PCR法获取目的基因 PPT

2. 基本程序
PCR排管
TaqDNA聚合酶
模板DNA
dNTP 引物
预变性
Buffer Mg2+
94℃ 5min
模板DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+
Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+
72 ℃ 5～7 min
循 94℃ 环 55 ℃ 仪 72 ℃
循环25～35次
PCR法获取目的基因
PCR技术的定义及其发展历史 PCR技术的原理 PCR的反应体系和条件 PCR法获取目的基因 PCR技术的未来展望
PCR技术
多聚酶链式反应
(Polymerase Chain Reaction)
PCR技术即多聚酶链式反应，又称聚合酶 链式反应。是一种选择性体外扩增DNA或 RNA的方法。
PCR原理
（1）类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物的存 在
（2）PCR过程：由变性—复性（退火）--延伸三个 基本反应步骤构成
①变性：94℃左右，使双链DNA模板解离成为 单链；
②复性：55℃左右，引物与模板DNA单链互补 配对结合；
③延伸：72℃左右，“模板-引物结合物”在 DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，以靶序 列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成 新的DNA链
四、PCR法获取目的基因
1. T载体克隆PCR获取的目的基因
具有3‘-5’ 外切酶活性的DNA 聚合酶（如pfu聚合酶），其 扩增的PCR 产物是平末端, 要对这种平末端的PCR 产物进 行克隆, 应首先对PCR产物的3‘末端进行加A的工作。工作 程序如下
方案一 胶回收平末端 PCR产物，进入5µl 10×Tag DNA Polymerase Buffer、4种 dNTP或dATP（终浓度为200nM）、2.5U Tag DNA Polymerase，加水至 终反应体积为 50µl，72℃ 保温10min，纯化 PCR片段后进行TA克隆
1.合理分隔实验室 将样品的处理、配制PCR反应液、PCR 循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注 意样本处理及PCR产物的鉴定应与其他步骤严格分开。 2.吸样枪 由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘 上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要 十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸 ，以免交叉污染或产生气溶胶污染。 3.试剂分装 所有的PCR试剂都应小量分装，-20℃保存，以 减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂和PCR 反应液应与样品及PCR产物分开保存。 4.防止操作人员污染 一次性手套、吸头、小离心管应一次 性使用。
方案二 PCR 反应（50µl 反应体积）结束以后，加入1µl 20mM dATP 和2.5U 的 Tag 酶，72℃ 保温10min ，然后进行直接进行TA克隆
2 .设计酶切位点克隆PCR获取的目的基因
目的基因的PCR片段
5’
3’
限制性内切酶的识别序列
经限制酶切 割得到粘性 末端
Hale Waihona Puke Baidu
经限制酶切割得到的具有
（3）重复“变性--退火--延伸”的循环，可获得大量的新DNA链，而 且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量DNA产 物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。
2. PCR技术的特点
1）速度快，灵敏度高：经过30轮循环，理论上目的产物的 扩增量达230个拷贝（109拷贝）。 2）特异性：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定 PCR反应结果的关键；引物设计的最大原则是最大限度地提 高扩增效率和特异性，同时尽可能减少非特异性扩增。 3）操作简便易行：只需要数小时就可以用电泳法检出1μg基 因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。
在生物学实验中做为基础存在，可以说是 现代分子生物学研究中最重要的技术。
一、PCR技术的创建
1.Khorana等1971年提出在体外经DNA变性、 与适当引物杂交、再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 2.1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 3.1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。 4.1988年，第一台PCR仪问世。 5.1989年美国《Science》杂志比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获 1993年度诺贝尔化学奖。
二、 PCR技术的原理
1. PCR技术
在微量离心管中,加入 适量的缓冲液, 微量的模 板DNA,四种脱氧核苷酸, 耐热性DNA聚合酶, 一对 合成DNA的引物,通过高 温变性、低温退火和中温 延伸三个阶段的循环合成 DNA，每一次循环使特 异区段的基因拷贝数放大 一倍。一般样品经过30次 循环,可使基因的拷贝数 达到数百万。
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
三、PCR的反应体系和基本步骤
1 .反应体系组成成分（总体积：50 L）
H2O 10×PCR反应缓冲液
25mmol/L MgCl2 4种dNTP 上游引物（引物１） 下游引物（引物２） 模板DNA (约1ng) Taq酶
35μL 5μL 4μL 4μL 0.5μL 0.5μL 0.5μL 0.5μL
扩增出 的目标
基因
转移点样 进行电泳
扩增出 的目的
基因
琼脂糖凝胶电泳
3. PCR反应条件
循环参数
（1）预变性：94 ℃ 5 min
（2）变性：94 ℃ 20 s-45 s 使双链DNA解链为单链
（3）退火：温度由引物的解链温度Tm决定，时间45 s左右。
增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度
粘性末端的线性载体
5’
3’
限制性内切酶的识别序列
体外连接 获得目的基因的克隆
五、PCR的类型
1 、不对称PCR 2 、反向PCR (reverse PCR) 3 、多重PCR（复合PCR） 4、 LP-PCR（Labelled primers) 5 、锚定PCR（anchored PCR, A-PCR） 6 、PCR固相分析法 7 、原位PCR 8 、反转录PCR（RT-PCR) 9、 荧光定量 PCR（real-time PCR)
可增加反应的灵敏性。 （4）延伸：一般为72℃，时间由扩增片段长度决定。 （5）循环次数：主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次
次数过多，导致扩增效率降低，错误掺入 率增加。到达平 台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。 （6）延伸补齐：72 ℃ 5 min—10 min
PCR技术的注意事项