PCR法获取目的基因 PPT
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PCR法获取目的基因.完整版PPT
（3）重复“变性--退火--延伸”的循环，可获得大量的新DNA链，而 且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量DNA产 物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。
2. PCR技术的特点
1）速度快，灵敏度高：经过30轮循环，理论上目的产物的 扩增量达230个拷贝（109拷贝）。 2）特异性：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定 PCR反应结果的关键；引物设计的最大原则是最大限度地提 高扩增效率和特异性，同时尽可能减少非特异性扩增。 3）操作简便易行：只需要数小时就可以用电泳法检出1μg基 因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。
三、PCR的反应体系和基本步骤
1 .反应体系组成成分（总体积：50 L）
H2O 10×PCR反应缓冲液
25mmol/L MgCl2 4种dNTP 上游引物（引物１） 下游引物（引物２） 模板DNA (约1ng) Taq酶
35μL 5μL 4μL 4μL 0.5μL 0.5μL 0.5μL 0.5μL
基因
转移点样 进行电泳
扩增出 的目的
基因
琼脂糖凝胶电泳
3. PCR反应条件
循环参数
（1）预变性：94 ℃ 5 min
（2）变性：94 ℃ 20 s-45 s 使双链DNA解链为单链
（3）退火：温度由引物的解链温度Tm决定，时间45 s左右。
增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度
可增加反应的灵敏性。 （4）延伸：一般为72℃，时间由扩增片段长度决定。 （5）循环次数：主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次
四、PCR法获取目的基因
医疗：肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤等癌症的筛查。 1989年 《Science》杂志比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 由于该突出碱基的存在，克隆时可以使用T载体克隆目的基因。 3 、多重PCR（复合PCR） 试剂分装 所有的PCR试剂都应小量分装，-20℃保存，以减少重复加样次数，避免污染机会。 （5）循环次数：主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次 Khorana等1971年提出在体外经DNA变性、 ②复性：55℃左右，引物与模板DNA单链互补配对结合； T载体克隆PCR获取的目的基因 （2）变性：94 ℃ 20 s-45 s 使双链DNA解链为单链 1989年 《Science》杂志比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
2. PCR技术的特点
1）速度快，灵敏度高：经过30轮循环，理论上目的产物的 扩增量达230个拷贝（109拷贝）。 2）特异性：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定 PCR反应结果的关键；引物设计的最大原则是最大限度地提 高扩增效率和特异性，同时尽可能减少非特异性扩增。 3）操作简便易行：只需要数小时就可以用电泳法检出1μg基 因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。
三、PCR的反应体系和基本步骤
1 .反应体系组成成分（总体积：50 L）
H2O 10×PCR反应缓冲液
25mmol/L MgCl2 4种dNTP 上游引物（引物１） 下游引物（引物２） 模板DNA (约1ng) Taq酶
35μL 5μL 4μL 4μL 0.5μL 0.5μL 0.5μL 0.5μL
基因
转移点样 进行电泳
扩增出 的目的
基因
琼脂糖凝胶电泳
3. PCR反应条件
循环参数
（1）预变性：94 ℃ 5 min
（2）变性：94 ℃ 20 s-45 s 使双链DNA解链为单链
（3）退火：温度由引物的解链温度Tm决定，时间45 s左右。
增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度
可增加反应的灵敏性。 （4）延伸：一般为72℃，时间由扩增片段长度决定。 （5）循环次数：主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次
四、PCR法获取目的基因
医疗：肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤等癌症的筛查。 1989年 《Science》杂志比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 由于该突出碱基的存在，克隆时可以使用T载体克隆目的基因。 3 、多重PCR（复合PCR） 试剂分装 所有的PCR试剂都应小量分装，-20℃保存，以减少重复加样次数，避免污染机会。 （5）循环次数：主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次 Khorana等1971年提出在体外经DNA变性、 ②复性：55℃左右，引物与模板DNA单链互补配对结合； T载体克隆PCR获取的目的基因 （2）变性：94 ℃ 20 s-45 s 使双链DNA解链为单链 1989年 《Science》杂志比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
PCR的基本原理和应用 PPT课件
PCR 的 基 本 原 理 和 应 用
聚合酶链式反应（PCR Polymerase Chain Reaction）
一种人工在体外进行快速DNA片断扩增的方法。
PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两 端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或 经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备； 模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反 应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多 的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循 环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
分子克隆(clone,cloned,cloning) 在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中.将DNA片段(或基因)与载体 DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目 的可分为DNA和cDNA克隆两类。
Cloning vectors (克隆载体):在基因工程重组DNA技
育，形成DNA-蛋白质复合物，电泳后用放射性自显影技 术可以确定DNA条带的位置，从而确定它与蛋白质是否 结合。
A DNA bound with more than one protein to form a larger complex.
聚合酶链式反应（PCR Polymerase Chain Reaction）
一种人工在体外进行快速DNA片断扩增的方法。
PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两 端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或 经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备； 模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反 应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多 的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循 环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
分子克隆(clone,cloned,cloning) 在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中.将DNA片段(或基因)与载体 DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目 的可分为DNA和cDNA克隆两类。
Cloning vectors (克隆载体):在基因工程重组DNA技
育，形成DNA-蛋白质复合物，电泳后用放射性自显影技 术可以确定DNA条带的位置，从而确定它与蛋白质是否 结合。
A DNA bound with more than one protein to form a larger complex.
pcr培训ppt课件
实验操作人员应接受专业培训，熟悉安全操作规程，避免在实验过程 中受伤或感染。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物 多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物 安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健 康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实 验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深 入，对PCR技术的灵敏度和特异性提 出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异 性，以满足更广泛的研究和应用需求 。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定基因片段，为基因克隆 提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同 条件下的表达水平，有助于理解基因 功能和调控机制。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物 多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物 安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健 康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实 验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深 入，对PCR技术的灵敏度和特异性提 出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异 性，以满足更广泛的研究和应用需求 。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定基因片段，为基因克隆 提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同 条件下的表达水平，有助于理解基因 功能和调控机制。
目的基因.ppt
与RNA聚合酶结合有关 -75区上游有一共有序列GGGCGC (GC框):结合某些转录因子 转录终止区:
（3）其他基因组基因的组成
质粒(无内含子) 、 病毒(重叠基因) 、 线粒体(缺少 SD序列) 、叶绿体(多顺反子) 。
一、目的基因的来源 二、获得目的基因的途径
一、目的基因的来源
目的基因主要来源于各种生物。真核生物染色体基 因组，特别是人和动植物染色体基因组中蕴藏着大 量的基因，是获得目的基因的主要来源。
结构基因的组成
转录启动区、核糖体识别区、编码区(起译码ATG、ORF、休止码TAG或 TAA或TGA)、终止转录区
（1）原核生物基因的组成
基因区：操纵子。基因之间有间隔序列 启动区：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段 SD区：起译码ATG上游约10bp处的富含嘌呤的保守区，其转录物：
5’AGGAGGU3’，核糖体16S rRNA识别、结合mRNA的位置 转录终止子和终止因子：分别指基因或操纵子3’ 端提供转录终止信号的 DNA序列；协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。
原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形成茎环发夹 。
（2）真核生物基因的组成
基因区：ATG + extrons + introns + TAA（TGA或TAG） 转录启动区：r、m、tRNA分别由RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ转录。
编码蛋白的启动子( RNA聚合酶Ⅱ识别)可寻找三个保守区： -20~-30的TATAA/TA区(Hogness框)：解链，决定起录点 -75的9bp共有序列GGT/CCAATCT区(CAAT框)：
（3）应用范围
DNA合成仪
1）合成PCR引物 2）寡核苷酸探针 3）人工接头及较小的基因
（3）其他基因组基因的组成
质粒(无内含子) 、 病毒(重叠基因) 、 线粒体(缺少 SD序列) 、叶绿体(多顺反子) 。
一、目的基因的来源 二、获得目的基因的途径
一、目的基因的来源
目的基因主要来源于各种生物。真核生物染色体基 因组，特别是人和动植物染色体基因组中蕴藏着大 量的基因，是获得目的基因的主要来源。
结构基因的组成
转录启动区、核糖体识别区、编码区(起译码ATG、ORF、休止码TAG或 TAA或TGA)、终止转录区
（1）原核生物基因的组成
基因区：操纵子。基因之间有间隔序列 启动区：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段 SD区：起译码ATG上游约10bp处的富含嘌呤的保守区，其转录物：
5’AGGAGGU3’，核糖体16S rRNA识别、结合mRNA的位置 转录终止子和终止因子：分别指基因或操纵子3’ 端提供转录终止信号的 DNA序列；协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。
原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形成茎环发夹 。
（2）真核生物基因的组成
基因区：ATG + extrons + introns + TAA（TGA或TAG） 转录启动区：r、m、tRNA分别由RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ转录。
编码蛋白的启动子( RNA聚合酶Ⅱ识别)可寻找三个保守区： -20~-30的TATAA/TA区(Hogness框)：解链，决定起录点 -75的9bp共有序列GGT/CCAATCT区(CAAT框)：
（3）应用范围
DNA合成仪
1）合成PCR引物 2）寡核苷酸探针 3）人工接头及较小的基因
《PCR引物设计》课件
04
pcr引物的应用与案例分 析
pcr引物在基因克隆中的应用
01
pcr引物用于基因克隆的目的是为了获得目的基因的序列信息， 进而进行后续的基因功能和表达研究。
02
设计特异性引物，通过pcr技术，从基因或基因组中筛选出目的基因。
引物设计需考虑基因序列的特异性、扩增效率和避免非特异性
03
扩增等因素。
引物特异性优化
避免引物间的互补
引物之间不应存在互补序列，以避免形成引物二聚体或发夹 结构。
避免引物与模板扩增 和产物。
引物扩增效率的优化
引物与模板的匹配度
引物的3'端应与模板完全匹配，以提 高引物的扩增效率。
引物之间的匹配度
两个引物之间应有良好的匹配度，以 保证PCR反应的顺利进行。
引导合成
引物作为合成子链的起点，通过与 DNA聚合酶的结合，引导合成与 模板互补的DNA链。
决定产物长度
引物的设计决定了PCR产物的长度 ，通过选择合适的引物，可以控制 产物的大小和特异性。
pcr引物设计的基本原则
特异性
长度和序列
引物应与模板DNA具有高度的特异性，避 免与其他非目标DNA序列发生非特异性结 合。
pcr引物的未来发展方向与挑战
引物设计的自动化
随着生物信息学的发展，未来引物设计 可能更加自动化，减少人工干预和误差
。
标准化和质量控制
建立引物设计的标准化流程，加强引 物设计的质量控制，确保实验结果的
可靠性和可重复性。
新型引物设计策略
针对特定需求，开发新型引物设计策 略，提高PCR反应的特异性和灵敏度 。
引物灵敏度测试
03
测试引物在不同模板浓度下的扩增效率，选择灵敏度较高的引
实验三PCR扩增制备目的基因PPT课件
生物信息学分析
利用生物信息学软件对PCR产 物进行序列比对、基因注释、
结构预测等分析。
结果解读与讨论
目的基因扩增成功与否
杂带和引物二聚体的处理
根据电泳结果判断目的基因是否成功扩增 ，如果没有扩增出目的基因或扩增效果不 佳，需要检查实验条件和引物设计。
如果电泳结果显示有杂带或引物二聚体， 需要优化PCR条件或重新设计引物，以确保 获得更纯净的目的基因产物。
10×PCR Buffer
04 提供PCR反应所需的离子环境
。
DNA模板
05 含有目的基因的DNA片段。
去Hale Waihona Puke 子水稀释PCR反应体系。06
设计引物
01
02
03
04
引物设计原则
选择合适的引物，确保引物与 目的基因的特异性结合，避免
非特异性扩增。
引物长度
通常为15-30个碱基。
引物序列
根据目的基因序列，利用引物 设计软件进行设计。
pcr 技术的应用领域
01
02
03
遗传疾病的诊断
通过PCR技术可以检测出 人类基因突变，从而对遗 传疾病进行诊断。
病原微生物检测
PCR技术可以快速、准确 地检测出细菌、病毒等病 原体，为疾病预防和控制 提供有力支持。
基因克隆和表达
通过PCR技术可以克隆出 目的基因，并在体外进行 表达和纯化，为基因工程 研究和应用提供基础。
05
pcr 扩增实验结果分析
结果分析方法
琼脂糖凝胶电泳
通过观察电泳结果，判断PCR 产物的大小是否与预期一致， 并判断是否有杂带或引物二聚
体。
测序验证
将PCR产物进行测序，与预期 的基因序列进行比对，验证 PCR产物的准确性。
利用生物信息学软件对PCR产 物进行序列比对、基因注释、
结构预测等分析。
结果解读与讨论
目的基因扩增成功与否
杂带和引物二聚体的处理
根据电泳结果判断目的基因是否成功扩增 ，如果没有扩增出目的基因或扩增效果不 佳，需要检查实验条件和引物设计。
如果电泳结果显示有杂带或引物二聚体， 需要优化PCR条件或重新设计引物，以确保 获得更纯净的目的基因产物。
10×PCR Buffer
04 提供PCR反应所需的离子环境
。
DNA模板
05 含有目的基因的DNA片段。
去Hale Waihona Puke 子水稀释PCR反应体系。06
设计引物
01
02
03
04
引物设计原则
选择合适的引物，确保引物与 目的基因的特异性结合，避免
非特异性扩增。
引物长度
通常为15-30个碱基。
引物序列
根据目的基因序列，利用引物 设计软件进行设计。
pcr 技术的应用领域
01
02
03
遗传疾病的诊断
通过PCR技术可以检测出 人类基因突变，从而对遗 传疾病进行诊断。
病原微生物检测
PCR技术可以快速、准确 地检测出细菌、病毒等病 原体，为疾病预防和控制 提供有力支持。
基因克隆和表达
通过PCR技术可以克隆出 目的基因，并在体外进行 表达和纯化，为基因工程 研究和应用提供基础。
05
pcr 扩增实验结果分析
结果分析方法
琼脂糖凝胶电泳
通过观察电泳结果，判断PCR 产物的大小是否与预期一致， 并判断是否有杂带或引物二聚
体。
测序验证
将PCR产物进行测序，与预期 的基因序列进行比对，验证 PCR产物的准确性。
实验四 PCR扩增目的基因课件PPT
engineering of DNA
• 等位基因序列变化的分析 Analysis of allelic sequence
variations
2021/3/10
16
PCR反应中的成份
1. 引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所 决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。
引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：
分子生物学实验 Experiments of molecular biology
实验四 PCR扩增目的基因
2021/3/10
1
实验二 PCR扩增目的基因
【目的要求】 1．掌握实验原理和实验基本过程； 2．了解PCR引物设计原则；学会设计PCR引物 ； 3．了解PCR的优化环节，学会如何优化PCR。了
6
3. PCR管内加好上述试剂之后要充分混合，然后离心数 秒，放入PCR仪上。
4. 编辑PCR反应程序，完成后启动PCR仪， 电泳。
PCR完成后，取5μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行 电泳分析，检查反应产物及长度。
2021/3/10
7
电泳结果如图所示
2021/3/10
8
[注意] 1. PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。 2. 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要
• PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶 反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。
• 体外程序化的DNA合成技术。
devised by Kary Mullis in 1983
Mullis, K.B. (1993) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65.
PCR技术ppt课件
组成：50mM KCl 10mM Tris.Cl (pH 8.4) 1.5mM MgCl2
Mg2+是Taq酶活性所必需的金属离子。 dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降 低。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非 特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的 活性，使反应产物减少。
（六）PCR反应标准体系
五、PCR的反应条件控制
（一）PCR反应的温度和时间控制
1、变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最
主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以 使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间， 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有 影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完 全变性，就会导致PCR失败。
2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配 对结合；
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理， 合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
AFLP
兼并引物PCR
巢氏PC
免疫-PCR(immuno-PCR) 反向PCR
MSP甲基化特异 PCR
（一）温度梯度PCR
1、概念： 通过对复性温度比引物的Tm值低2-
10℃的范围内进行系列PCR预实验来 对复性条件进行优化.
温度梯度PCR
Thermal Image of 45-65°C Gradient
联合逆转录反应（reverse transcription，RT） 与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于 10个拷贝的RNA模板。 2、RNA扩增包括两个步骤： （1）在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合 成RNA的互补cDNA （2）加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引 物退火，并由DNA聚合酶催化物延伸生成双链 靶DNA，最后扩增靶DNA
Mg2+是Taq酶活性所必需的金属离子。 dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降 低。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非 特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的 活性，使反应产物减少。
（六）PCR反应标准体系
五、PCR的反应条件控制
（一）PCR反应的温度和时间控制
1、变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最
主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以 使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间， 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有 影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完 全变性，就会导致PCR失败。
2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配 对结合；
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理， 合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
AFLP
兼并引物PCR
巢氏PC
免疫-PCR(immuno-PCR) 反向PCR
MSP甲基化特异 PCR
（一）温度梯度PCR
1、概念： 通过对复性温度比引物的Tm值低2-
10℃的范围内进行系列PCR预实验来 对复性条件进行优化.
温度梯度PCR
Thermal Image of 45-65°C Gradient
联合逆转录反应（reverse transcription，RT） 与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于 10个拷贝的RNA模板。 2、RNA扩增包括两个步骤： （1）在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合 成RNA的互补cDNA （2）加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引 物退火，并由DNA聚合酶催化物延伸生成双链 靶DNA，最后扩增靶DNA
PCR技术详解ppt课件
• 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作 为选择最适退火温度的起点较为理想
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间 的非特异性结合，提高PCR反应的特异性
28
③ 延伸温度与时间： • 延伸温度：一般选择在70～75℃之间 – 常用温度为72℃ – 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 • 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 – 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） – 3～4kb的靶序列需3～4min – 扩增10kb需延伸至15min • 延伸时间过长会导致非特异性扩增 • 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些
22
低浓度引物
高浓度引物
23
3）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多 重PCR。其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的 存在或缺失。
引物
电 泳
24
4）实时定量PCR(real-time PCR): 该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量 功能的，特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程每一 轮循环产物的累积荧光值，可以很好的推算模板的起始浓 度
3
• 1985 年，美国 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人 发明了聚合酶链反应（PCR） • 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由 于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力， 且易出错，未能推广 • 1988 年 ， Saiki 等 人 从 嗜 热 杆 菌 (thermus aquaticus) 中 提 出 TaqDNA 聚 合 酶 ， 使 得 PCR技术得以广泛应用 • 1993 年， Mullis 等因此项技术获诺贝尔化 学奖
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植物基因工程在植物育种上的应用PPT课件
1、磷酸二酯法 2、磷酸三酯法 3、亚磷酸三酯法 4、固相合成法 5、自动化合成法
磷酸二酯法的合成原理
① 保护dNTP的5’端P 或3’端-OH，以 保证合成反应的定向进行。
② 带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另 一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。
③ 用酸或碱的脱保护
磷酸二酯法合成过程
磷酸三酯法的合成
单链DNA噬菌体的特点： （1）ssDNA （2）复制型（RF）是双链环状DNA。 （3）RF DNA和ssDNA都能转染感受态大肠杆菌， 并产生噬菌斑。 （4）不存在包装限制。 （5）可产生大量的含有外源DNA插入片断的单链 分子，便于作探针或测序。
M13噬菌体在感染细胞中的复制
M13噬菌体的包装
（1）高拷贝数的质粒载体 （2）低拷贝数的质粒载体 （3）失控的质粒载体 （4）插入失活型质粒载体 （5）正选择的质粒载体 （6）表达型质粒载体
质粒载体模式图
噬菌体载体
噬菌体是一类细菌病毒，由蛋白质外壳和内包裹 着的DNA（双链、单链、线性、环状等）构成。
单链噬菌体载体
来自单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体，如 M13。
You Know, The More Powerful You Will Be
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End 演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列 体外引物定向酶促扩增技术。
PCR技术的五要素和步骤
参加PCR反应的物质 主要有五种
磷酸二酯法的合成原理
① 保护dNTP的5’端P 或3’端-OH，以 保证合成反应的定向进行。
② 带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另 一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。
③ 用酸或碱的脱保护
磷酸二酯法合成过程
磷酸三酯法的合成
单链DNA噬菌体的特点： （1）ssDNA （2）复制型（RF）是双链环状DNA。 （3）RF DNA和ssDNA都能转染感受态大肠杆菌， 并产生噬菌斑。 （4）不存在包装限制。 （5）可产生大量的含有外源DNA插入片断的单链 分子，便于作探针或测序。
M13噬菌体在感染细胞中的复制
M13噬菌体的包装
（1）高拷贝数的质粒载体 （2）低拷贝数的质粒载体 （3）失控的质粒载体 （4）插入失活型质粒载体 （5）正选择的质粒载体 （6）表达型质粒载体
质粒载体模式图
噬菌体载体
噬菌体是一类细菌病毒，由蛋白质外壳和内包裹 着的DNA（双链、单链、线性、环状等）构成。
单链噬菌体载体
来自单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体，如 M13。
You Know, The More Powerful You Will Be
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End 演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列 体外引物定向酶促扩增技术。
PCR技术的五要素和步骤
参加PCR反应的物质 主要有五种
PCR技术PPT课件
一、PCR的定义：
PCR（polymerase chain reaction) ：
聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增 技术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术。
.
2
DNA扩增的传统方法： 一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基 因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛 选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针 杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂， 需数周到数月的时间，且不利于普及。
.
6
3. 延伸 (Extension):
将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合
酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物 的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的
新DNA链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新 一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。
.
28
四、PCR反应体系：
常用30μl 各种成分的实际用量应根据实验者选
用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓 度进行核算。
.
29
10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl
MgCl2: dNTPs:
1.5×30 / 5 = 1.8μl 0.2×30 / 10 = 0.6μl
引物 P：
0.4×30×2 / 10 = 2.4μl
.
5
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异 结合，基本反应步骤分三步：
1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两
条单链。94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling):
PCR（polymerase chain reaction) ：
聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增 技术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术。
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DNA扩增的传统方法： 一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基 因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛 选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针 杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂， 需数周到数月的时间，且不利于普及。
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3. 延伸 (Extension):
将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合
酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物 的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的
新DNA链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新 一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。
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四、PCR反应体系：
常用30μl 各种成分的实际用量应根据实验者选
用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓 度进行核算。
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10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl
MgCl2: dNTPs:
1.5×30 / 5 = 1.8μl 0.2×30 / 10 = 0.6μl
引物 P：
0.4×30×2 / 10 = 2.4μl
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扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异 结合，基本反应步骤分三步：
1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两
条单链。94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling):
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2. 基本程序
PCR排管
TaqDNA聚合酶
模板DNA
dNTP 引物
预变性
Buffer Mg2+
94℃ 5min
模板DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+
Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+
72 ℃ 5～7 min
循 94℃ 环 55 ℃ 仪 72 ℃
循环25～35次
1.合理分隔实验室 将样品的处理、配制PCR反应液、PCR 循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注 意样本处理及PCR产物的鉴定应与其他步骤严格分开。 2.吸样枪 由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘 上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要 十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸 ，以免交叉污染或产生气溶胶污染。 3.试剂分装 所有的PCR试剂都应小量分装，-20℃保存，以 减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂和PCR 反应液应与样品及PCR产物分开保存。 4.防止操作人员污染 一次性手套、吸头、小离心管应一次 性使用。
粘性末端的线性载体
5’
3’
限制性内切酶的识别序列
体外连接 获得目的基因的克隆
五、PCR的类型
1 、不对称PCR 2 、反向PCR (reverse PCR) 3 、多重PCR（复合PCR） 4、 LP-PCR（Labelled primers) 5 、锚定PCR（anchored PCR, A-PCR） 6 、PCR固相分析法 7 、原位PCR 8 、反转录PCR（RT-PCR) 9、 荧光定量 PCR（real-time PCR)
二、 PCR技术的原理
1. PCR技术
在微量离心管中,加入 适量的缓冲液, 微量的模 板DNA,四种脱氧核苷酸, 耐热性DNA聚合酶, 一对 合成DNA的引物,通过高 温变性、低温退火和中温 延伸三个阶段的循环合成 DNA，每一次循环使特 异区段的基因拷贝数放大 一倍。一般样品经过30次 循环,可使基因的拷贝数 达到数百万。
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
三、PCR的反应体系和基本步骤
1 .反应体系组成成分（总体积：50 L）
H2O 10×PCR反应缓冲液
25mmol/L MgCl2 4种dNTP 上游引物（引物１） 下游引物（引物２） 模板DNA (约1ng) Taq酶
35μL 5μL 4μL 4μL 0.5μL 0.5μL 0.5μL 0.5μL
四、PCR法获取目的基因
1. T载体克隆PCR获取的目的基因
具有3‘-5’ 外切酶活性的DNA 聚合酶（如pfu聚合酶），其 扩增的PCR 产物是平末端, 要对这种平末端的PCR 产物进 行克隆, 应首先对PCR产物的3‘末端进行加A的工作。工作 程序如下
方案一 胶回收平末端 PCR产物，进入5µl 10×Tag DNA Polymerase Buffer、4种 dNTP或dATP（终浓度为200nM）、2.5U Tag DNA Polymerase，加水至 终反应体积为 50µl，72℃ 保温10min，纯化 PCR片段后进行TA克隆
PCR法获取目的基因
PCR技术的定义及其发展历史 PCR技术的原理 PCR的反应体系和条件 PCR法获取目的基因 PCR技术的未来展望
PCR技术
多聚酶链式反应
(Polymerase Chain Reaction)
PCR技术即多聚酶链式反应，又称聚合酶 链式反应。是一种选择性体外扩增DNA或 RNA的方法。
可增加反应的灵敏性。 （4）延伸：一般为72℃，时间由扩增片段长度决定。 （5）循环次数：主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次
次数过多，导致扩增效率降低，错误掺入 率增加。到达平 台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。 （6）延伸补齐：72 ℃ 5 min—10 min
PCR技术的注意事项
方案二 PCR 反应（50µl 反应体积）结束以后，加入1µl 200min ，然后进行直接进行TA克隆
2 .设计酶切位点克隆PCR获取的目的基因
目的基因的PCR片段
5’
3’
限制性内切酶的识别序列
经限制酶切 割得到粘性 末端
经限制酶切割得到的具有
扩增出 的目标
基因
转移点样 进行电泳
扩增出 的目的
基因
琼脂糖凝胶电泳
3. PCR反应条件
循环参数
（1）预变性：94 ℃ 5 min
（2）变性：94 ℃ 20 s-45 s 使双链DNA解链为单链
（3）退火：温度由引物的解链温度Tm决定，时间45 s左右。
增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度
（3）重复“变性--退火--延伸”的循环，可获得大量的新DNA链，而 且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量DNA产 物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。
2. PCR技术的特点
1）速度快，灵敏度高：经过30轮循环，理论上目的产物的 扩增量达230个拷贝（109拷贝）。 2）特异性：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定 PCR反应结果的关键；引物设计的最大原则是最大限度地提 高扩增效率和特异性，同时尽可能减少非特异性扩增。 3）操作简便易行：只需要数小时就可以用电泳法检出1μg基 因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。
在生物学实验中做为基础存在，可以说是 现代分子生物学研究中最重要的技术。
一、PCR技术的创建
1.Khorana等1971年提出在体外经DNA变性、 与适当引物杂交、再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 2.1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 3.1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。 4.1988年，第一台PCR仪问世。 5.1989年美国《Science》杂志比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获 1993年度诺贝尔化学奖。
PCR原理
（1）类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物的存 在
（2）PCR过程：由变性—复性（退火）--延伸三个 基本反应步骤构成
①变性：94℃左右，使双链DNA模板解离成为 单链；
②复性：55℃左右，引物与模板DNA单链互补 配对结合；
③延伸：72℃左右，“模板-引物结合物”在 DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，以靶序 列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成 新的DNA链