第五章 目的基因与载体连接 2
基因工程5章基因与载体的连接课件
⑴人工接头连接法：通过依次加入、连接合成DNA接 头，再用限制酶切加以解决。
⑵同聚物加尾连接法：可以利用末端转移酶分别在 载体酶切位点处和外源DNA片段的3’端加上相互补 的同聚尾加以解决。
⑶PCR法：通过PCR(聚合酶链反应)技术扩增外源DNA 片段，从而加上合适的限制性内切酶的单一识别序 列，再用限制酶切加以解决。
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一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
三、平端连接法 适用于限制性内切酶切割产生的平端 适用于粘端补齐或切平形成的平端
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3、基因克隆： 是指将外源基因与有自主复制能力的载体
DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA 分子的过程，又称为分子克隆。 4、基因亚克隆： 是指将较大的克隆片段经酶切后，再将所有 的小DNA片段与另一个载体连接转化的过程。
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G
+ CCTAG
G
CCTAG
GATCC G
GATCC G
T4 DNA连接酶
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
15ºC
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
第五章目的基因的获取
第五章目的基因的获取第五章目的基因的获取1976年H.G. Khorana 提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science 上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA 基因的论文。
第一节化学合成目的基因目前常用的方法一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法。
①保护dNTP 的5’端P 或3’端-OH （1）原理1. 磷酸二酯法保证合成反应的定向进行。
然后再用酸②带保护的单核苷酸连接或碱脱去保护基团带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。
然后去掉一个保护，使其循环往复连接。
（2）合成过程5’端保护的单核苷酸可以同3’端保护的二核苷酸聚合。
保护连接去保护连接原理与磷酸二酯法一样。
只是参加反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH 上都先连接了一个保护基团。
2. 磷酸三酯法固相磷酸三酯合成法将第一个核苷酸的3’-OH 端固定在固相支持物上。
（第一个核苷酸不需要保护）固相磷酸酯合成法是目前通用的合成方法。
化学合成的DNA 片断一般在200bp 以内。
需要把几个正确片段连接起来二、化学合成DNA 片断的组装1. 互补连接法（1）互补配对用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。
预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域形成有断点的完整双链。
（2）5’端磷酸化T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化（3）连接酶连成完整双链T4 DNA连接酶完整的DNA双链2. 互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。
3’5’5’3’5’3’T4DNA连接酶Klenow片段引物1. 直接合成基因三、寡聚核苷酸化学合成的优点（1）有些组织特异性mRNA的含量很低，很难用cDNA方法克隆）有些基因比较短化学合成费用较低2. 合成测序或PCR用的引物（20bp左右）（2）有些基因比较短，化学合成费用较低3. 合成探针序列以筛选特定的基因4. 定点突变合成合成带有定点突变的基因片段。
何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
目的基因与载体连接的方法
目的基因与载体连接的方法基因工程技术是通过将外源基因导入到宿主细胞中，以改变宿主细胞的遗传特征。
在基因工程中，目的基因常常需要连接到载体上才能被导入到宿主细胞中。
下面将介绍几种常见的目的基因与载体连接的方法。
1. 限制性内切酶切割连接法限制性内切酶是一类能够识别特定的DNA序列并切割DNA链的酶。
利用限制性内切酶的特异性切割性质，可以在目的基因和载体的DNA链上选择合适的切割位点。
切割后的DNA链上会留下一段不互补的单链，这个单链被称为粘性末端。
将目的基因和载体分别经过限制性内切酶切割后，可以利用这种粘性末端相互结合，形成互补碱基配对，然后使用DNA连接酶将其连接起来。
2. PCR扩增连接法PCR (聚合酶链反应) 是一种常用的基因扩增技术。
利用PCR技术，可以通过引物扩增得到目的基因和载体的DNA片段。
设计引物时，在其序列的3'端加入适当的限制性内切酶切割位点，然后通过PCR扩增获得含有限制性内切酶切割位点的DNA片段。
然后，将PCR产物和载体经过限制性内切酶切割后，利用DNA 连接酶将它们连接起来。
3. 转座子连接法转座子是一种能够在基因组内移动的DNA序列。
转座子连接法的原理是利用转座酶催化转座子在目的基因和载体之间的移动。
首先，将转座子序列插入到载体的DNA链上，然后通过反转录酶合成一个带有转座子的RNA分子。
此RNA 分子与目的基因连接后，通过转座酶的作用，将整个RNA-目的基因-转座子复合物插入到目的细胞的基因组中。
4. DNA连接酶片段连接法DNA连接酶片段连接法利用DNA连接酶催化DNA片段之间的连接。
该方法使用DNA连接酶作为催化剂将目的基因和载体的DNA片段连接起来。
此方法需要目的基因和载体之间有一段互补的序列，以便DNA连接酶能够催化它们连接起来。
5. Ligation-Independent Cloning (LIC)连接法LIC连接法是一种无连接酶的连接方法。
该方法不需要限制性内切酶切割，也无需互补的粘性末端。
实验报告目的基因与载体的连接转化及工程菌导入表达并PCR验证
题目：目的基因与载体的连接转化及工程菌导入体现并 PCR 验证。
一．实验目的:1.学习目的基因连接转化载体的原理和办法。
2.学习制备感受态细胞并将质粒导入工程菌的原理和办法。
3.学习菌落 PCR 鉴定阳性克隆的办法和环节二．实验原理1.DNA的连接重组：含有相似粘性末端的两段 DNA 分子在 DNA 连接酶的作用下能够连接在一起。
由于相似的粘性末端同一通过碱基互补配对形成一种相对稳定的构造。
连接温度的选择，理论上的最适温度是连接酶的最适温度---37 摄氏度，但是该温度下粘性末端形成的配对构造稳定，因此在室温下（12~16 度）既可最大程度发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对构造的稳定。
2.感受态细胞的制备：将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预解决的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时 Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶构造，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞，细胞膜通透性发生变化，极易与外源 DNA 相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。
联合其它的二价金属离子（如 Mn、C o）、DMSO 或还原剂等物质解决细菌，则可使转化率提高100～1000 倍。
3.质粒的导入在冰上融化感受态细胞，通过 42 度短暂热激后，由于细胞膜处在液晶态产生裂缝，外源DNA 黏附于细胞表面，而后立刻冰浴，促使细胞膜愈合。
然后将菌体放入适宜的培养基中培养，以增进细胞的愈合恢复。
4.阳性转化的培养基筛选办法。
普通的大肠杆菌难以在含有 Kana 的 LB 培养基上存活繁殖，但由于载体质粒含有 Kana 霉素的抗性基因，因此成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有 Kana 的 LB 培养基上形成菌落，即转化阳性，但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因，因此可能会出现伪阳性，故需要进行 PCR 鉴定。
5.菌落PCR的原理通过目的基因的引物进行菌落 PCR，如果菌体成功导入了目的基因，则能够通过 PCR 获取大量目的基因片段，而不含有目的基因的菌落不会扩增出目的基因片段。
目的基因与载体连接形成的重组体
目的基因与载体连接形成的重组体1. 介绍在现代生物学研究中，目的基因与载体连接形成的重组体（recombinant）在基因工程和生物技术领域中被广泛应用。
重组体是通过将目的基因与载体DNA连接，创造出新的DNA分子，以实现特定的研究目的或产生有用的产物。
本文将详细介绍目的基因与载体连接形成的重组体的概念、操作步骤、应用范围以及相关技术进展。
2. 目的基因与载体连接的操作步骤目的基因与载体连接形成重组体的操作步骤可以分为以下几个环节：2.1 选择合适的载体在选择合适的载体时，需要考虑目的基因的大小、种类以及所需表达的细胞类型。
常用的载体包括质粒、病毒和合成DNA等。
每种载体都有其特点和适用范围，需根据实验需要进行选择。
2.2 收集目的基因目的基因可以通过多种方法获取，例如从生物源中分离、合成或通过PCR扩增等技术获取。
同时，需要确保目的基因与载体之间的连接部位带有限制性内切酶切割位点，方便后续的连接操作。
2.3 切割载体和目的基因通过使用限制性内切酶，可以切割载体和目的基因的DNA，以便连接过程中的匹配。
选择合适的限制性内切酶可以产生互相兼容的黏性末端，方便连接反应。
2.4 进行连接反应将切割后的载体和目的基因进行连接反应。
连接反应可以通过DNA连酶促进，形成一个具有牢固连接的DNA分子。
连接时可以根据需要选择合适的连接方法和连接条件。
2.5 转化宿主细胞将连接后的重组体导入到合适的宿主细胞中，以便宿主细胞能够表达重组DNA分子。
转化宿主细胞的方法因实验需要和宿主细胞的特性而异，例如化学转化、电穿孔或病毒介导等。
2.6 验证重组体使用适当的方法（例如PCR、限制性内切酶切割或测序等）对转化后的细胞进行验证，确认重组体的存在和正确性。
3. 目的基因与载体连接的应用目的基因与载体连接形成的重组体的应用非常广泛，以下是几个常见的应用领域：3.1 基因治疗通过将目的基因与适当的载体连接并导入患者的细胞中，可以实现基因治疗的目的。
目的基因与载体的连接实验报告
目的基因与载体的连接实验报告一、实验介绍基因与载体的连接是分子生物学中非常重要的实验之一，它可以用于构建重组DNA、制备转基因生物等。
本次实验旨在通过将目的基因与载体连接，构建出一个新的DNA分子。
二、实验步骤1. 制备目的基因和载体首先需要制备所需的目的基因和载体。
目的基因可以通过PCR扩增得到，而载体则可以从商家购买或自行制备。
2. 限制性内切酶切割将目的基因和载体使用相同的限制性内切酶进行切割。
这样可以在两端形成互补序列，方便后续连接。
3. 连接反应将经过切割后的目的基因和载体按照一定比例混合，并加入T4 DNA 连接酶进行连接反应。
反应温度、时间等参数需要根据具体实验条件进行调整。
4. 转化大肠杆菌将连接好的DNA分子转化到大肠杆菌中，使其能够复制并表达出来。
这个步骤需要注意细胞状态、转化方法、培养条件等多个方面。
5. 筛选阳性克隆使用适当方法筛选出含有目的基因的阳性克隆。
常用的方法包括PCR检测、酶切分析、测序等。
三、实验结果在本次实验中，我们将目的基因与载体连接，并成功转化到大肠杆菌中。
经过筛选，最终得到了多个阳性克隆。
其中，PCR检测结果显示，这些克隆中均含有目的基因，并且长度符合预期。
四、实验分析通过本次实验，我们成功地将目的基因与载体连接成一个新的DNA分子，并转化到大肠杆菌中。
这个过程涉及到多个步骤，需要注意细节和条件控制。
在筛选阳性克隆时也需要谨慎处理，以避免假阳性或假阴性结果。
五、实验总结通过本次实验，我们不仅掌握了基因与载体连接技术，还学会了转化大肠杆菌和筛选阳性克隆等操作。
这些技术在分子生物学研究中应用广泛，在未来也将为我们带来更多的科研进展和应用价值。
目的基因与载体的连接原理
目的基因与载体的连接原理基因工程技术是一门新兴的生物学技术领域，它可以实现对DNA 的重组和改造，以达到人为控制生物体遗传特征的目的。
而目的基因与载体的连接是基因工程技术的关键步骤之一，本文将介绍目的基因与载体的连接原理，并探讨其在基因工程研究和应用中的重要性。
一、目的基因与载体的定义1.目的基因：目的基因是指在基因工程中需要进行重组或改造的特定基因，可以是来自不同生物体的DNA片段，也可以是人工合成的基因序列。
目的基因在基因工程中扮演着重要的角色，它可以被用来改变生物体的遗传特征，实现特定的功能。
2.载体：载体是用来携带目的基因和将其导入宿主细胞的工具，通常是一种质粒或病毒。
载体具有自我复制和传递目的基因的能力，可以通过转化或转染等方式将目的基因导入宿主细胞中，从而实现基因工程的目的。
二、目的基因与载体的连接原理目的基因与载体的连接是基因工程技术中至关重要的一环，它需要遵循一定的原理和方法才能有效实现。
1.选择适当的限制酶：限制酶是一类具有特异性切割DNA序列的酶，可以识别特定的核酸序列并在其附近切割DNA链。
在目的基因与载体的连接中，首先要选择适当的限制酶来切割目的基因和载体的DNA，以产生黏端或平端。
2.生成互补的黏端：在目的基因和载体的DNA被限制酶切割之后，通常会在切口的末端产生黏端或平端。
对于产生黏端的DNA，可以利用DNA连接酶将其与互补的黏端DNA连接起来，从而实现目的基因与载体的连接。
3.确定连接是否成功：连接酶可以将目的基因与载体的DNA连接起来，但如何确定连接是否成功也是至关重要的。
通常可以通过PCR扩增、酶切鉴定、测序等方法来验证目的基因与载体的连接是否成功。
三、目的基因与载体连接在基因工程中的应用目的基因与载体的连接技术在基因工程研究和应用中具有广泛的应用价值，其中涉及到重组蛋白表达、基因敲除、基因转移等多个领域。
1.重组蛋白表达：在基因工程中，可以利用目的基因与载体的连接技术将感兴趣的基因导入受体细胞中，从而实现重组蛋白的大规模表达。
基因工程 第五章目的基因的获取
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入1220个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶 合成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA mRNA 5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶 Oligo dT引物
5’
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ：
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。
随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法 （1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I
BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。 （1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。
05第5章_基因与载体连接
3‘ 5‘
3‘ 5‘
载体
3‘
TdT 5‘ CCCCC ployC
退火
（2）衔接物(linker)连接
① linker
用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限 制性内切酶识别位点序列的平端双链。 EcoRI linker： ② linker的作用 GGAATTCC CCTTAAGG
用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然 后再用酶切，形成一个人工粘性末端。
载体
dNTP
Taq DNA聚合酶 A T
dTTP T
A
TA
TA
二）DNA体外连接应注意的事项
1. 插入片断与载体的酶切位点互补 相同的粘性末端才能有效地连接
尽量避免平端连接 决不能进行非粘性末端连接
（1）用相同的酶切
（2）用同尾酶切 BamH I、Bcl I、Bgl II、Sau3A I、XhoII 都产生GATC4个碱基的粘性末端。
两头各有一个粘性末端！
2. 与T载体直接连接
（1）PCR产物两个3’端一般都有一个A Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双 链的3’端再加上一个多余的核苷酸 （优先加A）。
（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T
利用Taq DNA聚合酶，当原料中只 有dTTP时，被迫在平端载体上添加 T！
PCR产物
用T4 DNA连接酶连到DNA分子的 两端，直接成为人工粘性末端。
P-
-P
5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’
Blunt-ended DNA
5‘p-GATCCCGGGGCCCCGG GGCCCTAG-P5’
BamH I adapter
-CCGG -GGCCCTAG-P5’ 5‘p-GATCCCGGGGCC-
基因工程5章基因与载体的连接课件
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二、粘性末端连接法
(1)单酶切位点的粘端连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接
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由于限制性内切酶产生的粘性末端在体外连接，使 原来酶的识别序列在整个DNA维持完整性，有利 于在重组子转化扩增以后再对外源基因的分离。
连接时可以控制连接反应条件，有利于形成环状分 子或者几个DNA片段头尾相连接的直线多联体。
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一、概述
1、DNA体外重组：
将目的DNA、载体DNA 和DNA连接酶在试管中 进行的实验操作过程。
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2、DNA体外重组的特点：
DNA体外连接减少了DNA分子进入宿主细胞后遭 受降解的危险，增加了转化效率。
3、基因克隆： 是指将外源基因与有自主复制能力的载体
DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA 分子的过程，又称为分子克隆。 4、基因亚克隆： 是指将较大的克隆片段经酶切后，再将所有 的小DNA片段与另一个载体连接转化的过程。
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一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
目的基因与载体的连接
目的基因与载体的连接
目的基因与载体的连接是指将目的基因（如外源DNA序列）与载体（如质粒、病毒等）进行连接，以便将目的基因导入到宿主细胞中进行表达。
常见的目的基因连接技术包括限制性内切酶切割与黏性末端连接，使用DNA连接酶连接，或利用PCR等方法扩增目的基因并连接到载体上。
连接后的目的基因与载体形成复合物，通过转染等方法将复合物导入宿主细胞中，使目的基因能够被宿主细胞转录和翻译，并产生相应的蛋白表达。
这样可以实现对目的基因的研究与应用，如基因治疗、基因工程等。
目的基因与载体的连接原理
目的基因与载体的连接原理
(1)黏性未端连接:将靶基因片段和载体DNA经相同的限制酶分别切割,使它们两端产生相同的黏性未端。
然后经黏性未端碱基配对,再经DNA连接酶作用,共价连接成新的重组DNA分子;(2)平头末端连接:将平末端的DNA分子在T4DNA连接酶催化下,使DNA 分子的3'OH和5"P进行共价结合;(3)人工接头法: 是指利用人工接头加在平端DNA片段的两端,然后用相应限制酶切割人工接头以产生黏性末端,再与带相同黏性未端的载体相连;(4)同源多聚尾连接法:在末端脱氧核苷酸转移酶催化下,在线型载体分子的两端加上单一核苷酸如dG组成的多聚尾;而在目的DNA分子的两端加上dC尾,两者混合退火,然后经DNA聚合酶I或Klenow填补裂口处缺失的核苷酸,再通过DNA连接酶修复成环状的双链DNA。
(二)目的基因与载体的连接
（3）5′→3′外切酶活性 从游离的5’端降解 dsDNA成单核苷酸或寡核苷酸，也降解DNA:RNA 杂交体RNA成分（具有RnaseH活性）
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段－Klenow片段酶
粘端切口
在对称三轴种5`切侧切割割方产式生5`粘端
EcoRI 5`----N GAATTC N----3`
3`----N CTTAAG N----5`
5`----NG
AATTGN----3`
3`----NCTTAA
CN----5`
5`粘性末端
在对称轴的3`侧切割产生3`粘端，
PstI 5`----N CTGCAG N----3` 3`----N GACGTC N----5`
程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉
一、基因工程相关概念
（一）重组DNA技术 （recombinant DNA technology）
是在体外按人们的意愿将不同的DNA 分子重组的技术。
SI核酸酶
4.DNA聚合酶I 主要有： 大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段 Taq酶 T4噬菌体DNA聚合酶
结束放映
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（E.coli DNA polⅠ）
1956年，A.kornberg首先从E.coli中分离得到。 是由1条多肽链组成的球蛋白，MW109KD，
（1）5′→3′DNA聚合酶活性 以ssDNA为模板， 沿引物3′－OH方向，按模板顺序从5′→3′延伸。
载体与目的基因的连接与转化以及重组DNA的提取与酶切鉴定
实验一载体与目的基因的连接与转化以及重组DNA的提取与酶切鉴定一、实验目的1.CaCl2法制备感受态细胞2.目的基因与载体连接（c-myc+pSV2；粘端连接）3.重组质粒转化大肠杆菌并筛选转化体（HB101；Amp r）4.质粒DNA的小量快速制备5.质粒DNA的限制性内切酶酶切6.DNA的琼脂糖凝胶电泳二、实验原理通过粘端连接法将具有相同粘性末端的DNA分子连接在一起，通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构，利用连接酶发挥间断修复的功能，从而获得重组的DNA分子。
受体细胞经处理后（电击或CaCl2等处理），细胞膜通透性发生变化，从而使外源的载体分子通过感受态细胞，并使受体细胞获得新的稳定遗传的性状，该过程称为转化。
由于本实验种pSV带有抗氨苄青霉素的基因，因而转化后的细胞在含氨苄青霉素的平板上培养可以筛选出转化成功的受体细胞。
分离质粒DNA的步骤包括：培养细菌使质粒扩增、收集和裂解细菌以及分离和纯化质粒DNA。
SDS可以使细胞壁裂解，碱变性抽提质粒DNA的原理是利用染色体DNA与质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的，当pH＞12.6时，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA由于超螺旋共价闭合环状结构，两条互补链不会完全分离。
当采用pH 4.8的NaAc高盐缓冲液调节pH至中性时，质粒DNA恢复原有的构型，而染色体DNA则不能复性而缠绕形成网状结构。
通过离心可将染色体DNA及大分子RNA、蛋白质等去除。
三、实验器材和试剂１.器材恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴、台式离心机、低温离心机、涡旋振荡器、移液枪及枪头、1.5 ml离心管、制冰机、三角推棒、酒精灯、细菌培养管、电泳槽及电泳仪、凝胶成像系统等。
2.试剂1）用BamH I和Xba I处理的线状pSV质粒DNA（20 ng/ul）2）用BamH I和Xba I处理的4.8 kb c-myc DNA片段（20 ng/ul）3）已连接好c-myc目的片段的pSV重组质粒DNA（5 ng/ul）4）T4 DNA连接酶（5 U/ul）及10×连接酶缓冲液（Thermo公司）5）LB培养基以及含琼脂的LB培养基铺制的平板（含抗生素）6）0.1 mol/L CaCl2溶液7）AxyPrep质粒DNA小量试剂盒（Axygen公司产品）8）无水乙醇9）BamH I（10 ug/ul）及Xbal I（10 ug/ul）（NEB公司产品）10）10×Buffer 4（NEB公司产品）11）1×TAE（0.04 mol/L Tris-乙酸；0.001 mol/L EDTA）12）γDNA Hind III Markers（0.1 ug/ul）（Thermo公司）13）6×凝胶加样缓冲液（0.25%溴酚蓝；40%（w/v）蔗糖水溶液）14）氨苄青霉素储存液（100 mg/ml）15）CelRed核酸染料（10000×in water）（Biotium公司产品）四、实验步骤1.目的基因c-myc与pSV质粒载体的连接目的基因片段（4.8 kb），25 ng/ul 4 ul载体DNA（3.5 kb），25 ng/ul 4 ul10×buffer 1 ulT4 DNA连接酶（5 U/ul）0.5 ulddH2O 0.5 ul总体积：10 ul混匀，16℃水浴锅温浴2. CaCl2法制备感受态细胞1）取0.1 ml大肠杆菌HB101培养物，加至3 ml LB培养液中，37℃振摇约2 h，细胞长至云雾状。
第二章56 目的基因连接及导入
几种重要的
活性
工具酶
限制性核酸 识别特异碱基
内切酶序列，切割DNA
DNA连接酶 催化DNA5ˊ磷酸与3ˊ-羟基 形成磷酸二酯 键
DNA聚合酶 以DNA为模板 合成DNA
逆转录酶 以RNA为模板 合成cDNA
碱性磷酸酶 切除5－末端磷 酸
T4多聚核苷 催化核酸5'酸激酶羟基磷酸化
末端脱氧核苷 催化3'-端合 酸转移酶成同聚尾
合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割,产生粘性末端→连 接，构建重组DNA。 用接头连接
用同一种 限制性内切酶酶切 DNA连接酶 重组质粒 质粒 目的基因 + + DNA连接酶 接头(linker) 本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点！ （四）同源多聚尾连接法
尾接法
DNA连接酶 重组质粒 质粒 目的基因 内切酶 末端转移酶 +dGTP 末端转移酶 +dCTP 本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点 基因与载体的平末端连接方法有哪些？ (1)T4DNA连接酶法
点： ①基因结构相对简单，其基因表达调控机制研究比较清楚，便于基因工 程操作； ②培养简单，适于大规模生产，成本低廉；③可以分泌表达，便于产物 的提取和加工； ④不产生毒素，是安全的受体细胞。 真核生物细胞-酵母受体细胞 植物细胞作为受体细胞，除了真核细胞共有的特性外，最突出的优点就 是其体细胞的全能性，一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗 传的植株或品系。 不足之处是植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁，不利于摄取重组 DNA 分子。 动物细胞同样可以作为受体细胞。早期多采用生殖细胞、受精卵细胞或 胚细胞作为受体细胞，近年来干细胞成为新的研究热点。 原核生物细胞，大肠杆菌 优点：结构简单，便于操作分析 缺点：表达蛋白可能没有活性 真核生物细胞，酵母 优点：表达蛋白加工具有活性 缺点：操作相对麻烦 大肠杆菌是目前基因工程中最常用的受体细胞。
基因工程基本操作过程(目的基因与运载体结合)
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（四）人工接头连接法
人工接头（DNA寡核苷酸连杆）是人工合成 的具有一个或数个特定 限制性内切酶识别和 切割序列的双股平端DNA 短序列。 由平端加 上新的酶切位点，再用限制酶切除产 生粘性 末端，而进行粘端连接。
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优点：是进行DNA重组的一种既有效又实用的手 段，兼具有同聚物加尾法和粘性末端连接法的优 点，而且它可以根据实验的不同要求，设计出具 有不同限制酶位点的人工接头。若在体外连接反 应中增加人工接头的浓度，还会大大提高平末端 DNA片段间的连接效率。
植物具有了原先没有的全新的性状，这引起了一 场农业革命。如今，转基因技术已经开始广泛应 用，如抗虫西红柿、生长迅速的鲫鱼等。
1997年世界十大科技突破之首是克隆羊的诞
生。这只叫“多利”母绵羊是第一只通过无性繁
殖产生的哺乳动物，它完全秉承了给予它细胞核
的那只母羊的遗传基因。“克隆”一时间成为人
们注目的焦点。尽管有着伦理和社会方面的忧虑，
⑶PCR法：通过PCR(聚合酶链反应)技术扩 增外源DNA 片段，从而加上合适的限制性 内切酶的单一识别序 列，再用限制酶切加 以解决。
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（三）同聚物加尾法
同聚物加尾连接：利用末端转移酶在载体及外源双 链DNA的3′端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘 性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同 的寡聚核苷酸。dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接 酶的作用下, 连接成为重组的DNA。这种方法可适 用于任何来源的DNA片段。
合成的寡核苷酸的等摩尔混合物，而两个寡聚体可形成带一个
或多个限制性酶切位点的平端双链体。因此在平端DNA加接
目的基因与载体的连接实验注意事项
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第五章 目的基因与载体连接 2
第五章目的基因与载体的连接内容提要•基因重组克隆与亚克隆•基因重组对载体的要求与载体类型•连接前的处理•黏性末端连接•平端连接•人工接头连接•同聚寡核苷酸末端连接第一节基因重组克隆与亚克隆外源基因的获取载体的选择与构建外源基因与载体的切割与修饰外源基因与载体的连接（DNA体外重组）目的基因的表达重组DNA导入受体细胞重组体的筛选体外重组就是指目的基因与载体DNA的连接。
基因重组是靠DNA连接酶将适当切割的DNA即目的基因与载体共价连接。
DNA连接酶能催化相邻或两侧的DNA上裂口核苷酸裸露的3’-羟基和5’-磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA裂口连接起来。
在分子克隆中中，最有用的连接酶是来自于T4噬菌体的DNA连接酶——T4连接酶，该酶需要ATP作为辅助因子。
注意：在连接之前，应结合研究目的基因的特性，来设计最终构建的重组体分子。
一、体外连接重组DNA的特点1、DNA体外连接减少了DNA分子进入宿主细胞后遭受降解的危险，增加了转化效率；2、由于限制性内切酶产生的黏端在体外连接，使原来酶的识别序列在整个DNA维持完整性，有利于在重组子转化扩增以后再对外源基因的分离；3、连接时可以控制连接反应条件，有利于形成环状分子或者几个DNA片段头尾相连接的直线多联体。
基因重组克隆实质上就是DNA体外重组以及后续的转化过程。
亚克隆是指把DNA片段从某一类型载体无性繁殖到另一类型载体的过程。
例如：重组λ-噬菌体质粒亚克隆通常是将较大的克隆片段经酶切后，再将所有的小DNA片段与另一个载体连接转化的程序。
注意：进行连接反应时，要考虑载体DNA与DNA片段的比率。
例如：以自质粒载体形成环状分子，1：1。
以λ噬菌体或cos质粒为载体，形成多联体分子，二者的比例相应的就高些。
第二节基因重组对载体的要求与载体类型根据重组连接的目的，可将载体分为克隆载体和表达载体。
一、克隆载体如果所进行的重组连接暂时不考虑表达量的问题，只是为目的基因的获得或使该基因克隆、亚克隆或扩增、构建DNA文库，可以选择一般的克隆型载体。
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第五章目的基因与载体的连接内容提要•基因重组克隆与亚克隆•基因重组对载体的要求与载体类型•连接前的处理•黏性末端连接•平端连接•人工接头连接•同聚寡核苷酸末端连接第一节基因重组克隆与亚克隆外源基因的获取载体的选择与构建外源基因与载体的切割与修饰外源基因与载体的连接（DNA体外重组）目的基因的表达重组DNA导入受体细胞重组体的筛选体外重组就是指目的基因与载体DNA的连接。
基因重组是靠DNA连接酶将适当切割的DNA即目的基因与载体共价连接。
DNA连接酶能催化相邻或两侧的DNA上裂口核苷酸裸露的3’-羟基和5’-磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA裂口连接起来。
在分子克隆中中，最有用的连接酶是来自于T4噬菌体的DNA连接酶——T4连接酶，该酶需要ATP作为辅助因子。
注意：在连接之前，应结合研究目的基因的特性，来设计最终构建的重组体分子。
一、体外连接重组DNA的特点1、DNA体外连接减少了DNA分子进入宿主细胞后遭受降解的危险，增加了转化效率；2、由于限制性内切酶产生的黏端在体外连接，使原来酶的识别序列在整个DNA维持完整性，有利于在重组子转化扩增以后再对外源基因的分离；3、连接时可以控制连接反应条件，有利于形成环状分子或者几个DNA片段头尾相连接的直线多联体。
基因重组克隆实质上就是DNA体外重组以及后续的转化过程。
亚克隆是指把DNA片段从某一类型载体无性繁殖到另一类型载体的过程。
例如：重组λ-噬菌体质粒亚克隆通常是将较大的克隆片段经酶切后，再将所有的小DNA片段与另一个载体连接转化的程序。
注意：进行连接反应时，要考虑载体DNA与DNA片段的比率。
例如：以自质粒载体形成环状分子，1：1。
以λ噬菌体或cos质粒为载体，形成多联体分子，二者的比例相应的就高些。
第二节基因重组对载体的要求与载体类型根据重组连接的目的，可将载体分为克隆载体和表达载体。
一、克隆载体如果所进行的重组连接暂时不考虑表达量的问题，只是为目的基因的获得或使该基因克隆、亚克隆或扩增、构建DNA文库，可以选择一般的克隆型载体。
例如：M13单链噬菌体载体——双链复制型和单链型。
双链复制型可作为克隆载体，克隆外源基因后，可以其单链形式作为模板，复制后进行序列分析。
基因重组的目的，就是使外源基因能够大量的在宿主中扩增，因此常用的克隆载体是质粒。
质粒能高拷贝复制，带有多个单一的酶切位点和抗药性标记。
质粒载体中没有强的启动子，因为只能作为克隆载体。
二、表达在载体表达性载体能够使目的基因在宿主细胞内进行高效表达，载体具有强启动子和正确的终止子，能高效、高拷贝地转录目的基因，并产生稳定的mRNA和翻译蛋白质。
例如：要想获得大量的目的基因的表达产物——表达型载体在为了获得目的基因克隆的基础上，想使目的基因的表达产物容易检测——表达型载体（一）、根据目的基因产生的蛋白质序列，表达载体可分为融合型表达载体和非融合型表达载体。
（第十章）（二）、强启动子组建的高表达载体一般有三类：1、含λ噬菌体的PL启动子的质粒：λ噬菌体的PL启动子是一个很强且易于调控的启动子。
例如：质粒pPLa2311就是在质粒pBR322中加入PL启动子的质粒载体。
2、含lac启动子的质粒：lac启动子是大肠杆菌乳糖操纵子内半乳糖酶基因（lacZ基因）前的一个强启动子。
例如：质粒载体Pop203-13和pB-galBC。
3、含trp启动子的质粒：trp是大肠杆菌色氨酸操纵子中的强启动子。
例如：pNCV质粒载体，曾经成功用于人流感病毒血凝素和口蹄疫病毒VP3抗原的表达。
为了进一步提高启动子的强度，使目的记忆高效表达，将上述的lac启动子和trp启动子串联起来，提高了转录速度。
例如pTAC12质粒载体。
病毒载体大都含有较强的启动子，能保证插入的外源基因有效转录和表达，且转染的效率要高于转化，因而也长作为目的基因的表达载体。
第三节连接前的处理为了提高连接效率，需要在连接前将载体DNA和目的基因分别进行处理。
一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子。
载体DNA通常有许多酶切位点，但并不是所有的酶切位点可用于重组切割。
一、理想的酶切位点应符合下列几个条件1、位于载体上特定的酶切位点要尽可能的少，最好是单一酶切位点，这样才能保证目的基因和载体DNA 以最该的概率正确组合；例如：pBR322上的BamⅠ（tet r）和PstⅠ（amp r），通过插入失活和“影印法”筛选重组体。
2、在酶切位点之前要有一个较强的启动子，使插入的目的基因可在该启动子的指导下高效表达。
例如：高效表达质粒pMH621的galⅡ位点前有一个OMP 多肽基因启动子OMPF，外源基因插入后可表达出外源基因与OMP多肽融合的蛋白。
OMP多肽是细菌外膜蛋白的主要成分，因而可使外源基因在细菌外抹上表达，有利于产物的收获和提取。
3、选择的载体必须在连接重组后对基因转录和翻译过程中的编码区读框不变。
在基因重组前，除载体DNA要处理外，目的基因也要进行切割和修饰，才能进行有效连接，而且必须考虑目的基因插入载体后与载体启动子之间的距离，务必要使目的基因在转录时处于正确的阅读框架之中，以便表达出原有的多肽序列。
载体DNA和目的基因DNA的连接，按DNA片段末端性质的不同，目前可用下述的几种方法进行连接：•黏性末端连接法•平端连接法•同聚物加尾连接法•人工接头连接法第四节黏性末端连接一、黏性末端（黏端）连接有三种方式：•单酶切位点的黏端连接•双酶切片段的定向克隆•不同限制酶切位点的黏端连接二、单酶切位点的黏端连接由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。
1、切割后的DNA片段要满足一下两点要求：•酶切割后产生单链突出的黏性末端•酶切位点附近的DNA序列不影响连接哺乳动物DNA 片段细菌质粒载体DNA CCGGCCGG GGCC GGCC 限制酶Hpa Ⅱ消化CGGC GGC C +CCGG GGCCCGGC C GGC 混合、退火T4DNA 连接酶重组质粒图：同一限制性酶切DNA 黏性末端连接2、同一限制性内切酶酶切后的片段，连接过程中可能产生以下几种结果：•基因之间的连接•载体DNA之间的连接•载体DNA头尾之间的连接•载体DNA与目的基因之间的连接自身环化自身环化是最常见的干扰重组的因素，实际操作中必须控制自身环化现象的发生。
图3、优缺点同限制酶切位点连接的方法是最简单也是最方便的克隆途径。
但该方法又有外源DNA与载体DNA自身都容易环化、可双向插入、多拷贝插入、高背景和假阳性等缺点。
4、相应的措施（1）、克服高背景：载体与外源DNA自身的环化不利于重组连接，大大降低了阳性克隆率，又使非重组载体造成高背景。
•通过调整反应时外源DNA和载体DNA的浓度来限制载体DNA自身环化，或者通过遗传学技术来鉴别重组体与非重组体。
（2）、保证定向插入：由于是单一位点，目的基因可以以不同方向插入载体。
对于克隆扩增问题不大，因为克隆上去的基因再重组时又要切下来；对于表达载体目的基因必须按5’－3’方向克隆在启动子下游，目的基因的转录是从起始密码子向终止密码子方向定向转录的，一旦启动子与目的基因编码方向相反就不会正确转录目的基因的mRNA。
（3）、克服载体自身的环化：连接过程中，载体自身除了环化外，还能形成串联寡聚物。
用高浓度的DNA（目的基因：载体为3：1）和牛小肠碱性磷酸酶（CIP）处理载体，去除5’－P使之不能自身环化，缺口在宿主内可得到修复。
图三、双酶切片段的定向克隆以两种不同的限制性内切酶切割目的基因，使之产生两个不同黏端，对载体也同样的处理，形成载体DNA和外源DNA两端为非同源的黏端，来防止DNA自身环化，且只能在DNA连接酶的作用下，载体DNA和外源DNA片段以两端互补来实现DNA定向插入。
（图）定向克隆：指使外源DNA片段定向插入到载体分子的克隆方案。
1、双酶切片段的定向重组方式的优点：（1）、外源DNA只能以一个方向定向插入到重组质粒，以便目的基因的正确转录和表达；（2）、质粒载体与外援DNA结合处的限制酶切位点仍然保留，有利于目的基因的分离和提取；（3）、由于不会发生环化，转化率较高，转化后的细菌克隆大多数携带有插入目的基因的重组质粒。
2、定向克隆的连接方式（1）、外源DNA和载体DNA经过两个内切酶酶切后为非同源互补的黏端连接（黏-黏连接）；（2）、外源DNA和载体DNA经过两个内切酶酶切后一侧为互补的黏端，一侧为平端或由非互补的黏端不平后产生的平端连接（黏-平连接）；其中黏-黏连接效率非常高，是重组方案中最有效而简捷的途径。
四、不同限制酶切位点的黏端连接由两种不同的限制性内切酶切割的DNA片段，具有相同类型的黏性末端，彼此称为匹配末端（配伍末端），末端的连接方式与单酶切位点的黏端连接方式类似。
同尾限制酶：来源各异，识别的靶序列不同，切割后产生相同的黏性末端，能够通过其黏性末端之间的互补作用彼此可以被DNA连接酶重组。
（图）同裂限制酶：来源不同，识别的相同的序列，但切割位点不同。
经过同裂限制酶切割后的DNA与载体连接前，还必须进行处理。
第五节平端连接一些限制性内切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割产生的DNA 片段没有黏性末端，而是平末端。
具有平端的酶切载体只能与平端的外源基因连接。
平端连接比黏性末端连接要困难得多，连接效率只有黏端连接效率的1%，因此在平端DNA的连接中，需要加大DNA和连接酶的浓度。
在该条件下，常出现多联体连接。
二、人为处理黏端成为平端的两种方法：1、添补法：利用DNA聚合酶Ⅰ的大片段（Klenow片段）将5’突出黏性末端补齐，补齐后去磷酸化处理后，用T4DNA连接酶连接。
（图）2、削除法：利用DNA聚合酶的3’-5’外切酶酶活性，对含3’突出的黏性末端补平，或利用S1和Bal31等核酸酶将目的基因黏端的单链突出部分削平后连接。
3’端突出端只能切平是因为DNApol合成需要引物（加在3’－OH末端）且只能按5’－3’方向。
（图）第六节人工接头连接人工接头（衔接物或适配子）：指人工合成的具有一个或是个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。
其分子长度约为8-12bp，具有一定碱基序列，在其序列内具有一个或多个限制性内切酶识别位点。
利用人工合成的接头可以很方便地将具有平端的DNA片段结合到可怜载体上。
一般用连接酶将人工接头连接到外源片段的两端，利用内切酶切割成黏性末端，最后利用连接酶连接。
此方法适用于没有所需限制酶切位点的外源片段。
1、人工接头连接平端的DNA片段（图）2、人工接头连接黏端的DNA片段注意：人工接头的选择要以外源片段上的限制酶识别位点为主，要避免二者具有相同的酶切位点，都在会给后续其它操作带来麻烦。