部分消化
除去中间片段
R cos 右臂
~20 Kb DNA 片段
外源DNA与载体DNA混合
cos L ~20 Kb 外源 DNA 片段 R cos
如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则 选择能使目的基因表达的受体细胞。
4.筛选含有目的基因的目的重组子
利用遗传标记基因鉴定重组DNA 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法 （筛选模型的建立）
操作的改进
使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA
如何通过构建基因文库来获取目的基因
如何通过构建基因⽂库来获取⽬的基因⼀、概念主要有两种基因⽂库：基因组⽂库和cDNA⽂库。
基因组⽂库：⼀个⽣物体的基因组DNA⽤限制性核酸内切酶部分酶切后，将酶切⽚段插⼊到载体DNA分⼦中，所有这些插⼊了基因组DNA⽚段的载体分⼦的集合体，将包含这个⽣物体的整个基因组，也就是构成了这个⽣物体的基因⽂库。
cDNA⽂库：是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的cDNA⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合体。
⼆、构建基因⽂库的主要程序1、DNA提取及⽚段化或是cDNA的合成⼀个⽣物体的基因组DNA⽤限制性核酸内切酶部分酶切或全部mRNA经反转录形成的cDNA⽚段。
2、载体的选择及制备这些载体可以分为两类，⼀类是基于噬菌体改建的，利⽤了噬菌体的包装效率⾼和杂交筛选背景低的优点；另⼀类经改造的质粒载体或⼈⼯染⾊体，其主要优点在于可容纳超过100kb以上的外源⽚段。
3、DNA⽚段或cDNA与载体连接⽤重组DNA技术将某种⽣物细胞的DNA的所有⽚断随机地连接到基因载体上。
4、重组体转化宿主细胞⽤质粒作为载体的重组DNA分⼦可以通过转化引进细胞。
⽤λ噬菌体的DNA作载体的重组分⼦直接经转染引⼊细胞的效率较低；⼀般需先⾏离体包装，即把重组DNA分⼦包在噬菌体外壳中，再通过噬菌体感染⽽把重组DNA分⼦引⼊敏感细菌细胞中。
三、鉴定和转化细胞的筛选当获得了含重组体的宿主细胞时，即完成了基因的克隆。
然⽽，它只是分离基因的第⼀步，基因克隆后还要对克隆的基因进⾏分离。
因此，还必须对其进⾏必要的检测与分析，如序列测定，体外转录及翻译、功能互补实验等。
通过这些实验确定基因结构及功能，此时才能算分离到了⽬的基因。
所以，基因克隆、克隆基因分离、分离基因鉴定是利⽤基因⽂库技术分离⽬的基因的主要内容。
从基因⽂库中筛选某⼀克隆的基因常⽤办法是分⼦杂交。
⾸先把属于⼀个⽂库的细菌或噬菌体以较低密度接种在培养⽫上以取得相当分散的菌落或噬菌斑，然后⽤硝酸纤维滤膜吸印，使培养⽫和滤膜的相对应的位置上具有相同的克隆。
获得目的基因的方法
常用的方法有P1
就是从酶，DNA进行部分酶解，得到DNA限制性片段②选用适当的限制性内切酶酶解λ噬菌体载体DNA。③经适当处理，将基因组DNA限制性片段与λ噬菌体载体进行体外重组。④利用体外包装系统将重组体包装成完整的颗粒。⑤以重组噬菌体颗粒侵染大肠杆菌，形成大量噬菌斑，从来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑
3.
最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散Байду номын сангаас射击法”。
这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。鸟枪法的具体做法是：用限制酶（即限制性内切酶）将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分别在受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法吧带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫，抗病毒的基因都可以用上述方法获得。
用“鸟枪法”获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。
二、人工合成
1
主要针对是序列已知的基因，通过DNA自动合成仪，通过固相亚磷酸酰胺法合成，可以按照已知序列将核苷酸一个一个连接上去成为核苷酸序列，一般适于分子较小而不易获得的基因。对于大的基因一般是先用化学合成法合成引物，再利用引物获得目的基因录而成的cD是，在真核生物基因组中合有大量的间隔序列或内含子，但在大肠杆菌等原核生物中没有类似序列的存在，所以大肠杆菌不能从真核生物基因的初级转录本中去除间隔序列，即不能表达真核生物DNA。而在真核生物成熟mRNA中已不存在间隔序列（已在拼接过程中被去除），所以可以以真核生物成熟mRNA为模板，逆转录而成的cDNA可被大法。
基因工程中的目的基因获得的方法
基因工程中的目的基因获得的方法
基因工程中获得目的基因的方法有以下几种：
1. PCR扩增法：利用聚合酶链反应（PCR）从一个已知源
DNA扩增目的基因的特定片段。
这种方法需要已知目的基因
的序列或者已知相关基因的序列来设计引物，通过PCR扩增
特定片段。
2. 基因合成法：利用化学合成技术合成目的基因的DNA序列。
这种方法可以通过合成多个片段，再进行连接而合成完整的目的基因。
3. DNA文库筛选法：构建基因文库，将源DNA片段插入载体中形成DNA文库。
然后利用对目的基因编码的蛋白质进行筛选，找出含有目的基因的载体。
4. 基因克隆法：将目的基因从一个生物体中剪切出来，然后将其插入到另一个载体中，形成重组DNA。
这种方法通常使用
限制酶切和连接酶进行DNA分割和连接。
5. 基因编辑法：利用CRISPR-Cas9、TALENs或ZFNs等基因
编辑技术，直接对细胞或生物体进行基因编辑，将目的基因插入到细胞或生物体的基因组中。
这些方法可以根据具体的实验需求和技术可行性来选择合适的方法来获得目的基因。
DNA文库的构建和目的基因ppt课件
▪ 从特定组织提取的染色制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因 91)基因组 (Genomic library) ：
▪ 是指将某种生物体基因组转录的全部
mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克 隆载体重组，储存于某种受体ntary DNA，互补
DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发 育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形 成的互补DNA。
因，因此从特定组织中制备的mRNA通常会 富集某些特异序列。所以起始材料的选择 十分重要。
30
1、mRNA的制备: 动物细胞或植物细胞mRNA的制备
2、mRNA的来源: 选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等方
法提高mRNA的含量。 3、mRNA完整性的检测
1)mRNA分子的大小：哺乳动物mRNA长度为5008000bp，大部分mRNA位于1.51
▪ 外源基因：插入到载体内的那个特定
的片段基因。
▪ 目的基因：那些已被或者准备要分离、
改造、扩增或表达的特定基因或DNA片 段。
2
对于高等真核生物而言，基因组DNA 十分庞大,基因可达数万个，且基因组成 结构复杂，除编码序列，还有非编码序 列及调控序列，基因间还存在大量的间 隔序列和重复序列，因此，单个目的基 因在整个基因组中所占的比例极其微小， 除少数例外，绝大多数基因难以直接分 离得到。
15
（二）基因组DNA的不完全酶切 1、根据实验需要选择合适的限制性内切 酶 2、分离目的酶切片段大小的确定
a) 克隆单个基因：< 10 kb b) 克隆基因族：< 20kb 3、DNA不完全酶切条件的确定 a) 确定限制酶用量，改变酶切时间 b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量
16
目的基因的制备方法
目的基因的制备方法1. 目的基因合成法：目的基因合成法是一种通过化学合成的方式来制备目的基因的方法。
该方法通常用于制备较短的目的基因（小于1000bp），优点是速度快，产量高，并且可以轻松地对目的基因进行修改。
在该方法中，目的基因的序列首先被设计并确定，然后通过化学合成的方式进行合成。
通常将该序列分成几个较短的片段，并逐一地进行合成和连接，直到完整的目的基因被制备出来。
2. PCR扩增法：PCR扩增法是一种广泛应用于制备目的基因的方法。
该方法利用特定引物的作用下，在体外反应体系中将目的基因的DNA序列扩增至所需的数量。
优点是产量高，适用于中等长度的目的基因，且可以进行定向的修饰。
在该方法中，首先设计引物，确定PCR反应体系中目的基因的起始和终止位置。
然后，通过PCR扩增反应，将模板DNA中的目的基因序列扩增至所需数量。
通过纯化和测序等处理，制备出干净的目的基因。
3. 基因克隆法：基因克隆法是将目的基因分子克隆至载体DNA上的一种方法。
该方法通常适用于较长的目的基因（大于1000bp），优点是产量高，重复性好，并且可以进行定向的修饰。
在该方法中，需准备一种能够接受目的基因的载体DNA，并将其线性化。
然后，在体外反应体系中，将目的基因的DNA序列与线性化载体DNA连接，形成重组DNA。
通过将重组DNA转化至感受态细胞中并筛选，制备出所需的目的基因。
4. 基于CRISPR技术的编辑法：基于CRISPR技术的编辑法是在生物体内或外对目的基因进行编辑的方法。
该方法利用CRISPR-Cas9等系统以及其引导RNA的作用，直接在目的基因序列中进行特定断裂和编辑。
优点是精度高，易于实现定向编辑。
在该方法中，首先需要设计合适的引导RNA序列，并在细胞内或外表达Cas9蛋白，以引导Cas9与引导RNA结合并特异性切割目的基因的DNA序列。
然后，在切割的断口处，可将外源DNA序列转化进去，实现目的基因的定向编辑。
5. 手工组装法：手工组装法是一种将片段PCR产物或化学合成的短片段组装成完整目的基因的方法。
目的基因的制备
2019/11/7
第一节 目的基因的制备
27
（3）避免外源D禁外源DNA片段之间的连接！！！
为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合： 将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端
2019/11/7
2
二 什么是目的基因
基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同 一生物体中，创造出具有高度应用价值的新物种。为此 必须从现有生物群体中，根据需要分离出此类基因，即 准备要分离、改造、扩增或表达的基因通常称之为目的 基因。
如抗逆性相关基因（抗病、抗寒等）、生物药和保健品 相关基因、毒物降解相关基因 、工业用酶等相关基因 等体的最大装载量如下： 质粒 l-DNA 考斯质粒 BAC
10 kb 23 kb 4
2019/11/7
第一节 目的基因的制备
24
2.1.5.3 载体与基因组DNA的切割
基因
大小（bp） 合成年代 基因
大小（bp） 合成年代
人胰岛素 126 转运RNA 542 -干扰素 81 肠促胰液肽 162 尿抑胃激素 453 2019-/干11/扰7 素
1978 1979 1981 1982 1982 1984
视紫红质 前脑菲肽 ATP酶 溶菌酶 RNA酶T1 RNA酶Ａ
和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后
者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固
相亚磷酸三酯法原理设计的
2019/11/7
12
化学合成的单元操作
DMT： 二甲氧基三苯甲基
DMT O
CH2 O G
HH
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
4.46基因组(genomic library)
2/46
基因组DNA 限制性内切酶
分离基因组DNA
基因重组
DNA片段与载体连接
体外包装
导入细胞
转化细菌
筛选
3目的基因的重组克隆的概率。
如果满足两个条件：生物体染库的完备性就是1。用基因组的克隆数表示基因组的大小即库容量。
5/46
基因库是通过重组技术转化筛选而建立， 利用低等生物如细菌、病毒、噬菌体等生长快、 繁殖能力强的特点作为一种核酸扩增的载体， 把人类等高等生物的基因或其片段重组其中， 成为便于保存、取用方便的基因库。建立基因 库的目的是为了便于目的基因的保存、扩增和 纯化。6/46基因组的质量评价和完备性25/46
cDNA的质量评价mRNA根据其在细胞中的拷贝数即丰度 低丰度：拷贝数在1至15间 中等丰度：拷贝数在100至1000间 高丰度：拷贝数在1,000至10,000间
高丰度mRNA的cDNA 克隆所占的比例高，分离容易， 低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例低，用探针筛选特定A 限带的所有基 因组DNA片段的集合.
克隆载体 重组DNA分子
受体菌 含重组分子的转化菌
genomic library
每个细胞含有一个基因组 DNA片段与载体的重组DNA分 子，许多细胞组成一个含有基 因组各DNA片段克隆的集合体.
殖.
20/46
mRNA分离纯化 反转录合成cDNA 构建cDNA筛选目的基因21/46
反转录合成单链cDNA
22/46
置换合成法合成cDNA第二链
23/46
引物-衔接头法合成cDNA第二链
24/46
包含着细胞全部mRNA信息的有一部分 表达，且在不同条件、不同分化时期的细胞其基 因表达的种类和强度也不尽相同，cDNA具有 组织细胞特异性。8/46
2.经验值
ln(1－P) N=， 一般 设为99％（0.99）；
f为载体容量（kb）DNA,理论上应具有的最少克隆数；
9/46
人单倍体DNA总长为3×109bp 若载体装载量为15kb 则构建完备性为 0.9 的基因组7/461.理论值
基因组的克隆数目（N）＝基因组DNA总长
DNA插入片段的平均长度
某种生物基因组DNA总长度为3×106 kb，酶切后的 b= 2×105个2/46
可获得的基因 该种生物所有基因 应用范围 ◆ 基因原始结构功能的研究 ◆ 对比分析内含子、外显子及调控区域 ◆ /46
逆转录
以单链RNA为模板合成双链DNA的反应。
DNA mRNA
15/46
逆转录病毒细胞内的逆转录现象：
RNA 模板 逆转录酶
18/46
polyT亲和ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ析法
polyT polyT polyT
AAA AAA
AAA AAA19/46cDNA的组建mRNA反转录酶
1.mRNA提取
2.cDNA合成
基因重组
cDNA cDNA第一链的合成
cDNA第二链的合成
3.双链cDNA的分子克隆
4.双链cDNA克隆进质粒或
噬菌体载体并导入宿主中繁
构建大肠杆菌（4.采用质粒作 为载克隆.
完备性
库容量
0.99 0.999 0.9999
92万 138万 184万
基因组（bp）
10kb（质粒）
理论值
经验值
25kb（噬菌体）
理论值
经验值
45kb（粘粒）
理论值
经验值
大肠杆菌
4.6×106
4602116cDNA代表性指中包含的重组cDNA分子反映来源 细胞中表达信息(即mRNA种类)的完整性，胞中表达出的mRNA种细胞中某种mRNA的拷贝数。
RNA酶
DNA-RNA 杂化双链
单链DNA
双链DNA
逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样具
有遗传物质的传代与表达功能。
16/46
逆转录酶的应用:
应用于基因工程
基因
mRNA 蛋白质多肽链
17/46
mRNA的提取与纯化
尿素-氯化锂法 硫氰酸胍法 polyT亲和层析法 密度梯度离心分级法 探针筛选法
184
845
102
468
酿酒酵母
1.8×107
1800
8287
720
3313
400
1840
水稻
5.7×108
57000
262492
22800
104996
12667
58330
人
3.2×109
320000
1473652
128000
589459
71111
327476
11/46
选择载体的主要参数是基因组大小