目的基因的制备

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目的基因的制备和基因克隆的筛选

目的基因的制备和基因克隆的筛选
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目录
• 引言 • 目的基因的制备 • 筛选策略与方法 • 实验结果与数据分析 • 结论与展望
01 引言
目的基因的重要性
决定生物性状
目的基因是生物体内控制特定性状表达的关键基因，其序列和表达水平直接影响生物的表型特征。
潜在应用价值
目的基因往往与生物体的生长、发育、代谢等关键过程密切相关，因此具有潜在的应用价值，如用于基因工程、生物制药等领域。
限制性内切酶酶切分析
利用限制性内切酶对DNA进行酶切，通过凝胶电泳分析酶切片段的大小和数量，判断目的基因是否插入到载体中。
Southern杂交分析
将酶切后的DNA片段转移到固相支持物上，与特异性探针进行杂交，通过放射自显影或化学发光等方法检测杂交信号，确定目的基因的存在和位置。
PCR筛选
菌落PCR筛选
05 结论与展望
实验结论总结
成功制备了目的基因
通过PCR扩增和基因合成等方法，成功获得了所需的目的基因片段，为后续实验提供了基础。
建立了基因克隆筛选体系
通过构建重组质粒、转化宿主细胞、筛选阳性克隆等步骤，成功建立了基因克隆的筛选体系，为后续基因功能研究提供了有效手段。
验证了基因功能
通过基因表达分析、蛋白互作研究等方法，初步验证了目的基因在细胞中的功能和作用机制。
重组DNA的转化与扩增
重组DNA的转化
将重组DNA分子导入到合适的宿主细胞中，如细菌、酵母或哺乳动物细胞等，使其获得新的遗传特性。
重组DNA的扩增
通过选择培养基筛选阳性克隆，并进行扩大培养，以获得足够的重组DNA分子用于后续实验。同时，可以通过PCR等方法对重组DNA进行进一步验证和鉴定。

一般生物制药的主要流程

一般生物制药的主要流程如下：1. 上游阶段1.1 目的基因的制备目的工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中,创造出具有高度应用价值的新物种. 为此必须从现有生物群体中,根据需要分离出用于克隆的次类基因,这样的基因称之为目的基因. 基因工程中获得的目的基因主要用于: (1).研究该基因,分析其结构,功能和表达的调空机制(2).和正常基因比较,找出基因的异常点,探索疾病发生的分子生物学基础.(3).研究生物种系的进化(4).建立基因疗法,将正常基因引入病人体内,治疗遗传性疾病(5).大量表达某种基因,生产出需要的蛋白和多肽(6).对某些基因进行改选,改良动植物品种.不同基因组类型的基因组大小不同,基因组和基因排列也各不相同,因此,分离目的基因应采用不同的途径和方法1.1.1 构建cDNA基因文库分离法cDNA文库是以真核细胞中分离纯化出所有的mRNA,在以mRNA为模板合成cDNA与适当的载体重组转入宿主细胞,这样建立起来的cDNA重组分子集合体称为cDNA文库.而cDNA 文库中插入片段的总和可代表某一种生物全部的mRNA序列.1.1.1.1 cDNA文库的构建构建cDNA文库主要包括以下步骤: (1).细胞总RNA的制备及mRNA的分离(2).以mRNA 为模板,合成cDNA第一条链(3).双链cDNA的合成,而将mRNA—DNA杂交分子转变为双链cDNA分子(4). CDNA与载体的连接和噬菌体颗粒的包装及传染或质粒的转化等1.1.1.2 cDNA克隆的优越性自20世纪70年代初说创cDNA克隆问世以来,以采用构建和筛选cDNA文库的方法克隆了许多目的基因的cDN**段.在基因工程操作中,也长以cDNA为探针从基因文库中分离相应的基因克隆.因此, cDNA克隆常常以基因分离和结构分析的着手点,在分子生物学研究和基因工程应用等方面具有十分重要的意义.1.1.2 构建基因组文库分离法1.1.2.1 基因组文库的概念将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段,分别与适合的载体重组后导入宿主细胞,这些重组分子中插入片段的总和可代表该生物全部基因组序列.这种通过重组,克隆方法保存在宿主细胞中的各种DNA重组分子的集合体称为基因组文库.1.1.2.2 基因组文库的大小克隆片段的平均大小/bp 基因组的大小/bp2×10^6(细菌) 2×10^7（真菌）3×10^9（动物）LN SJ LN SJ LN SJ5×10^3 400 1831 4000 18418 600000 273611010×10^3 200 919 2000 9208 300000 138155020×10^3 100 458 1000 4603 150000 69077440×10^3 50 278 500 2300 75000 345386一个理想的基因组文库因该是在克隆群体中包含完整基因组的所有DNA序列.这就要求在打断基因组DNA时尽可能做到随机切割,实际上,无论采用什么方法的不能达到理论上的切割.应此构建的基因组文库应包含的克隆子数理论值和经验值之间相差比较大.几类基因组文库的大小见下表: 「2」1.1.2.3 构建基因组文库的类型通过克隆,重组方法构建的基因组文库主要有：(1)构建λ噬菌体基因组文库；（2）构建考斯质粒基因组文库(3) 构建Y AC基因组文库1.1.3 直接分离法1.1.3.1 限制性核酸内切酶酶切分离法限制性核酸内切酶酶切分离法适于简单基因组中分离目的基因.质粒和病毒等DNA分子小的只有几千碱基,大的也不超过几万碱基,编码的基因较少,获得的目的基因方法比较简单. 1.1.3.2 基因分离的物理化学法这是基因工程在发展初期所用的方法,某些生物的rDNA基因最早都是利用该法分离获得的,但目前很少采用.次方法主要有：密度梯度离心法、单链酶解法和分子杂交法等.1.1.3.3 双抗体免疫法分离编码蛋白的基因双抗体免疫法分离编码蛋白的基因适于某一真核细胞的蛋白质已被分离纯化,且足以产生抗体.1.1.3.4 利用酶促反转录发直接从特定mRNA分离基因酶促反转录主要用于合成分子质量较大,转录产物mRNA易分离目的基因.目的基因的mRNA为模板逆转录酶cDNA DNA聚合酶双链双链cDN**段与合适载体重组并转入受体菌cDNA克隆1.2 目的基因的分离通过适当的方法构建上一个完整的基因组DNA文库或CDNA文库,意味着包含目的基因在内的所有基因都得以克隆,但并不等于完成了目的基因的分离.因为在基因文库中,不论是CDNA文库还是基因组文库,含目的基因的克隆子都只是数以万计的克隆子中的一个,其中究竟哪个克隆子含有我们所需要的目的基因序列还不清楚.因此,还需要下一个步骤要进行的就是目的基因的分离,主要方法有：（1）目的基因的功能克隆（2）序列克隆法（3）利用差示分析法分离目的基因克隆（4）功能结合法筛选目的基因（5）DNA插入诱变法分离目的基因（6）应用基因定位克隆技术分离筛选目的基因（7）基因的定位侯选克隆法（8）染色体显微切割与微克隆法（9）根据生物大分子内的相互作用分离目的的CDNA克隆（10）筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术1.3 基因克隆载体载体是携带目的基因的DN**段进入受体细胞进行扩增和表达的工具.常用的载体是经过改造的细菌质粒,噬菌体,黏粒和病毒1.3.1 质粒克隆载体质粒是细菌染色体外的双链环状的能自我复制的小分子DNA,其对细胞本身的生长繁殖不是必需的,但可以赋予细菌一定的类型,如耐热型等.与构建克隆载体相关的质粒性质有：（1）粒的复（2）制型（2）质粒的不（3）相容性（3）质粒的接合性（4）质粒作为基因工程载体需要具备的条件：作为基因工程载体的质粒都是经过人工改造过的质粒,具备以下特点：a, 相对分子质量小3—10kb b, 是松弛型复制质粒c, 是非接合型质粒c, 质粒上有多个限制酶的单一切点d, 带有双选择标记1.3.2 病毒（噬菌体）克隆载体病毒主要由DNA（或RNA）和外壳蛋白组成,经包装后成为病毒颗粒.通过感染,病毒颗粒进入宿主细胞,利用宿主细胞的合成系统进行DNA(或RNA)复制的壳蛋白质的合成,实现病毒颗粒的增殖.人们利用这些性质构建了一小列分别适用于不同生物的病毒克隆载体.通过此种方法构建成的基因克隆载体主要有：（1）噬菌体克隆载体cosmid克隆技术（黏粒）（2）Μ13噬菌体克隆载体（2）aMV克隆载体（4）烟草花叶病毒（TMV）载体克隆（5）SVCO克隆载体（6）反转录病毒克隆载体（7）腺病毒克隆载体（8）痘苗病毒克隆载体（9）杆状病毒表达克隆载体1.3.3 其他类型的克隆载体（1）染色体定位整合克隆载体（2）人工染色体克隆载体（3）特殊用途克隆载体：如启动子探针型,（4）诱导型,（5）反义表达组织特异表达,（6）分泌型表达,（7）双启动子,（8）串族启动子和含增强子表达克隆载体等等1.4 目的基因和载体的连接（重组）目的基因和载体连接前要先用同一种限制酶将目的基因和载体切割成黏性端或平端,也可以用物理方法切割后再用酶补成平端体外连接是基因工程的重要环节,体外连接要减少载体的自身环化,提高重但子阳性率.主要的连接方法有：黏性末端连接、平端连接、定向插入和同源多聚尾.1.5 重组体导入受体细胞外源目的基因与载体在体外连接重组后形成重组的DNA分子.该重组DNA分子必须导入适宜的受体细胞在中才能使外源目的基因得以大量扩增或表达.随着基因工程的发展,从低等的原核细胞,到简单的真核细胞,进一步达到结构复杂的高等动,植物细胞都可以作为基因工程的受体细胞.选择适宜的受体细胞已经成为重组基因高效克隆或表达的基本前提之一1.5.1 受体细胞的选择要求目的基因获得后,必须在合适的宿主细胞中才能进行表达,才能获得目的产物.应此,宿主细胞必须满足:容易获得较高浓度的细胞;能利用易得廉价的材料;不致病、不产生内毒素;发热量低,需氧低,适当的发酵温度和细胞形态;容易进行代谢调控;容易进行DNA重组技术操作技术;产物的产量、产率高,产物容易提取纯化.1.5.2 受体细胞的类型人们通过研究,根据需要获得了一定的目的产物,而目的基因能否的到有效的表达,关键在与受体细胞的选择.1.5.2.1 原核生物细胞由于原核生物作为基因工程受体具有其他生物所没有的优点,而且人们对其遗传背景清楚,所以早期开展的基因工程操作,都是以原核生物为受体细胞.目前研究比较多的有:大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等.1.5.2.2 真核生物细胞由于真核生物的细胞结构、基因组成和基因表达较为复杂,适用于原核生物的转基因方法大多数难以有效地用于真核生物.近年来经过探索,发现它可以对表达的蛋白质进行翻译后加工过程,有利于保持天然结构和生物活性.并用这些方法有效的获得了转基因真核生物.研究较多的有:酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等等.1.5.3 重组子的筛选在重组DNA分子的转化、转染和转导过程中,并非所有的的受体细胞都能被导入重组DNA 分子.一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞,同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖.因此,如何将被转化细胞从大量受体菌细胞中初步筛选出来,然后进一步检测到含有期待重组DNA分子的克隆子将直接关系到基因克隆和工程操作红极为重要的环节.重组子的筛选可以根据载体的类型、受体细胞种类以及外源DNA分子导入受体细胞的手段等采用不同的方法,一般包括以方面:(1).遗传直接筛选法; (2),核算分子杂交检测法; (3)依赖于重组子结构特征分析的筛选法; (4)免疫化学检测法; (5)转译筛选法; (6)亚克隆法; (7)插入失活法;(8)电子显微镜作图检测法; (9)基因表达产物分析法; (10)DNA序列分析法.1.6、外源基因的表达基因工程技术的核心是基因表达技术.迄今为止,已构建了多种基因表达系统,包括原核生物和真核生物基因表达系统,不同的表达系统具有各自的特点.1.6.1 基因表达的机制（过程）1.6.1.1 外源基因的起始转录外源基因在宿主细胞中的有效表达是基因工程的核心问题,而外源基因的起始转录又是基因表达的关键.1.6.1.2 mRNA的延伸与稳定性外源基因起始转录后,保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键. mRNA的稳定性直接导致决定翻译产物的多少,对原核细胞来说,最佳的方法是选择一个RNase缺失受体前.对真核细胞来说则需考虑增加mRNA的正确加工,提高成熟mRNA的稳定性.1.6.1.3 外源基因mRNA的有效翻译翻译是mRNA指导多肽链生成的过程,翻译的起始是多种因子协同作用的过程,其中包括mRNA,16SrRNA,fMet-tRNA之间的碱基配对,还有mRNA序列上的终止密码对正确翻译的效率有很大影响.1.6.1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性外源基因的表达产物能否在宿主细胞中稳定积累而不被内源蛋白水解酶所水解是基因有效表达的一个重要因素,因此,为了避免此现象的发生可从以下几个方面考虑：（一）构建融合蛋白表达系统; （二）构建分子体蛋白表达系统;（三）构建包涵体表达系统; （四）选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统.1.6.1.5 目的基因沉默基因沉默是导致外源基因不能正常表达的重要因素.它的作用机制主要有三种：位置效应的基因沉默、转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默.基因沉默现象主要表现在转基因动物和植物中.目的基因沉默是在核酸水平上DNA与DNA,DNA与RNA,RNA与RNA相互作用的结果.由于重复序列或同源系列是基因沉默的普通原因之一,因而在构建表达载体时,应尽可能避免与内源序列具有较高的同源性.此外,可以通过选择甲几基化酶活性较弱的受体细胞或以化学物质处理受体细胞抑制甲基化作用.1.6.2 基因表达的调控元件通过研究发现主要的基因表达调控元件有：启动子、增强子、终止子、衰减子、绝缘子和反义子1.6.3 外源基因表达系统外源基因表达系统泛指目的基因与表达载体重组后,导入合适的受体细胞,并能在其中有效的表达,产生目的基因产物（目的蛋白）.由此可知,外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成.基因表达系统有原核生物表达系统和真核生物表达系统.目前,利用较多的是原核生物表达系统,因其遗传背景清楚,繁殖快,表达率高等特点.近年来,真核生物基因表达系统发展很快,因其可以对表达的蛋白质进行翻译后加工过程,有利于保持天然结构和生物活性等优点.目前主要应用的表达系统有：大肠杆菌基因表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、蓝藻表达系统、酵母表达系统、哺乳动物细胞基因表达系统、植物细胞基因表达系统；还有最新研究的两个新的表达系统[3]：巴斯德毕赤酵母表达系统和动物乳腺生物反应器——全新的生产模式.2、下游阶段基因工程只要的过程关键在于上游阶段,因它可以获得有效的工程菌,但下游纯化阶段也必不可少.因此为了获得合格的目的产物,必须建立相应的医药生物技术产品的分离纯化工艺. 2.1、基因工程菌发酵：良好的发酵工艺对表达外源蛋白至关重要,直接影响下游纯化工艺,形象到产品的质量和生产成本,决定产品在市场上的竞争力.目前,基因工程菌培养常用方法有：补料分批培养、连续培养、透析培养、固定培养.近年来,生物药品已进入生物技术时代,对基因工程菌的培养设备要求十分严格,主要采用新型自动化发酵罐.2.2、分离纯化的基本过程：分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的一环,这是由于工程菌经过大规模培养后,产生的有效成分含量低,杂质含量高；另外由于基因工程药物是从转化细胞,而不是从正常细胞生产的,所以对产品的纯度要求也高于传统产品,主要的步骤如右表：[4]2.2.1、建立分离纯化工艺根据主要根据：（1）含目的产物的起始物料特点;（2）物料中杂志的种类和性质;（3）目的产物特性;（4）产品质量的要求.2.2.2、选择分离纯化方法的依据：主要依据：(1) 根据产物表达形式来选择;(2) 根据分离单元之间的衔接选择;(3) 根据分离纯化工艺的要求来选择.2.2.3、常用的分离纯化方法（见下表）[5]方法目的离心/过滤去除细胞、细胞碎片、颗粒性杂质(如病毒)阴离子交换层析去除杂质蛋白、脂质、DNA和病毒等阳离子交换层析去除牛血清蛋白或转铁蛋白等超滤去除沉淀物及病毒疏水层析去除残余的杂蛋白凝胶过滤与多聚体分离0.22μm微孔滤膜过滤除菌3、基因工程药物：自20世纪80年代初第一种基因工程产品——人胰岛素投放市场以来,以基因工程药物为主导的基因工程应用已成为全球发展最快的产业之一.随着生物技术的快速发展,基因工程药物将拥有越来越广阔的发展前景.基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核苷酸药物等,它对预防和治疗人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、各种传染病、糖尿病、类风湿疾病等有重要作用.3.1、基因工程激素类药物激素是一类由生物体内分泌腺或特异性细胞产生的微量有机物,通过体液或细胞外液运送到特定的作用部位,能引起特殊的生理效应.基因工程的激素类主要指通过基因工程方法合成的蛋白多肽类激素.目前被批准上市的激素类药物有胰岛素、人生长激素、人促卵泡激素等. 3.2、基因工程细胞因子类药物细胞因子是由细胞分泌的能够调节物有机体生理功能,参与细胞的增殖,分化和凋亡的小分子多肽类物质.目前被批准上市的产品有十多种.主要有：干扰素（IFN）、集落刺激因子（CSF）、白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子（TNF）,趋化因子和生长因子（GF）等.它们的生物学功能主要表现为：调节免疫应答、抗病毒、抗肿瘤、调节机体造血功能和促进炎症反应等. 3.3、基因工程疫苗：直接利用微生物制备疫苗来治疗疾病取得了巨大的成就,但由于各种传染病在世界范围内广泛存在,并不断有新的致病微生物被发现,它们对人类的健康造成巨大威胁.利用基因工程方法制备疫苗对控制传染病的复发和治疗新的传染病有重要意义.目前研究的基因工程疫苗包括：痢疾菌苗、霍乱菌苗、结核菌苗、流感菌苗、狂犬病疫苗、疟疾疫苗、口蹄疫疫苗. 3.4 特殊基因工程药物—防御素防御素是一类在生物界广泛存在的、富含半胱氨酸,具有微生物和一些恶性细胞抗性的小分子短肽.它的抗性谱十分广泛,目前以发现它不但对细菌、真菌和被膜病毒(如爱滋病病毒)有广泛的毒杀效应,对某些恶性肿瘤细胞也有毒杀作用.最近,对一些长期存活的爱滋病感染者的研究发现,他们体内的爱滋病抑制因子就是一类防御素.这一研究发现给人们战胜爱滋病带来希望.4. 基因工程研究发展前景基因工程问世以来短短的二十几年,显示出了巨大的活力,使传统的生产方式和产业结构发生了变化.特别是在医药行业,利用人工的方法合成了许多有用的药物及人体器官等,取得了很大的经济效益.今后,基因工程将重点开展基因组学、基因工程药物、动植物生物反应器和环保等方面的研究.通过这方面的研究、开发,对人类的生活、生存环境从根本上优化做出巨大的贡献.因此,我们相信基因工程的前景将是更加灿烂辉煌.。

第四章目的基因的制取

第四章目的基因的制取内容提要•目的基因的制取策略•鸟枪法制取目的基因•物理化学法分离目的基因•化学合成基因•反转录合成DNA第一节目的基因制取的策略一、外源基因与目的基因基因工程主要是通过人工方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而进行遗传研究或是获得表达产物。

通常我们把插入载体的DNA片段称为“外源基因”；将那些已被或准备要被分离、改造、扩增或表达的DNA片段称为“目的基因”。

原核细胞含有上千个基因，真核细胞基因组内的基因数目更是庞大。

目的基因一般都很小，都仅由几千或几百甚至更少的碱基对组成（人生长激素释放抑制因子的基因仅有42bp）。

要想获得某个特定的目的基因，必须对其性质、结构有所了解，根据其特点来制定分离方案。

二、目的基因制取的策略目的基因制取的策略可分为直接制取和间接制取。

一般来说，大部分低等生物基因组的碱基序列已测定，可以直接制取目的基因（确切定位）。

对于高等哺乳动物来说，目的基因在DNA上无法定位，只能间接制取。

获取目的基因的方法：1、直接制取法：以机械的方法或是限制性内切酶对总DNA进行切割，再直接分离特点位点的DNA分子。

2、逆转录法（互补cDNA法）：以RNA为模板，逆转录合成cDNA。

缺点是cDNA中不含天然基因的内含子。

3、PCR扩增法：对于含极微量mRNA的细胞大多采用PCR扩增，再进行目的基因的制取。

4、鸟枪法（散弹法）：可快速和高纯度地从单拷贝或多拷贝基因中筛选获得天然的目的基因。

5、人工化学合成法。

6、其它方法：mRNA差异显示法、限制性片段长度多态性探针技术等。

目前，真核基因，利用DNA合成仪合成目的基因的成本较高；利用cDNA文库获得目的基因需大量前期工作；直接以生物细胞染色体DNA为模板可获得目的基因，但模板的扩增会产生非特异性产物；一般通过构建完整的基因文库，再从文库中“钓取”出目的基因。

第二节鸟枪法制取目的基因一、“鸟枪法”的概念“鸟枪法”是指将基因组按染色体分开后，将它全部打乱，切成碎片，进行随机测序，测序后再将它们拼接起来的方法。

实验三PCR扩增制备目的基因

实验三PCR扩增制备目的基因概念反转录是以RNA为模板,通过反转录酶,合成DNA的过程，是DNA生物合成的一种特殊方式。

区分:反转录与逆转录不等同。

反转录是进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程；逆转录是RNA类病毒自主行为，在整合到宿主细胞内以RNA为模板形成DNA的过程。

二者虽同为RNA→DNA的过程，但地点不同，相对性的来说，反转录在体外，逆转录在体内。

2反转录酶与反转录过程反转录过程由反转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA为模板催化DNA链的合成。

合成的DNA链称为与RNA互补DNA（cDNA）。

反转录酶存在于一些RNA病毒中，可能与病毒的恶性转化有关。

人类免疫缺陷病毒（HIV）也是一种RNA病毒，含有反转录酶。

在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有反转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。

大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。

①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。

此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。

反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。

②RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA 形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5′端水解掉RNA分子。

③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。

除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。

反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。

用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出cDNA文库(cDNA library)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。

基因工程的基本过程

基因工程的基本过程基因工程主要包括几个过程：1、目的基因的制备；2、选择合适的载体，将目的基因与载体相连接生成重组DNA分子；3、将重组DNA片段导入受体；4、选择目的基因；5、目的基因的表达。

对于整个基因过程来讲，目的基因的获取是关键，它直接涉及到产物，而且还影响到产物的量。

很多在基因操作过程中，目的基因是很难获得的，所以通常采取先生成基因文库的方法，然后从基因文库中筛选。

如果目的基因的序列以及它的调控等信息很清楚，可以直接通过PCR或cDNA获取，这样就大大减少了选择目的基因的盲目性，可以将整个过程简化为以下步骤：图10-3-8 基因工程过程(1)目的基因的分离和制备目的基因是指准备导入受体细胞内的，以研究或应用为目的所需要的外源基因称目的基因。

获得目的基因的方法很多，但也是十分困难的一步。

目前获得目的基因有4条途径：1.从生物基因组群体中分离目的基因原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性内切酶将基因组切成若干段后，用带有标记的核酸探针，从中选出目的基因。

真核生物一般通过基因组文库的方法获得目的基因。

图10-3-1 限制性内切酶限制性内切酶(restrictive enzyme)是20世纪60年代末在细菌中发现的，能水解DNA分子骨架的磷酸二酯键，使一个完整的DNA分子切成若干段，每一种限制酶，都有自己特定的作用位点，而且切口或切下来的序列，往往是回文结构（palindromes）。

例如Eco RI把GAATTC在GA之间切开，形成粘性末端。

也有一些限制酶作用的结果产生不含粘性末端的平整末端，如HapI。

多在原核生物中存在，能识别4～6个特苷酸特定的碱基序列。

限制酶对细菌有保护作用，某些入侵的噬菌体可因DNA链被限制性酶切断而不能在细菌中繁殖，“限制”因此而得名。

限制酶不能切开细菌本身的DNA，这是因为细菌DNA的腺嘌呤和胞嘧啶甲基化（-CH3）而受到保护之故。

这样就可以用限制性内切酶把一个基因组DNA分成很多片段，对于原核生物比较小的基因组来说，可以直接用标记地探针来获取在通过特定的方法，对于比较大的基因组，可以先制作基因文库，然后钓取所需要的带有目的基因的片段。

基因工程第五章目的基因的获取

oligo(dT)引导的DNA合成法：
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入1220个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA mRNA 5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶 Oligo dT引物
5’
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ：
1）4bp的内切酶平均每44（256）bp一个切点。
随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶平均每46（4096）bp一个切点。 ② 内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法（1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
同一限制酶切位点连接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
1. 优点由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。 2. 缺点目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！
BamH I
BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。（1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。

转基因的方法和原理（可编辑）

转基因的方法和原理转基因的方法和原理 1目的基因制备和载体系统 2几种有效的转基因方法 3定点突变和受体系统简介转基因研究技术的中心环节即为DNA重组技术，其最终目的是将DNA片段转入为一个生物体，从而使该生物体具有表现某种性状。

转基因通过获取基因、重组基因和表达基因等过程来实现。

转基因打破了物种的界限，使不同种的生物的遗传物质在分子水平上重新组合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，实现对生物体的改造。

基本步骤 1.分离获得目的基因； 2.在体外进行DNA重组，将外源DNA 连接到能自我复制又带有选择标记的载体上； 3.将重组DNA转移入受体细胞；4.筛选出含有目的DNA的受体细胞克隆；目的基因制备和载体系统目的基因来源：基因组DNA分离、化学合成、PCR扩增、cDNA文库及DNA文库中制得。

载体：质粒、λ噬菌体、柯氏质粒、YAC载体等工具酶：限制性内切酶、连接酶、DNA聚合酶等 PCR反应 PCR技术就是在体外通过酶促反应或自发地扩增一段目的基因的技术。

PCR要求反应体系具有以下条件： 1、要有与被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的DNA引物约20个碱基左右； 2、具有热稳定性的酶如Taq DNA聚合酶； 3、4种dNTP； 4、作为模板的目的DNA序列。

PCR反应可扩增出100～5000bp的目的基因。

PCR反应过程 1、变性，即将模板DNA置于95℃的高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA；2、退火，将反应体系的温度降低至55℃左右，使得一对引物分别与变性后的两条模板链相配对；3、延伸，将反应体系温度调整到Taq DNA聚合酶作用的最适温度72℃，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。

反复进行约30个循环左右，即可扩增得到目的DNA序列。

利用cDNA法由于真核生物的mRNA具有poly A这一结构特点，可以用结合长度大约为15bp的短链多聚DT的纤维素填充的柱子，根据碱基配对原则，将其吸附，从真核细胞的总RNA中提取出来，再用能打断A-T氢键的缓冲液洗脱。

提取目的基因实验报告(3篇)

第1篇一、实验目的1. 掌握从细胞中提取目的基因的方法。

2. 了解目的基因提取过程中的原理和操作步骤。

3. 通过电泳检测目的基因的提取效果。

二、实验原理目的基因提取实验主要利用DNA的碱基互补配对特性和分子生物学技术，通过以下步骤实现目的基因的提取：1. 细胞裂解：利用去垢剂（如SDS）和蛋白酶K等试剂，破坏细胞膜，使细胞内的DNA释放出来。

2. 去除蛋白质：通过酚/氯仿抽提法，去除细胞裂解液中蛋白质等杂质。

3. DNA沉淀：通过乙醇或异丙醇等试剂，使DNA沉淀，从而纯化DNA。

4. DNA溶解：将沉淀的DNA溶解于适量的水中，以便后续实验使用。

三、实验材料1. 细胞样本：大肠杆菌或其他细胞株。

2. 试剂：SDS、蛋白酶K、酚/氯仿、乙醇、异丙醇、NaCl、Tris-HCl、EDTA等。

3. 仪器：离心机、电泳仪、紫外分光光度计等。

四、实验步骤1. 细胞裂解：- 将细胞样本加入含有SDS和蛋白酶K的裂解液中，混匀，室温放置30分钟。

- 12,000 rpm离心10分钟，收集上清液。

2. 去除蛋白质：- 将上清液与等体积的酚/氯仿混合，混匀，12,000 rpm离心10分钟。

- 取上清液（即酚/氯仿相）转移至新管中。

3. DNA沉淀：- 向酚/氯仿相中加入1/10体积的3M NaCl和2.5倍体积的乙醇，混匀。

- -20℃放置1小时或过夜。

- 12,000 rpm离心10分钟，收集沉淀。

4. DNA溶解：- 将沉淀溶于适量的Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液中，即为提取的目的基因。

5. DNA浓度测定：- 利用紫外分光光度计测定DNA的浓度。

6. 电泳检测：- 将提取的目的基因进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA条带。

五、实验结果1. DNA浓度测定：利用紫外分光光度计测定DNA的浓度为50 ng/μl。

2. 电泳检测：在琼脂糖凝胶电泳中，观察到一条清晰的DNA条带，与目的基因大小相符。

六、实验讨论1. 本实验成功提取了目的基因，说明实验操作步骤正确。

目的基因的名词解释_制备方法_制备流程

目的基因的名词解释_制备方法_制备流程目的基因的名词解释把需要研究的基因称为目的基因。

(一般把需要分析的基因称靶基因，在基因克隆过程中有时两者均称为插入基因，有时三者含义相近。

所以有时有些书本上也笼统的称“用限制性核酸内切酶切割目的基因(靶基因)”)。

目的基因的制备方法从细胞核中直接分离简单的原核生物目的基因可从拟核中直接分离得到，但人类的基因分布在23对染色体上，较难从直接法中得到。

直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。

这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。

鸟枪法的具体做法是：用限制酶(即限制性内切酶)将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA(外源DNA)的所有片段分别在受体细胞中大量复制(在遗传学中叫做扩增)，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。

如许多抗虫，抗病毒的基因都可以用上述方法获得。

用“鸟枪法”获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。

染色体DNA的限制性内切酶酶解II型限制性内切酶可专一性地识别并切割特定的DNA顺序，产生不同类型的DNA末端。

若载体DNA与插入的DNA片段用同一种内切酶消化，或靶DNA与载体DNA末端具有互补的粘性末端，可以直接进行连接。

DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。

当限制酶在识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。

人工体外合成简短的目的基因可在了解DNA一级结构或多肽链一级结构氨基酸编码的核苷酸序列的基础上人工合成。

用逆转录酶制备cDNA大多数的目的基因是由mRNA合成cDNA(反转录DNA)得到。

从RNA入手，先从细胞提取总RNA，然后根据大多数真核mRNA含有多聚腺嘌呤(polyadenylic acid ,polyA)尾的特点，用寡聚dT纤维素柱将mRNA分离出，以mRNA为模板，在多聚A尾上结合12-18个dT 的寡聚dT片段，作为合适的起始引物，在逆转录酶作用下合成第一条。

基因克隆实验流程

基因克隆实验流程基因克隆技术，又称重组 DNA 技术，是将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA 进行体外重组，获得新的重组DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白，以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。

一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。

获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。

该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。

原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。

2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。

此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。

因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。

3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。

在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。

4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。

用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。

用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。

二、选择适当的载体按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。

为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。

目的基因的制备方法

目的基因的制备方法1. 目的基因合成法：目的基因合成法是一种通过化学合成的方式来制备目的基因的方法。

该方法通常用于制备较短的目的基因（小于1000bp），优点是速度快，产量高，并且可以轻松地对目的基因进行修改。

在该方法中，目的基因的序列首先被设计并确定，然后通过化学合成的方式进行合成。

通常将该序列分成几个较短的片段，并逐一地进行合成和连接，直到完整的目的基因被制备出来。

2. PCR扩增法：PCR扩增法是一种广泛应用于制备目的基因的方法。

该方法利用特定引物的作用下，在体外反应体系中将目的基因的DNA序列扩增至所需的数量。

优点是产量高，适用于中等长度的目的基因，且可以进行定向的修饰。

在该方法中，首先设计引物，确定PCR反应体系中目的基因的起始和终止位置。

然后，通过PCR扩增反应，将模板DNA中的目的基因序列扩增至所需数量。

通过纯化和测序等处理，制备出干净的目的基因。

3. 基因克隆法：基因克隆法是将目的基因分子克隆至载体DNA上的一种方法。

该方法通常适用于较长的目的基因（大于1000bp），优点是产量高，重复性好，并且可以进行定向的修饰。

在该方法中，需准备一种能够接受目的基因的载体DNA，并将其线性化。

然后，在体外反应体系中，将目的基因的DNA序列与线性化载体DNA连接，形成重组DNA。

通过将重组DNA转化至感受态细胞中并筛选，制备出所需的目的基因。

4. 基于CRISPR技术的编辑法：基于CRISPR技术的编辑法是在生物体内或外对目的基因进行编辑的方法。

该方法利用CRISPR-Cas9等系统以及其引导RNA的作用，直接在目的基因序列中进行特定断裂和编辑。

优点是精度高，易于实现定向编辑。

在该方法中，首先需要设计合适的引导RNA序列，并在细胞内或外表达Cas9蛋白，以引导Cas9与引导RNA结合并特异性切割目的基因的DNA序列。

然后，在切割的断口处，可将外源DNA序列转化进去，实现目的基因的定向编辑。

5. 手工组装法：手工组装法是一种将片段PCR产物或化学合成的短片段组装成完整目的基因的方法。

目的基因的获取方法具体操作流程

目的基因的获取方法具体操作流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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3.3基因工程-重组DNA技术的基本过程

6
3、
加入同聚体尾连接：
TdT末端加尾的原理
7
8
4.平端连接
所用ATP及T4DNA连接酶的浓度比，粘性末端连接要高些（大于2.5倍）
9
四、将重组DNA导入宿主细胞
1. 转化（transformayion）
将质粒或胞（Competent Cell）：E-coli经Cacl2处理（0-5℃），使细胞膜通透性增加，从而具有摄取外源 DNA的能力。转化程序：感受态细胞+质粒DNA 42℃、90sec
3
3、化学合成法
4.
a.a→code→DNA→化学合成nt
PCR（polymerase chailibrary）：因限制性内切酶将基因组 DNA切成片段，每一段与一个载体连接成重组DNA，并引入宿主细n）
感染
11
五、重组体的筛选
（1）遗传学方法（2）免疫学方法（3）核酸杂交法（4）PCR技术（5）酶切鉴定
1.
遗传学方法
含抗性基因的质粒，转化后，细菌在含这种抗生素的培养基中培养，未被转化的细菌即被杀死，能生长的，就是一转化的。
⑴ 筛选转化菌：
12
13
14
⑵ 筛选带有重组体的克隆 ①插入失活法（insertion inactivation）鉴别：质粒重组体和非重组体适用于：具有两个或两个以上抗生素性标记的质粒。 ② -互补（-complementation） M13噬菌体（插入了一段LacZ基因）宿主（删除了一段LacZ基因 LacA：当M13感染空载宿主后，产生完整的LacZ产物。 -半乳糖苷酶 Xgal X（兰色）+gal（无外源DNA） B：当M13插入了外源 DNA后，其LacZ基因被破坏，不能与宿主细胞中LacZ的互补，产生LacZ产物。 Xgal X （兰色）（含外源DNA 重组克隆） 15 C：蓝白筛选：

实验三 PCR扩增制备目的基因

free）,25mM MgCl2，dNTP，引物，模板质粒，无菌
TAE电泳缓冲液，1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml）,10加样缓冲液.
主讲人：王兴平 E-mail: nwsuafwxp@
dd water。 dNTP混合液（每种25mM）,合成的引物，
基因工程实验
四、操作步骤
E-mail: nwsuafwxp@
基因工程实验
Thanks for your attention
主讲人：王兴平
E-增制备目的基因
主讲人：王兴平 E－mail：nwsuafwxp@
主讲人：王兴平 E-mail: nwsuafwxp@
基因工程实验
一、实验目的
熟悉PCR的基本原理学会PCR操作的基本技术制备目的基因
主讲人：王兴平
E-mail: nwsuafwxp@
主讲人：王兴平
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基因工程实验
四、操作步骤
3.电泳检测
主讲人：王兴平
E-mail: nwsuafwxp@
基因工程实验
五、注意事项
所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。
操作过程中均应戴手套。
PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水。试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
主讲人：王兴平 E-mail: nwsuafwxp@
基因工程实验
参考资料
主讲人：王兴平
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基因工程实验
思考题

第六章目的基因获取和DNA重组

一般更愿意使用逆转录法获得目的基因）
DNA片段的组装连接方法有2种：
第一种方法：粘末端连接法
第二种方法二、基因法获取目的基因即直接从基因中生物基因组所程
第一节目的基因的获得
获得目的基因的方法：主要有4种 1
一、基因合成技术
基因合成，指利用4种单体脱氧核糖核苷酸 (Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ），通过化学反应，合成出一条与已知基因序列完全相同的DNA链。
对不参加反应的集团加保护基
◆合成过程使用的保护基团，有些可以通过酸处理移去，有的可通过碱处理移去。所以不论是5′端的保护基团、还是3′端的保护基团，都可以通过酸或碱的脱保护，消除掉保护集团。这样的一个带有5′端保护的合成的二核苷酸分子，又可以同下一个带3′端保护的单核苷酸或二核苷酸进行第二次缩合反应，形成一个三核苷酸或四核苷酸分子，这种从缩合反应开始，到保护基团消除，进而再进行新的缩合反应的循环周期库是一项十分繁重的工作，一般的基因工程实验室都难以完成此亿碱基对，即3×106kb. (2)常用的克隆载体质粒、λ噬菌体和COS质粒克隆外源DNA的能力分别为15kb、25kb和45kb. （3）选取克隆能力最大的COS质粒载体，则需要构建至少6.8万个克隆才可能包含整个人的基因组DNA
（2）mRNA的纯化和完整性鉴定
在典型的哺乳动物细胞中含有10000～30000种不同的 mRNA序列，但并不是任一基因的mRNA在每一细胞中都有同样的转录数量，在特定的mRNA分子集群中，有些基因的mRNA数量很高，而另一些基因的mRNA数量却很低，例如编码像珠蛋白、免疫球蛋白质和卵清蛋白的mRNA，占特定类型的分化细胞总mRNA的50%～90%，属高丰度mRNA，而相当数量的其它基因mRNA的含量在细胞总mRNA中少于0.5%，属低丰度mRNA或稀有mRNA。对高丰度mRNA来讲，其所对应的A之前不需要进一步纯化和富集。但对低丰度mRNA的分离则需要采用特殊是脱氧核糖核苷三磷酸为合成原材料。

目的基因的获取方法

目的基因的获取方法获取目的基因是基因工程学研究过程中一个十分重要且必不可少的过程，它不仅可以用于合成某一种新颖分子，还可以用于突变研究、功能分析以及诊断和治疗等。

目前，获取目的基因的方法有很多，具体的方法取决于要获取的基因的特性，以及研究者拥有的信息量和资源。

首先，最常用的获取目的基因的方法是结合同源克隆技术与DNA测序技术，这是基因工程学领域中使用最广泛的技术手段。

主要是通过收集一种具有特定目的功能的物种的DNA 样本，然后通过同源克隆技术，将DNA片段分离分型，最后使用DNA测序技术，对每个片段的序列进行鉴定。

此方法可以快速有效地获取非突变型的目的基因，但需要研究者有良好的序列资源以及高级的技术能力。

其次，另一种获取目的基因的方法是合成 DNA 技术，主要是通过制备目的基因的合成探针、引物和 DNA 模板，然后通过聚合酶链反应结合目的基因的模板，使 DNA 模板和合成 DNA 探针或引物发生双聚。

该方法有可能制备出完全相同的基因序列，但也需要研究者具备良好的试验室实验技术。

第三，基因扩增技术也是一种获取目的基因的方法，主要是通过将目的基因的序列放入介质中，利用 Polymerase chain reaction（PCR）技术将DNA 复制增幅的方法进行基因扩增。

该方法不仅具有快速，而且可以有效地扩增病毒基因，因此在临床诊断、分子生物学研究中得到广泛应用。

最后，还可以使用基因敲除与恢复技术获取目的基因，是一种利用突变体或核酸靶向破坏和修复技术获取基因的方法。

主要是将一个特定目的基因标记特定核苷酸序列，接着在与目的基因特定的特异位点处引入核苷酸酶，最终，将其中一个突变体作为目的基因的来源。

这种方法可以明确的追踪和解析基因的功能，使该方法在生物学研究和临床诊断中具有重要应用价值。

总之，获取目的基因的方法多种多样，技术的步骤也大不相同。

研究者要按照自己研究的目的和环境具体情况，根据自身的技术水平选择合适的技术手段，并调整实验方法来获取固定目标基因。