第五章目的基因的克隆
目的基因的克隆实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子克隆技术，将目的基因从基因库中提取并克隆到合适的载体上，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是基因工程的核心技术之一，其基本原理是将目的基因片段与载体DNA片段通过酶切、连接等步骤形成重组DNA分子，然后将重组DNA分子导入宿主细胞进行扩增和表达。
三、实验材料1. 实验试剂：限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs、质粒载体、目的基因DNA、LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG、X-Gal、0.1 M MgCl2、0.1 M CaCl2等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、恒温培养箱、显微镜、超净工作台等。
四、实验步骤1. 目的基因的获取（1）设计引物：根据目的基因的序列，设计特异性引物，引物5'末端带有酶切位点。
（2）PCR扩增：以目的基因DNA为模板，PCR扩增目的基因片段。
（3）PCR产物回收：采用PCR产物回收试剂盒回收目的基因片段。
2. 载体与目的基因的连接（1）载体线性化：用限制性核酸内切酶酶切质粒载体，获得线性化载体。
（2）连接反应：将回收的目的基因片段与线性化载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接。
（3）连接产物转化：将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中。
3. 重组子筛选与鉴定（1）菌落培养：在含有IPTG和X-Gal的LB固体培养基上培养转化菌，挑选白色菌落。
（2）菌落PCR鉴定：以白色菌落为模板，进行PCR扩增，检测目的基因片段是否插入载体。
（3）重组子测序：对PCR鉴定阳性的重组子进行测序，验证目的基因片段是否正确插入载体。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过PCR扩增，成功获得了目的基因片段。
2. 菌落PCR鉴定结果：白色菌落PCR鉴定阳性，表明目的基因片段已插入载体。
3. 重组子测序结果：测序结果显示，目的基因片段正确插入载体。
六、实验结论本实验成功克隆了目的基因，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定了基础。
第讲 目的基因的克隆与分离
第讲目的基因的克隆与分离引言目的基因是指在一项研究中，具有研究意义或实际应用价值的基因。
目的基因克隆和分离是分子生物学研究的重要环节，它们为后续研究提供了基础和保障。
本文将介绍目的基因克隆和分离的方法和技术。
一、目的基因的克隆1. PCR扩增PCR是聚合酶链反应的简称，是一种利用DNA聚合酶酶作用、在体外增加DNA序列数量的技术。
PCR扩增可以在保证目的基因序列一致性的前提下，扩增出足够的DNA量，用于后续实验。
PCR扩增的步骤一般包括模板DNA的选择、引物的设计和勘误、PCR反应体系的搭建等。
2. 基因文库筛选基因文库指的是将一个或多个组织的基因在体外克隆并构建而成的基因库。
基因文库筛选是一种在文库中选取目的基因的方法。
其中最常用的是基于杆菌的蛋白表达文库、细胞质体DNA文库和DNA合成文库。
基因文库筛选的步骤一般包括构建文库、传统筛选和高通量筛选。
3. 限制性内切酶切割限制性内切酶切割是指利用特定的酶切位点将DNA分割成碎片，然后选取目标DNA寻找需要的限制酶切片段的方法。
这种方法可以快速而准确地寻找目的基因，并进行克隆。
限制酶切割的步骤一般包括DNA提取、DNA质量检测、选取限制酶和体外反应等。
二、目的基因的分离1. 分子杂交分子杂交是指在体外或体内使某一脱氧核糖核酸（DNA）与另一种DNA或核酸杂交而形成方法的过程。
它的作用是寻找与目的基因DNA互补的DNA序列，并在该序列中分离目的基因。
分子杂交的步骤主要包括细胞培养和DNA序列的寻找和筛选等。
2. 化学合成化学合成是指通过化学方法合成目的基因的方法。
这种方法可以直接合成目的基因，只要知道目的基因的序列就可以了，不需要进行PCR扩增、克隆等操作。
化学合成的步骤主要包括碱基合成、链延伸、中间产物合成和连接、滤液等。
3. 通量基因测序通量基因测序也称为高通量测序，是一种快速且准确测定DNA或RNA序列的方法。
通过对目的基因进行测序，可以快速分离目的基因。
分子生物学-第5章-分子生物研究法(上)精选全文完整版
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸 水解酶
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
分类: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae 自主 复制能力的 DNA分子（ vector），如 病毒、噬菌体 和质粒等小分 子量复制子都 可以作为基因 导入的载体。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记 实验或用来进行DNA的连接 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸
从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸
从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
1972 - Paul Berg,
Produced first recombinant DNA using
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术
5.1 重组DNA技术回顾
三大成就 ：
1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体 是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
• 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。
目的基因的制备和基因克隆的筛选
contents
目录
• 引言 • 目的基因的制备 • 筛选策略与方法 • 实验结果与数据分析 • 结论与展望
01 引言
目的基因的重要性
决定生物性状
目的基因是生物体内控制特定性 状表达的关键基因，其序列和表 达水平直接影响生物的表型特征。
潜在应用价值
目的基因往往与生物体的生长、 发育、代谢等关键过程密切相关， 因此具有潜在的应用价值，如用 于基因工程、生物制药等领域。
限制性内切酶酶切分析
利用限制性内切酶对DNA进行酶切，通过凝胶电泳分析酶切片段的大小和数量，判断 目的基因是否插入到载体中。
Southern杂交分析
将酶切后的DNA片段转移到固相支持物上，与特异性探针进行杂交，通过放射自显影 或化学发光等方法检测杂交信号，确定目的基因的存在和位置。
PCR筛选
菌落PCR筛选
05 结论与展望
实验结论总结
成功制备了目的基因
通过PCR扩增和基因合成等方法，成功获得了所需的目的 基因片段，为后续实验提供了基础。
建立了基因克隆筛选体系
通过构建重组质粒、转化宿主细胞、筛选阳性克隆等步骤， 成功建立了基因克隆的筛选体系，为后续基因功能研究提 供了有效手段。
验证了基因功能
通过基因表达分析、蛋白互作研究等方法，初步验证了目 的基因在细胞中的功能和作用机制。
重组DNA的转化与扩增
重组DNA的转化
将重组DNA分子导入到合适的宿主细胞中，如细菌、酵母或哺乳动物细胞等，使其获得新的遗传特性 。
重组DNA的扩增
通过选择培养基筛选阳性克隆，并进行扩大培养，以获得足够的重组DNA分子用于后续实验。同时， 可以通过PCR等方法对重组DNA进行进一步验证和鉴定。
基因的克隆与表达PPT课件
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二．原核生物基因结构和表达特点
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1. 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
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3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
• PCR过程中，普通的Taq酶可在产 物的3’端多加一个A
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五、基因克隆的工作流程
（一）目的基因的获得
1、直接分离3、构建cDNA4、PCR5、人工合成
6、差异显示
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1、直接物的基因组DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后 导入宿主细胞，进行克隆。这些存 在于所有重组
11
三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是 重组体扩增的场所。
2、要求：易于接纳外源DNA
无特异的内源性核酸内切酶
载体复制、扩增不受阻
与载体有互补性
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四、体外重组的策略
1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 • 最方便简单 • 高背景-载体自身环化 • 双向插入
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2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
基因的克隆与表达
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1
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
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2
基因克 隆 Gene Cloning
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3
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
基因工程思考题
《基因工程》思考题第一章绪论1. 简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。
2. 为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？3. 简述基因的结构组成对基因操作的影响。
4. 谈谈你对gene的认识，并简要说说gene概念的演变过程.5. 如何理解gene及其产物的共线性和非共线性？6. 试从理论和技术两个方面谈Gene Engineering诞生的基础.第二章基因工程的基本原理与支撑技术1. 试比较原核基因组与真核基因组的结构和功能特点2. 试比较原核基因和真核基因表达调控的主要方式和特点3. 分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？4. 琼脂糖凝胶电泳中，简述影响DNA在凝胶中迁移速率的因素.5. 小量制备质粒DNA，用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因及克服方法？6. 在基因操作实践中有哪些检测核酸和蛋白质分子量的常规方法？7. 印迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下需要使用这些方法。
8. 核酸分子的标记有哪些方法，各有何特点？9. 由mRNA反转录成cDNA和DNA的PCR扩增是两个完全不同的酶催化反应过程，如何将两个过程联系在一起，实现由mRNA起始扩增出DNA？10. Primer是PCR反应体系的四大要素之一，PCR的许多应用都是通过primer设计来实现的，请问primer设计的一般原则是什么？11. 在PCR反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateau effect），请问什么叫Plateau effect？产生Plateau effect的原因有哪些？12. 在对PCR产物进行电泳检测时，有时会出现拖带或非特异性扩增条带，请分析其原因？如果检测结果是看不到DNA带或DNA带很弱，那又是为什么？13. 通过双向蛋白质电泳发现某蛋白质与某植物的一种表型密切相关，若要利用编码该蛋白质的基因来转基因植物，试问如何分离得到该基因？14. 现有一序列已知的DNA片段和一序列未知的DNA片段，你分别如何设计测序策略？15. 设想一下在什么情况下你希望知道一个基因或一段DNA的序列？16. 什么叫有性PCR？有性PCR导致DNA重组的分子机制跟体内重组有何异同？17. Explain the PCR. List the steps in carrying it out; include all the components and special conditions, explaining why each one is used. Illustrate the process with appropriate labels. Use the correct scientific terminology in your explanation.第三章基因工程操作的基本条件1. 试指出影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素.2. 在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？3. 何谓Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法.4. 某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？5. 天然的质粒载体（plasmid vectors）通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段，引入多克隆位点等。
目的基因的克隆与基因文库的构建
mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，
分离纯化困难
仅限于克隆蛋白质编e Chain Reaction）法，又称为聚合酶
链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序
使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的
基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必
需的双引物
PCR法定向扩增目的基因的基本原理
C PCR法
5‘
5‘
目的基因
5‘
变性
加热
5‘
5‘
引物
退火
5‘
5‘
底物
聚合
5‘
5‘
5‘
5‘
加热
变性
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
克隆入合适的载体
Klenow酶聚合
化学合成法的基本战略
全基因合成
1
混合退火
2
T4-DNA连接酶连接
3
克隆入合适的载体
4
Klenow酶聚合
5
大片段酶促法： 根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段
6
化学合成法的基本战略
全基因合成
上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%
分子生物学第五章课后思考题答案【修订版】
分子生物学第五章作业1、哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生及发展？答：近半个世纪来，分子生物学主要取得了三大成就：第一，20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。
但事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。
其中，限制性内切核酸酶和DNA连接酶等工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。
DNA重组技术的产生及发展过程中比较重要的科学发现和实验如下：1957年A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。
1965年S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。
1967年年世界上有五个实验室几乎同时宣布发现了DNA连接酶。
1970 年H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。
H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。
1972-1973 年H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。
1978 年首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。
1981 年R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。
1982 年美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。
目的基因T载体克隆实验步骤
目的基因T载体克隆实验步骤pcr产物的t载体克隆一.重组质粒的构建：重组的dna分子就是在dna连接酶的促进作用下，存有mg切的载体分子与外源dna分子进行连接。
dna连接酶存有两种：t4噬菌体dna连接酶和大肠杆菌dna连接酶。
两种dna连接酶都存有将两个具有相同粘性末端的dna分子连在一起的功能，而且t4噬菌体dna连接酶除了一种大肠杆菌dna连接酶没的特性，即为能够并使两个平末端的双链dna分子连接起来。
但这种相连接的效率比粘性末端的相连接率为高，通常可以通过提升t4噬菌体dna 连接酶浓度或减少dna浓度去提升平末端的相连接效率。
t4噬菌体dna连接酶催化剂dna 连接反应分成3步：首先，t4dna连接酶与辅因子atp构成酶-atp复合物；然后，酶-atp 复合物再融合至具备5’磷酸基和3’羟基切口的dna上，并使dna腺苷化；最后产生一个代莱磷酸二酯键，把切口封出来。
连接反应通常将两个相同大小的片断相连。
很多dna聚合酶在进行pcr扩增时会在pcr产物双链dna每条链的3’端加上一个突出的碱基a。
pucm-t载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的t。
这样，pucm-t载体的两端就可以和pcr产物的两端进行正确的at配对，在连接酶的催化下，就可以把pcr产物连接到pucm-t载体中，形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有助于连接酶的活性。
但是在这个温度下黏末端的氢键融合就是不稳定的。
因此实行折衷的温度，即12-16℃，相连接12-16h（过夜），这样既可以最大限度地充分发挥连接酶的活性，又兼具至较长时间接合结构的平衡。
2、atp存有的相连接缓冲器系统中，将分别经酶二.感受态制备原理细菌在0ccacl2低渗溶液中胀变成球形，遗失部分膜蛋白，沦为难稀释外源dna的状态。
三.β-半乳糖甘酶显色反应选择法（蓝白筛选）原理lacz基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。
5第五章现代分子生物学研究方法——DNA、RNA及蛋白质操作技术
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳 以琼脂糖凝胶电泳为例：
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小， 其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其其分辨能力 就越弱。
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
溴化乙锭（ethidium bromide，EB）能插入到DNA或RNA分子的相 邻碱基之间，并在紫外灯光照射下发出荧光，所以常用EB来检测凝 胶介质中的核酸条带。
x 25 中的聚合酶可能很多正处于复制状态，
如果此时降到室温，将会影响最终产 率。所以再留出5分钟，以使正在复制 中的DNA能够复制完全，以合成更多 的目的分子。
DNA的基本操作技术——重组载体构建 PCR完成之后，需要有什么操作？
DNA的基本操作技术——重组载体构建
DNA的基本操作技术——重组载体构建
转化（transformation）：是指重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合 进入受体细胞（一般指细菌），并在受体细胞内稳定维持与表达的 过程。
转染（transfection）：是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而 获得新的表型的过程。（与转化类似，只是受体细胞不同）
转导（transduction）：是指通过病毒（如λ噬菌体）颗粒感染宿主细 胞将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
常用的PCR反应体系：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板、缓冲液。
常用的PCR反应程序：
预变性 95℃ 3 min
变性 95℃ 30 s
退火 55℃ 30 s
x 25
延伸 72℃ 1 min
目的基因的克隆
●目的基因的克隆1.鸟枪法随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中别离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。
鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆别离。
鸟枪法克隆目的基因的根本战略:A.染色体DNA的切断a)超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。
b)全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控。
c)局部酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。
B.与载体连接a)如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，那么选择多拷贝克隆载体；b)如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，那么选择表达型载体。
C.转化受体细胞D.筛选含有目的基因的目的重组子2.cDNA法A.完备别离程序提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于适宜的筛选手段找到目的重组子。
完备别离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等。
B.特异别离程序提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳别离，回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆。
特异别离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆如血红蛋白基因等。
C.差异别离程序利用两组细胞mRNA种类的差异，别离克隆差异mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于别离克隆新基因。
例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之前方可转录。
任务是要别离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能。
双链cDNA的克隆A.平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收。
B.平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段C.加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收3.PCR法使用PCR技术克隆目的基因的前提条件是：待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反响所需的双引物。
目的基因的克隆方法
目的基因的克隆方法
1. 直接克隆法呀，这就好比你直接去商店挑了一个你最喜欢的玩具，简单又直接！比如说，我们想克隆某个特定基因，就像你一眼看中那个可爱的小熊玩偶，直接把它拿过来就行啦。
2. 还有反转录克隆法哦，哎呀，就好像把一段声音录下来再倒放出来一样神奇！比如从细胞中的 mRNA 反转录得到 cDNA，不就是很有趣的过程嘛？
3. 载体介导克隆法呢，就好像给基因找了一辆专门的车来运输它！像把基因放到特定的载体里，让它顺利到达目的地。
4. 基因文库筛选法呀，哇，这就像是在一个超级大的宝库中找宝贝！比如说在庞大的基因文库中去努力找到我们想要的那个目的基因。
5. PCR 扩增克隆法哟，这就跟变魔术一样厉害呢！比如通过 PCR 技术把特定基因大量扩增出来，好神奇呀！
6. 杂交捕获克隆法，哈哈，就好像用一个小陷阱去抓住我们想要的基因！像是专门设计来抓住目标基因一样。
7. cDNA 末端快速扩增法，这不就像是跑步冲刺一样快速到达终点嘛！像快速扩增 cDNA 的末端，得到我们要的基因片段。
8. 人工合成克隆法，哇塞，这可真牛，就像自己动手做一个超级厉害的东西出来！比如人工合成一些小的基因片段呢。
9. 染色体步移克隆法，嘿嘿，就好像一步一步探索一个神秘的地方一样！像是沿着染色体逐步找到我们的目的基因。
我觉得这些目的基因的克隆方法都超级有趣，各有各的神奇之处呀！真的是让我们对基因世界的探索更加丰富多彩了呢！。
基因工程 第五章目的基因的获取
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入1220个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶 合成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA mRNA 5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶 Oligo dT引物
5’
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ：
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。
随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法 （1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I
BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。 （1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。
目的基因克隆[方案]
![目的基因克隆[方案]](https://img.taocdn.com/s3/m/17a5319082d049649b6648d7c1c708a1284a0a9b.png)
一、目的基因克隆的策略有哪些？其理论依据什么？如何根据具体条件，如目的性状的特点，已知控制目的性状的基因的信息合理选择基因克隆的方法？1、主要有以下几个克隆的策略：（1）PCR法分离目的基因：从蛋白质的一级序列分析得到核酸序列的相关信息，设计简并引物，通过对mRNA进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板，然后将目的基因通过PCR方法扩增，或者直接从基因组DNA扩增的方法。
（2）核酸杂交的方法：通过对蛋白质的氨基酸序列分析，设计简并引物，通过核酸杂交的方法从基因文库中筛选得到目的基因。
（3）免疫学筛选法分离目的基因：利用免疫学原理，通过目的蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的蛋白基因。
2、若控制该性状的目的蛋白质不容易分离纯化，这PCR方法比较适宜，若蛋白质分离纯化容易，且有现成的基因文库，则后两种方法较为简单。
二、蛋白组学方法克隆目的基因的理论依据是什么？有哪些技术环节？要用到哪些技术？1、理论依据：以分离纯化的目的蛋白为研究起点，通过对目的蛋白的一级结构分析，获得起码的氨基酸序列信息后，反推可能的DNA序列，然后设计引物，从cDNA中将目的基因扩增出来，或者设计核酸探针，通过杂交技术将目的基因从基因文库中筛选出来。
或通过抗体抗原免疫反应从表达文库中将该基因分离出来。
2、技术环节是确定并制备出高纯度的蛋白质。
3、所需要的实验技术有：蛋白质的双向电泳技术，由第一向的等电聚焦电泳和第二向的SDS-PAGE电泳组成；蛋白质氨基酸序列分析。
三、基因组学方法克隆基因的策略有哪些？各有什么特点？如何选择恰当的基因组学方法克隆目的基因？1、基因文库筛选方法通过对基因文库的筛选将目的基因分离出来，一般有两种方法：核酸杂交法，原理是分子杂交；PCR筛选法，通过ＰＣＲ方法将目的基因分离出来，对于以混合形式保存的文库，先将文库分成几份，每份为一个“反应池”进行PCR反应，待选出阳性池后，将阳性池的混合克隆稀释，然后等量分置96孔板中，进行横向池及纵向池的ＰＣＲ反应，然后将阳性菌落群进行稀释，重复上述工作，直到筛出阳性单克隆。
第五章目的基因的获取
目的标签法、非目的标签法
五、图位克隆（mapbased cloning）获 得目的基因
图位克隆：又叫定位克隆，1986年首先由剑
桥大学的Alancoulson提出。
根据目的基因在染色体上的位置进行分离基因，
无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先
六、mRNA差别显示技术（mRNA differential display）获得差异表达的基因
mRNA差别显示技术：对组织特异性 或诱导专一性表达基因进行分离的有效方 法之一。将mRNA逆转录和PCR技术相 互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技 术，也称为DDRT-PCR，
DDRT-PCR理论基础
3’ 5’
template templat因库（gene pool）：特定生物体全基因组的
集合（天然存在）e bank） 通过克隆的方法将某一基因组DNA或mRNA 保存于适当宿主菌中形成的转化子群。所有重 组DNA组合代表该基因组的全序列。
探针：目的基因局部片段、由氨基酸序列
获得的简并序列、近缘物种的同源序列
四、转座子标签法获得目的基因
（一）转座子的相关知识
转座子（transposon,Tn）:指位于染色体上
可以从基因组的一个位置转移到另一个位置的 DNA片段或基因。（jumping gene）
简单转座子：除转座所需基因外不携带任何
实验结果： 240组在能分出20000多条带！ 如果每条带相当于一种特定mRNA， 20000 mRNA基本上反映了一种特定细 胞中全部的mRNA。
DDRT-PCR操作步骤
*差异分离目的基因程序
利用两组细胞mRNA经过DDRT-PCR
后，分析比较cDNA种类的差异，分别回收 cDNA测序隆新基因。
5-目的基因的重组导入
转化 加入 1mLSOC 培养液
10-100L转化液涂 含抗菌素的平板
（3） 平板 培养细菌
10-100L转 化液
涂于含抗 菌素的平 板
37℃过夜
4.转化率和影响转化率的因素
每gDNA转化成功的细菌克隆数 总受体细胞所获的转化成功的细菌数
（1）重组质粒
①环形质粒数 环形重组质粒 质粒自我连接 线性载体或DNA片段进入细菌会被降解。
收DNA复合物，球状细胞复原并分裂增殖。在选择性培 养基平板上可挑选所需的转化子。简单，但转化效率不
高（106-108/gDNA）。
10ng载 体DNA 100L感 受态菌 10-100L转化 液涂含抗菌素 的平板
吸附DNA On ice混 合，静置 10分钟
摄入DNA 42º C 1.5分钟
二乙氨乙基葡聚糖能促进哺乳动物细胞摄入外 源DNA。
1
葡聚糖 DEAE
预处理
细胞
摄入
外源DNA
2
外源DNA
混合
细胞
吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可 以进入到细胞核里。 DEAE对细胞有毒!
本章思考题（3）
1、重组DNA分子在导入受体前如何保证插入的正确？ 2、受体的选择有什么要求？ 3、导入大肠杆菌受体的方法有哪些？ 4、导入植物细胞的方法有哪些？ 5、导入动物细胞的方法有哪些？ 6、简述各种重组DNA导入法的优缺点。
但移码突变！
4. 防止载体自身环化连接 （1）提高插入片段的用量
（2）用碱性磷酸酶处理载体
5’
3’ 插入片段
载体
载体和外源DNA插入片段的连接结果
受体细胞：
原核生物细胞
真核生物细胞 酵母菌细胞
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为了最大限度地保证基因在度的断裂。制备的 DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段 的比率就越低，重组率和完备性也就越高
用常规方法制备的染色体
A
A
DNA的长度一般在100库的质量标准
除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选
一般来说，目的基因的克隆战略分为两利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然 后将之克隆表达。
A 鸟枪法
鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法操作的改进 鸟枪法克隆目的基因的局限性基因的基本概念基因的完备性
基因的完备性是指：在构建的基因中任一基因存在的概 率，它与基因最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：
N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f ) 其中大小 / 生物基因组的大小 例如，人的单倍体D隆目的基因的基本战略
随机克隆供体细胞的全基因组DNA 片段，然后通过快速有效的筛选程序从 众多克隆中分离出含有目的基因的目的 重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适 用于原核细菌目的基因的克隆分离
鸟枪法克隆目的基因的基本战略
染色体DNA的切断
超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，
大小不可控 部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整
与载体连接
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载 体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体
转化受体细胞
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作 为 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达 的受体细胞
如果先将细胞固定在低融点凝
A
A
胶中，然后置入含有SDS、蛋 白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb大小的DNA片段基因的构建程序基因组DNA的切割
用于基因组构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和 限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：
第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区 第二，保证DNA片段大小均一 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如： Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级 分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！
鸟枪法操作的改进
凝胶DNA片段回收技术
冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法
鸟枪法克隆目的基因的局限性
工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 不能获得的最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的将某生物体的全部基因组 DNA 用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的 DNA 片 段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳 性生物群落
Co物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA 种类不同（即基因将DNA片段进行分级分离
例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI 片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼 脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于 1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此 凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进 行拼接
2.0 kb 1.6 k物基因组转录的部分或全 部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组， 贮存于受体ector、λ phage vector 、 P1 phage vector et.
第五章目的基因的克隆
目离目的基因的方法 E 化学合成法
基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组 中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和 生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌 （细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回 细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。
筛选含有目的基因的目的重组子
菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）
鸟枪法操作的改进
使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA
使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。 如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA， 然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高 重组子中目的重组子的出现频率