第五章 目的基因的获得
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食品微生物学---第五章_微生物的遗传变异
烟草花叶病毒的拆开与重建实验 （部分病毒为RNA）
1.经典转化实验（肺炎双球菌）
S型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜 R型菌株：无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜
（1）动物实验 对小鼠注射活R菌或死S菌 ————小鼠存活 对小鼠注射活S菌————————小鼠死亡 对小鼠注射活R菌和热死S菌 ———小鼠死亡
（二）微生物的诱变育种
1.出发菌株选择：对诱变剂敏感、变异幅度广、产量高 的菌株。
2.同步培养：使菌悬液中细胞达到同步生长状态 3.单细胞悬液制备：先收集菌体并洗涤，然后用生理盐
水或缓冲液配制，振荡使分散度90％以上。 4.诱变处理：物理诱变、化学诱变 5.中间培养 ：使细胞内原有酶量稀释，以得到纯的变
h
36
普遍性转导过程： 噬菌体侵染供体细胞 供体染色体断裂，
噬菌体蛋白质衣壳和DNA合成 衣壳包裹供体 DNA片段 侵染受体菌株
供体DNA片段整合到受体DNA上——完全转导
供体DNA片段不能整合到受体 DNA上，也不能复制，但能表达 ——流产转导
特异性转导过程： 噬菌体侵染供体细胞 供体细胞溶源化 噬菌体和供体菌染色体间发生交换 转导型 噬菌体（转导颗粒） 侵染受体菌
R菌＋S菌 只有R菌
只有S型细菌的DNA才能将R型转化为S型。且 DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转 移给R型菌株的，是遗传因子。
2.噬菌体感染实验
h
8
85
3.植物病毒的拆开与重建实验
将TMV拆成蛋白质外壳与RNA，分别对 烟草进行感染试验，结果只有RNA能感染 烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还 能分离出正常病毒粒子。
（2）细菌培养实验 热死S菌———不生长 活R 菌———长出R菌
1.经典转化实验（肺炎双球菌）
S型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜 R型菌株：无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜
（1）动物实验 对小鼠注射活R菌或死S菌 ————小鼠存活 对小鼠注射活S菌————————小鼠死亡 对小鼠注射活R菌和热死S菌 ———小鼠死亡
（二）微生物的诱变育种
1.出发菌株选择：对诱变剂敏感、变异幅度广、产量高 的菌株。
2.同步培养：使菌悬液中细胞达到同步生长状态 3.单细胞悬液制备：先收集菌体并洗涤，然后用生理盐
水或缓冲液配制，振荡使分散度90％以上。 4.诱变处理：物理诱变、化学诱变 5.中间培养 ：使细胞内原有酶量稀释，以得到纯的变
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普遍性转导过程： 噬菌体侵染供体细胞 供体染色体断裂，
噬菌体蛋白质衣壳和DNA合成 衣壳包裹供体 DNA片段 侵染受体菌株
供体DNA片段整合到受体DNA上——完全转导
供体DNA片段不能整合到受体 DNA上，也不能复制，但能表达 ——流产转导
特异性转导过程： 噬菌体侵染供体细胞 供体细胞溶源化 噬菌体和供体菌染色体间发生交换 转导型 噬菌体（转导颗粒） 侵染受体菌
R菌＋S菌 只有R菌
只有S型细菌的DNA才能将R型转化为S型。且 DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转 移给R型菌株的，是遗传因子。
2.噬菌体感染实验
h
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85
3.植物病毒的拆开与重建实验
将TMV拆成蛋白质外壳与RNA，分别对 烟草进行感染试验，结果只有RNA能感染 烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还 能分离出正常病毒粒子。
（2）细菌培养实验 热死S菌———不生长 活R 菌———长出R菌
分子生物学-第5章-分子生物研究法(上)精选全文完整版
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸 水解酶
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
分类: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae 自主 复制能力的 DNA分子（ vector），如 病毒、噬菌体 和质粒等小分 子量复制子都 可以作为基因 导入的载体。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记 实验或用来进行DNA的连接 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸
从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸
从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
1972 - Paul Berg,
Produced first recombinant DNA using
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术
5.1 重组DNA技术回顾
三大成就 ：
1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体 是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
• 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。
第五章目的基因的获取
第五章目的基因的获取第五章目的基因的获取1976年H.G. Khorana 提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science 上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA 基因的论文。
第一节化学合成目的基因目前常用的方法一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法。
①保护dNTP 的5’端P 或3’端-OH （1）原理1. 磷酸二酯法保证合成反应的定向进行。
然后再用酸②带保护的单核苷酸连接或碱脱去保护基团带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。
然后去掉一个保护，使其循环往复连接。
（2）合成过程5’端保护的单核苷酸可以同3’端保护的二核苷酸聚合。
保护连接去保护连接原理与磷酸二酯法一样。
只是参加反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH 上都先连接了一个保护基团。
2. 磷酸三酯法固相磷酸三酯合成法将第一个核苷酸的3’-OH 端固定在固相支持物上。
（第一个核苷酸不需要保护）固相磷酸酯合成法是目前通用的合成方法。
化学合成的DNA 片断一般在200bp 以内。
需要把几个正确片段连接起来二、化学合成DNA 片断的组装1. 互补连接法（1）互补配对用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。
预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域形成有断点的完整双链。
（2）5’端磷酸化T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化（3）连接酶连成完整双链T4 DNA连接酶完整的DNA双链2. 互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。
3’5’5’3’5’3’T4DNA连接酶Klenow片段引物1. 直接合成基因三、寡聚核苷酸化学合成的优点（1）有些组织特异性mRNA的含量很低，很难用cDNA方法克隆）有些基因比较短化学合成费用较低2. 合成测序或PCR用的引物（20bp左右）（2）有些基因比较短，化学合成费用较低3. 合成探针序列以筛选特定的基因4. 定点突变合成合成带有定点突变的基因片段。
《目的基因的获得》课件
面对全球共同面临的生物技术挑战，国际 间的合作与交流将更加紧密，共同推动目 的基因技术的进步与应用。
THANKS.
《目的基因的获得》 ppt课件
contents
目录
• 目的基因的概述 • 目的基因的分离与纯化 • 目的基因克隆的方法 • 目的基因的应用与展望
目的基因的概述
01
目的基因的定义
目的基因
是指通过基因工程技术，人为设计和改造的特定基因，用于表达特定的蛋白质 或RNA分子。
目的基因的获取
是指通过各种方法，从生物体的基因组中分离出所需的目的基因的过程。
化学合成法在基因合成、基因治疗等 领域有广泛应用。
化学合成法的优点是速度快、效率高 ，适用于短片段基因的合成。但该方 法成本较高，对于长片段基因的合成 存在难度。
PCR技术
PCR技术是一种通过体外扩增特定DNA片段的技术，也称为聚合酶链式 反应。该技术可以在短时间内大量扩增目的基因，提高检测的灵敏度和 特异性。
目的基因的重要性
01
02
03
基础研究
目的基因可用于研究生物 体的生物学特性和分子机 制，有助于深入了解生命 本质。
生物技术
目的基因可用于构建基因 工程菌、细胞、植物和动 物模型，为生物技术的开 发和应用提供基础。
医学应用
目的基因可用于基因治疗 、药物研发和疾病诊断等 医学领域，有助于提高疾 病治疗效果和预防水平。
通过筛选和况，是一种有效的目的基因分离方法 。
化学合成法
化学合成法是一种通过化学手段合成 目的基因的方法。根据已知的基因序 列，利用化学合成技术合成目的基因 的全部或部分片段。
PCR技术的基本原理是利用一对引物，在DNA聚合酶的作用下，对目的 基因进行选择性扩增。PCR技术具有操作简便、特异性强、灵敏度高、
《生物技术概论》课程总复习
酶的纯化与精制
固定化酶 (细胞)的优点、固定化方法
酶分子的改造技术
酶反应器基本类型、生物传感器
酶工程的概念和基本过程（酶的分类）
*
第一节 酶的发酵生产
1
提高酶产量的措施 诱导物 阻遏物 表面活性剂 产酶促进剂
2
第三节 酶分子的改造
4
酶分子的修饰方法
5
第二节 酶的分离纯化
1
酶的制备技术(破碎细胞、溶剂抽提、离心分离、过滤 、浓缩、干燥);
杂合体的鉴别与ห้องสมุดไป่ตู้选
完全杂合、核质异源 酶解（纤维素酶）、分离、洗涤、鉴定
*
2.3 人工种子 用人工种皮包被植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其他成分的人工胶囊。
人工种子
解决有些植物结子困难、发芽率低、繁殖困难等问题
*
制作过程
胚乳与褐藻酸钠混合后，加入胚状体，滴入到硝酸钙或CaCl2中， 2０分钟后，表面聚合，形成人工种子
03
*
重组子的筛选
筛选方法： 根据载体选择标记基因筛选
抗性筛选、蓝白斑筛选 gus 基因、荧光素酶基因luc、绿色荧光蛋白基因gfp， 根据报告基因筛选转化子 根据形成噬菌斑筛选转化子
*
重组子的鉴定
根据重组DNA分子特征鉴定重组子 根据重组DNA分子大小鉴定重组子、根据重组DNA分子酶切图谱鉴定、PCR法、DNA杂交、应用DNA芯片鉴定重组子、根据DNA核苷酸序列鉴定重组子
基因进行定点诱变并分离其突变体，引入表达载体生产并纯化大量突变性蛋白质，分析其性质指导进一步分子设计，以最终获得所预期性质的分子
1
2
蛋白质组学（Proteomics）
“Proteome”最终概念是指：一个基因组，一种生物或一种细胞或组织所表达的全套蛋白质。
固定化酶 (细胞)的优点、固定化方法
酶分子的改造技术
酶反应器基本类型、生物传感器
酶工程的概念和基本过程（酶的分类）
*
第一节 酶的发酵生产
1
提高酶产量的措施 诱导物 阻遏物 表面活性剂 产酶促进剂
2
第三节 酶分子的改造
4
酶分子的修饰方法
5
第二节 酶的分离纯化
1
酶的制备技术(破碎细胞、溶剂抽提、离心分离、过滤 、浓缩、干燥);
杂合体的鉴别与ห้องสมุดไป่ตู้选
完全杂合、核质异源 酶解（纤维素酶）、分离、洗涤、鉴定
*
2.3 人工种子 用人工种皮包被植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其他成分的人工胶囊。
人工种子
解决有些植物结子困难、发芽率低、繁殖困难等问题
*
制作过程
胚乳与褐藻酸钠混合后，加入胚状体，滴入到硝酸钙或CaCl2中， 2０分钟后，表面聚合，形成人工种子
03
*
重组子的筛选
筛选方法： 根据载体选择标记基因筛选
抗性筛选、蓝白斑筛选 gus 基因、荧光素酶基因luc、绿色荧光蛋白基因gfp， 根据报告基因筛选转化子 根据形成噬菌斑筛选转化子
*
重组子的鉴定
根据重组DNA分子特征鉴定重组子 根据重组DNA分子大小鉴定重组子、根据重组DNA分子酶切图谱鉴定、PCR法、DNA杂交、应用DNA芯片鉴定重组子、根据DNA核苷酸序列鉴定重组子
基因进行定点诱变并分离其突变体，引入表达载体生产并纯化大量突变性蛋白质，分析其性质指导进一步分子设计，以最终获得所预期性质的分子
1
2
蛋白质组学（Proteomics）
“Proteome”最终概念是指：一个基因组，一种生物或一种细胞或组织所表达的全套蛋白质。
chap05 基因的克隆和分离
复杂、量大
多
5.3 目的基因的分离
5.3.1 功能克隆法
生化特征→功能蛋白
纯化→AA序列→cDNA
混合探针杂交
Designing oligonucleotide probes based on protein sequence
An isolated protein is digested with a protease, trypsin, which specifically cleaves peptide bonds on the C-terminus of Lys and Arg. The resulting peptides are separated, and several are partially sequenced from their N-terminus by Edman degradation. The determined sequences then are analyzed to identify the 6- or 7-aa region that can be encoded by the smallest number of possible DNA sequences. Because of the degeneracy of the codon, the 12-aa sequence (light green) shown here theoretically could be encoded by any of the DNA triplets below it, with the possible alternative bases at the same position indicated. The region with the least degeneracy for a sequence of 20-mer is indicated by the red bracket. There are 48 possible DNA sequences in this 20-base region that could encode the peptide sequence 39. Since the actual sequence of the gene is unknown, a degenerate 20-mer probe consisting of a mixture of all the possible 20-base oligonucleotides is prepared. If a cDNA is screened with this degenerate probe, the one oligonucleotide that is perfectly complementary to the actual coding sequence (blue) will hybridize to it.
目的基因的获取
需要克隆的DNA片段
编码某种蛋白质
研究某基因与 疾病的关系
研究某基因结构 和功能的关系
二、目的基因的获取
化学合成法
直接从染色体DNA中分离
聚合酶链式反应基因组DNA;cDNA三、PCR扩增获得目的基因
1、PCR的含义
聚合酶链式反应 Polymease Chain Reaction(PCR) 是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法, 由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反 应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅 速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、 省时等特点。
（6）引物 3’端的碱基要求严格配对（不能做任 何修饰）， 5’端无严格限制。 （7）引物5′端可修饰 引物5′端限定着PCR产物的长度，但对扩增特异 性影响不大；引物5′端碱基可不与模板DNA互补 而呈游离状态；引物5′端最多可加10个碱基而对 PCR反应无影响。
3’
5’ 3’
限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变
若低于94℃则需延长时间
但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有 影响。
3)、退火(复性)：使引物结合在模板上。退火温 度是影响PCR特异性的重要因素。 退火温度，取决于引物的长度、碱基组成及其浓 度，还有靶基因序列的长度，一般在40-65 ℃之 间。
对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作 为选择最适退火温度的起点较为理想。
结果）
•
引物的复性温度的计算公式
Tm（解链温度）＝4(G+C)+2(A+T)
复性温度=Tm值－（5～10℃）； 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可 大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高 PCR反应的特异性；
《基因工程B》复习提纲2020(1)
第一章基因工程概述一、名词解释基因：编码产生蛋白质或RNA等具有特定功能产物的一段具有遗传效应的DNA片段，是控制生物性状的基本遗传单位。
基因操作：基因操作是指对基因进行分离、分析、改造、重组、转移、检测和表达等操作的总称。
基因工程：专指为实践应用而进行的基因重组事件，具体指通过基因操作来定向改变或修饰生物体，并具有明确目的的活动。
重组DNA技术：基因重组是指将一种生物（供体）的基因（DNA片段）与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。
二、思考题1、简述基因工程操作的基本步骤。
2、简述基因工程操作的理论依据。
（1）基因具有相同的物质基础（2）基因是可切割和粘合的（3）基因是可转移的（4）多肽与基因之间有对应关系（5）遗传密码通用（6）基因可以复制遗传3、简述基因工程诞生理论上的三大发现和技术上的三大发明。
理论上的三大发现: 遗传物质是DNA（基因） DNA的双螺旋结构和半保留复制中心法则和氨基酸密码子技术上的三大发明：限制性核酸内切酶 DNA连接酶质粒和病毒第二章基因工程的工具酶一、名词解释限制性内切酶：是一类能识别双链DNA分子内部某种特殊的核苷酸序列，并使每个核酸链上特定部位相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开的一类核酸内切酶。
同裂酶：指来源不同，但识别相同靶序列，切割产生不同或相同末端的限制性内切酶。
即不同来源的限制性内切酶可切割相同的序列。
同尾酶：指来源各异，识别靶序列各不相同，但切割产生相同末端的限制性内切酶。
同尾酶切割DNA得到的产物可进行互补连接。
DNA连接酶：催化DNA片段两侧（相邻）核苷酸的3'羟基（-OH）和5'磷酸基（-P）之间形成磷酸二酯键，使断开的DNA连接起来的酶。
DNA聚合酶：催化DNA合成的酶逆转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶二、思考题1、简述限制性内切酶命名的基本原则。
属名+种名+株号+序号第一个字母：取宿主属名首字母，大写斜体。
第五章 转基因技术对食品安全的影响
化细胞、组织时，需要一些起帮助作用的基因，这类
外源基因叫标记基因。
有时标记基因本身也就是目的基因，如除草剂抗
性基因。
选择标记基因：如抗生素抗性基因，除草剂抗性 基因等。 报告基因：如黄类素酶、氯霉素乙酰转移酶，绿 色荧光蛋白酶等。 转基因食品外源基因食用安全性： ①有无直接毒性； ②是否会水平转移。 （1）有无直接毒性 ①目前转基因食品所用外源基其组成与普通DNA 并无差异； ②转基因食品中外源基因的含量很少。 目前未发现外源基因的食用有直接毒性。
（3）外源基因编码蛋白有无抗药性。
目前转基因植物食品中常用的标记基因是抗生素
抗性基因，因此食用这些含抗生素抗性基因的转基因
食品是否会产生抗药性是转基因食品安全性评价的又
一方面。
第三节
转基因食品的安全性评价和法规管理
一、转基因食品的安全性评价
安全性评价
③电激法（electroporation）。 ④脂质体介导法（lipidosome mediate） ⑤激光导入法（laser micropuncture）等。
基因枪（微弹技术）
（4）转化了重组DNA的受体细胞的筛选和鉴定。
①噬菌斑（negative colony）筛选法：适于
病毒或噬菌体作载体形成的重组子筛选。
（2）生产酶制剂。如凝乳酶的生产，把小牛胃的
凝乳酶基因转移到细菌或真核生物中，再培养生产出 凝乳酶。1990年美国FDA已批准在干酪生产中使用这 种凝乳酶。
3、改善食品原料的品质
改良动物、植物食品原料品质，改善园艺产品采
后品质。
4、改进食品生产工艺
5、生产食品添加剂（如氨基酸）和功能性食品
第二节
①生物学特性比较：比较形态、生长、产量、抗 病性、繁殖性、生理特性等。 ②主要营养成分比较：比较蛋白质、脂肪、碳水 化合物、矿物质、维生素等。 ③天然有毒物质比较：如番茄中的α-番茄素，马 铃薯中茄碱，葫芦科作物的葫芦素等。 ④抗营养因子比较：抗营养因子是指能够影响人 对食品中营养物质的吸收和对食物消化的物质，如豆 科作物的蛋白酶抑制剂、脂肪氧化酶及植酸等。 ⑤过敏原比较：过敏原（allergen）是指能够造 成某些人群食用后产生过敏反应的物质。过敏蛋白质 在加工过程及消化过程中不易被降解，不易被糖基化
基因工程 第五章目的基因的获取
oligo(dT)引导的DNA合成法：
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入1220个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶 合成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA mRNA 5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶 Oligo dT引物
5’
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ：
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。
随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法 （1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I
BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。 （1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入1220个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶 合成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA mRNA 5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶 Oligo dT引物
5’
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ：
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。
随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法 （1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I
BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。 （1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。
第五章目的基因的获取
的基因流程
目的标签法、非目的标签法
五、图位克隆（mapbased cloning）获 得目的基因
图位克隆：又叫定位克隆，1986年首先由剑
桥大学的Alancoulson提出。
根据目的基因在染色体上的位置进行分离基因，
无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先
六、mRNA差别显示技术（mRNA differential display）获得差异表达的基因
mRNA差别显示技术：对组织特异性 或诱导专一性表达基因进行分离的有效方 法之一。将mRNA逆转录和PCR技术相 互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技 术，也称为DDRT-PCR，
DDRT-PCR理论基础
3’ 5’
template templat因库（gene pool）：特定生物体全基因组的
集合（天然存在）e bank） 通过克隆的方法将某一基因组DNA或mRNA 保存于适当宿主菌中形成的转化子群。所有重 组DNA组合代表该基因组的全序列。
探针：目的基因局部片段、由氨基酸序列
获得的简并序列、近缘物种的同源序列
四、转座子标签法获得目的基因
（一）转座子的相关知识
转座子（transposon,Tn）:指位于染色体上
可以从基因组的一个位置转移到另一个位置的 DNA片段或基因。（jumping gene）
简单转座子：除转座所需基因外不携带任何
实验结果： 240组在能分出20000多条带！ 如果每条带相当于一种特定mRNA， 20000 mRNA基本上反映了一种特定细 胞中全部的mRNA。
DDRT-PCR操作步骤
*差异分离目的基因程序
利用两组细胞mRNA经过DDRT-PCR
后，分析比较cDNA种类的差异，分别回收 cDNA测序隆新基因。
目的标签法、非目的标签法
五、图位克隆（mapbased cloning）获 得目的基因
图位克隆：又叫定位克隆，1986年首先由剑
桥大学的Alancoulson提出。
根据目的基因在染色体上的位置进行分离基因，
无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先
六、mRNA差别显示技术（mRNA differential display）获得差异表达的基因
mRNA差别显示技术：对组织特异性 或诱导专一性表达基因进行分离的有效方 法之一。将mRNA逆转录和PCR技术相 互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技 术，也称为DDRT-PCR，
DDRT-PCR理论基础
3’ 5’
template templat因库（gene pool）：特定生物体全基因组的
集合（天然存在）e bank） 通过克隆的方法将某一基因组DNA或mRNA 保存于适当宿主菌中形成的转化子群。所有重 组DNA组合代表该基因组的全序列。
探针：目的基因局部片段、由氨基酸序列
获得的简并序列、近缘物种的同源序列
四、转座子标签法获得目的基因
（一）转座子的相关知识
转座子（transposon,Tn）:指位于染色体上
可以从基因组的一个位置转移到另一个位置的 DNA片段或基因。（jumping gene）
简单转座子：除转座所需基因外不携带任何
实验结果： 240组在能分出20000多条带！ 如果每条带相当于一种特定mRNA， 20000 mRNA基本上反映了一种特定细 胞中全部的mRNA。
DDRT-PCR操作步骤
*差异分离目的基因程序
利用两组细胞mRNA经过DDRT-PCR
后，分析比较cDNA种类的差异，分别回收 cDNA测序隆新基因。
5-目的基因的重组导入
转化 加入 1mLSOC 培养液
10-100L转化液涂 含抗菌素的平板
（3） 平板 培养细菌
10-100L转 化液
涂于含抗 菌素的平 板
37℃过夜
4.转化率和影响转化率的因素
每gDNA转化成功的细菌克隆数 总受体细胞所获的转化成功的细菌数
（1）重组质粒
①环形质粒数 环形重组质粒 质粒自我连接 线性载体或DNA片段进入细菌会被降解。
收DNA复合物，球状细胞复原并分裂增殖。在选择性培 养基平板上可挑选所需的转化子。简单，但转化效率不
高（106-108/gDNA）。
10ng载 体DNA 100L感 受态菌 10-100L转化 液涂含抗菌素 的平板
吸附DNA On ice混 合，静置 10分钟
摄入DNA 42º C 1.5分钟
二乙氨乙基葡聚糖能促进哺乳动物细胞摄入外 源DNA。
1
葡聚糖 DEAE
预处理
细胞
摄入
外源DNA
2
外源DNA
混合
细胞
吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可 以进入到细胞核里。 DEAE对细胞有毒!
本章思考题（3）
1、重组DNA分子在导入受体前如何保证插入的正确？ 2、受体的选择有什么要求？ 3、导入大肠杆菌受体的方法有哪些？ 4、导入植物细胞的方法有哪些？ 5、导入动物细胞的方法有哪些？ 6、简述各种重组DNA导入法的优缺点。
但移码突变！
4. 防止载体自身环化连接 （1）提高插入片段的用量
（2）用碱性磷酸酶处理载体
5’
3’ 插入片段
载体
载体和外源DNA插入片段的连接结果
受体细胞：
原核生物细胞
真核生物细胞 酵母菌细胞
第五章 目的基因与载体连接 2
第五章目的基因与载体的连接内容提要•基因重组克隆与亚克隆•基因重组对载体的要求与载体类型•连接前的处理•黏性末端连接•平端连接•人工接头连接•同聚寡核苷酸末端连接第一节基因重组克隆与亚克隆外源基因的获取载体的选择与构建外源基因与载体的切割与修饰外源基因与载体的连接（DNA体外重组）目的基因的表达重组DNA导入受体细胞重组体的筛选体外重组就是指目的基因与载体DNA的连接。
基因重组是靠DNA连接酶将适当切割的DNA即目的基因与载体共价连接。
DNA连接酶能催化相邻或两侧的DNA上裂口核苷酸裸露的3’-羟基和5’-磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA裂口连接起来。
在分子克隆中中，最有用的连接酶是来自于T4噬菌体的DNA连接酶——T4连接酶，该酶需要ATP作为辅助因子。
注意：在连接之前，应结合研究目的基因的特性，来设计最终构建的重组体分子。
一、体外连接重组DNA的特点1、DNA体外连接减少了DNA分子进入宿主细胞后遭受降解的危险，增加了转化效率；2、由于限制性内切酶产生的黏端在体外连接，使原来酶的识别序列在整个DNA维持完整性，有利于在重组子转化扩增以后再对外源基因的分离；3、连接时可以控制连接反应条件，有利于形成环状分子或者几个DNA片段头尾相连接的直线多联体。
基因重组克隆实质上就是DNA体外重组以及后续的转化过程。
亚克隆是指把DNA片段从某一类型载体无性繁殖到另一类型载体的过程。
例如：重组λ-噬菌体质粒亚克隆通常是将较大的克隆片段经酶切后，再将所有的小DNA片段与另一个载体连接转化的程序。
注意：进行连接反应时，要考虑载体DNA与DNA片段的比率。
例如：以自质粒载体形成环状分子，1：1。
以λ噬菌体或cos质粒为载体，形成多联体分子，二者的比例相应的就高些。
第二节基因重组对载体的要求与载体类型根据重组连接的目的，可将载体分为克隆载体和表达载体。
一、克隆载体如果所进行的重组连接暂时不考虑表达量的问题，只是为目的基因的获得或使该基因克隆、亚克隆或扩增、构建DNA文库，可以选择一般的克隆型载体。
高中生物基因工程的基本操作程序课件新人教版选修
生物固氮：通过基因工程将固氮微生物的固氮基因导入植物体内，提高植物的固氮能力， 从而增加土壤肥力，提高农作物的产量和品质。
在工业领域的应用
生物制药：基因工程药物的生产，如胰岛素、生长激素等 生物农药：利用基因工程生产高效、低毒的生物农药，如Bt杀虫剂 生物材料：利用基因工程生产生物可降解材料，如聚乳酸（PLA） 生物能源：利用基因工程生产生物燃料，如酒精、生物沼气等
在环境保护领域的应用
检测和鉴定环境污染的程度 治理污染的生物 生物降解 基因工程生产具有降解作用的微生物
基因工程的安全性问题
基因污染：基因工程可能会导致基 因污染，即插入的外源基因在环境 中扩散。
潜在风险：基因工程可能带来潜在 风险，如产生新的疾病或使某些生 物变得更具侵略性。
添加标题
体重组后转入细胞内进行扩增，并表达产生所需蛋白质的技术 • 基因工程的基本原理：基因重组、基因克隆等 • 基因工程的应用：医药、工业、农业等领域 • 基因工程的发展前景：随着技术的不断进步，基因工程将在未来发挥更加重要的作用
限制性核酸内切酶
作用：切割DNA分子，暴露 出黏性末端或平末端
分类：限制性内切酶和非限 制性内切酶
疫苗研发：利用基因工程技术生产 疫苗，如乙肝疫苗等。
在农业领域的应用
抗虫、抗病：通过基因工程培育出具有抗虫、抗病能力的农作物，提高农作物的抗病、抗 虫能力，减少农药使用量，降低环境污染。
抗逆性：通过基因工程培育出能够适应恶劣环境的农作物，提高农作物的抗逆性，从而增 加农作物的产量和品质。
转基因技术：将外源基因导入植物体内，产生具有特定性状的转基因植物，提高农作物的 产量和品质。
定义：能够识别DNA分子内 部的特异序列并准确切割的 酶
应用：在基因工程中用于切 割目的基因和控制其表达的
在工业领域的应用
生物制药：基因工程药物的生产，如胰岛素、生长激素等 生物农药：利用基因工程生产高效、低毒的生物农药，如Bt杀虫剂 生物材料：利用基因工程生产生物可降解材料，如聚乳酸（PLA） 生物能源：利用基因工程生产生物燃料，如酒精、生物沼气等
在环境保护领域的应用
检测和鉴定环境污染的程度 治理污染的生物 生物降解 基因工程生产具有降解作用的微生物
基因工程的安全性问题
基因污染：基因工程可能会导致基 因污染，即插入的外源基因在环境 中扩散。
潜在风险：基因工程可能带来潜在 风险，如产生新的疾病或使某些生 物变得更具侵略性。
添加标题
体重组后转入细胞内进行扩增，并表达产生所需蛋白质的技术 • 基因工程的基本原理：基因重组、基因克隆等 • 基因工程的应用：医药、工业、农业等领域 • 基因工程的发展前景：随着技术的不断进步，基因工程将在未来发挥更加重要的作用
限制性核酸内切酶
作用：切割DNA分子，暴露 出黏性末端或平末端
分类：限制性内切酶和非限 制性内切酶
疫苗研发：利用基因工程技术生产 疫苗，如乙肝疫苗等。
在农业领域的应用
抗虫、抗病：通过基因工程培育出具有抗虫、抗病能力的农作物，提高农作物的抗病、抗 虫能力，减少农药使用量，降低环境污染。
抗逆性：通过基因工程培育出能够适应恶劣环境的农作物，提高农作物的抗逆性，从而增 加农作物的产量和品质。
转基因技术：将外源基因导入植物体内，产生具有特定性状的转基因植物，提高农作物的 产量和品质。
定义：能够识别DNA分子内 部的特异序列并准确切割的 酶
应用：在基因工程中用于切 割目的基因和控制其表达的
演示文稿第五章目的基因的获取
%的mRNA时所 需要的克隆数目。
伸成完整的双链。
5’
3’
引物
Klenow片段
5’
3’
T4DNA连接酶
5’
3’
第二十四页，共103页。
三、 寡聚核苷酸化学合成的优点 1. 直接合成基因 （1）mRNA的含量很低，很难作cDNA （2）有些基因比较短，化学合成费用较低 2. 合成引物（20mer左右） 3. 合成探针序列 4. 定点突变合成 合成带有定点突变的基因片段。
率高和副反应极少等优点，已经在自动合成 仪被广泛采用。
第十七页，共103页。
3、亚磷酸三酯法
(1)脱二苯甲基保护基 加入ZnBr2或二氯乙酸，脱去4，4—二 对甲氧基三苯甲基，释放出与载体相连的寡聚核苷酸单体1上的 5’—OH。
(2)活化新的碱基 核苷酸单体2 的3’端的二异丙基亚磷酸酰上的磷酸 的OH用β-氰乙基或甲基保护，准备和前一个碱基进行反应。
G f
N=
4.61×
G f
G：Genome大小；f：fragment大小
例如：人的基因组是 3×109 bp，插入DNA片 段的平均长度如果是1.7×104 bp
N= 4.61×
G f
=
4.61×
3×109
1.7×104
= 8.1×105
第三十RNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。
3’
mRNA
5’
5’ 引物 cDNA 反转录酶
3’
2. cDNA library
利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这 些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保 存和扩增，称cDNA。第三十五页，共103页。
3. cDNA的特点 （1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含性内切酶粘性末端片段。
伸成完整的双链。
5’
3’
引物
Klenow片段
5’
3’
T4DNA连接酶
5’
3’
第二十四页，共103页。
三、 寡聚核苷酸化学合成的优点 1. 直接合成基因 （1）mRNA的含量很低，很难作cDNA （2）有些基因比较短，化学合成费用较低 2. 合成引物（20mer左右） 3. 合成探针序列 4. 定点突变合成 合成带有定点突变的基因片段。
率高和副反应极少等优点，已经在自动合成 仪被广泛采用。
第十七页，共103页。
3、亚磷酸三酯法
(1)脱二苯甲基保护基 加入ZnBr2或二氯乙酸，脱去4，4—二 对甲氧基三苯甲基，释放出与载体相连的寡聚核苷酸单体1上的 5’—OH。
(2)活化新的碱基 核苷酸单体2 的3’端的二异丙基亚磷酸酰上的磷酸 的OH用β-氰乙基或甲基保护，准备和前一个碱基进行反应。
G f
N=
4.61×
G f
G：Genome大小；f：fragment大小
例如：人的基因组是 3×109 bp，插入DNA片 段的平均长度如果是1.7×104 bp
N= 4.61×
G f
=
4.61×
3×109
1.7×104
= 8.1×105
第三十RNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。
3’
mRNA
5’
5’ 引物 cDNA 反转录酶
3’
2. cDNA library
利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这 些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保 存和扩增，称cDNA。第三十五页，共103页。
3. cDNA的特点 （1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含性内切酶粘性末端片段。
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a.载体的或考斯质粒；对于大型基 因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体 上述几种载体的最大装载量如下： 质粒 15 kb λ-DNA 25 kb 考斯质粒 45 kb BAC 300 kb YAC 400 kb b.受体的选择： 根据载体的不同使用大肠杆菌或酵母菌
不同生物不同发育阶段，目的基因的转录水平 不同，因而在提取mRNA时，应选择特定发育阶段 的特定组织作为提取材料。 根据mRNA3‘端具有ploy(A)结构的特性，利用 结合了ploy(T)的纤维素柱层析法和磁珠分离法提取 mRNA，最后还可以利用琼脂糖凝胶电泳、密度梯 度离心等方法对进行富集。另外，有时还要大肠杆菌或其他受体混 合，使其转化进受体细胞内
cDNA 文 库 提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部 克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重 组子 筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落 原位杂交法筛选；若使用的是表达型载体，则 采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于mRNA丰度低（<0.5%） 的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素 基因DNA，用物理方法或酶法，将DNA降解成预期大小的 片段，然后将这些片段与适当的载体连接，并转入受体 细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组 DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖 扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNNA序列。从基因组含 有生物生存、活动olyA结构 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短 mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏 感，分离纯化困难 仅限于克隆蛋白质编码基因
三、目的基因的获得
（一）对已知序列基因的分离
1.核酸杂交法－菌落 和空斑的原位杂交 （P108、150）
2）特异分离程序 提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收 目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆 特异分离程序较适用于mRNA丰度高(50～90%)的 目的基因克隆，如血红蛋白基因等
3）差异分离程序 利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异 mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分 离克隆新基因 例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新 基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之 后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因， 进而研究其生物学功能
目的基因获得的主要方法基因法 鸟枪法 cDNA法 化学合成法e bank）： 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以 克隆的形式存在DNA（含有全部蛋白质编码的结构基 因）
（3）基因组DNA与载体的连接 将基因组DNA片段与载体DNA片段用T4DNA 连接酶连接，然后重组体DNA与λ噬菌体外壳蛋白 在体外包装 （4）转化受体细胞 重组噬菌体感染细胞将重组DNA导入，重组 DNA在细胞内增殖并裂解宿主细胞，产生菌落原位杂交法、基因产物功能检测法
3） cDNA双链末端的处理
用上述方法合成的双链往往为平头末端， 要与载体分子连接，需进行一定的处理， 即使其变为粘性末端，一般多采用同聚物 加尾法和接头法等。
（4） cDNA与载体的连接
双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入 载体中： 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是GC同聚物尾，这 样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插 入片段 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收
基 因 组 文 库建过程中，最应引起重视 的问题是：严禁外源DNA片段之间的连接！！！ 为了避免上述情况的发生，可采取下列措施 的组合： 将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）在DNA片段的 末端上增补同聚尾末端
（3） cDNA克隆片段的获得
1） cDNA第一链的合成 2） cDNA第二条链的合成 自身引导合成法 置换合成法 PCR合成法 3） cDNA双链末端的处理
1） cDNA第一链的合成
2）cDNA第二条链的合成
a
2） cDNA第二条链的合成
b
2） cDNA第二条链的合成
c. PCR合成法（引物合成法）：不会丢失末的构建与目的基因的克隆
基因工程或DNA重组技术操作的前提条件是从生物 体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或 确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系 统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目 的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞 内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。 一般来说，目的基因的克隆战略分为两用 PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因， 然后将之的方法，称为鸟枪法或散弹射击法，意味着从 含有众多的基因序列克隆群中去获取目的基因或序列。 当生物基因组比较小时，此法较易成功；工程量也很大。2. 基因组的构建程序 （1）载体和受体的选择
b.基因组DNA的切割 用于基因组构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制 性内切酶酶切两种方法，其目的是： 第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区 第二，保证DNA片段大小均一 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基 因断开， 大小不可控 部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如： Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分 离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！
2.，分别从各孔中吸取少 量培养物，并将同一行和列孔中的培养物混合， 以此混合物为模板进行PCR扩增，最后根据凝 胶电泳的结果判定相应行或列混合孔中是否含 有阳性克隆。对含有阳性克隆的行或列孔中的 培养物再次分装培养板，并经培养后进行第二 轮PCR，如此反复操作，直到获得阳性克隆或 将气范，不同组织和细胞在 不同时段的mRNA 种类不同（即基因的过程
（1） cDNA克隆载体的选择
由于绝大多数真核生物的m对载体进行去磷酸化处理，可 防止载体自身环化，并保证重组分子的形成
（2） mRNA的提取与富集
例如，已知某目的基因位于 1.8 kb的SalI片段中，将染色体 DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳 分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此凝 胶块中回收DNA片段，景知 识 不能获得的最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构（二）cDNA的构建 1. cDNA的定义：
以mRNA为模板，经反转录酶催化合成DNA，则此DNA序 列与mRNA互补，称为互补DNA或cDNA。提取出组织细胞的 全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体 或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并 能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的c有一部分表达，而 且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表特异表达的因组DNA文 库所含的是带有DNA。
（2）基因组DNA的制备与切割
a.基因组DNA的制备 为了最大限度地保证 度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中 含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备 性也就越高 用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100 kb左 右；如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有 SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb 大所含克隆数N之间的关 系可用下式表示： N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f ) 其中的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp，基因文 库中克隆片段的平均大小为15大以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度避免基因被分 隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域以 利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选
4. 鸟枪法操作的改进
A.使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 使用这一改进方法的前提条件是：目的基因 的酶切图谱已知。 如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶 处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保 证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重 组子的出现频率，
B.在连接前将DNA片段进行 分级分离
不同生物不同发育阶段，目的基因的转录水平 不同，因而在提取mRNA时，应选择特定发育阶段 的特定组织作为提取材料。 根据mRNA3‘端具有ploy(A)结构的特性，利用 结合了ploy(T)的纤维素柱层析法和磁珠分离法提取 mRNA，最后还可以利用琼脂糖凝胶电泳、密度梯 度离心等方法对进行富集。另外，有时还要大肠杆菌或其他受体混 合，使其转化进受体细胞内
cDNA 文 库 提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部 克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重 组子 筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落 原位杂交法筛选；若使用的是表达型载体，则 采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于mRNA丰度低（<0.5%） 的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素 基因DNA，用物理方法或酶法，将DNA降解成预期大小的 片段，然后将这些片段与适当的载体连接，并转入受体 细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组 DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖 扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNNA序列。从基因组含 有生物生存、活动olyA结构 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短 mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏 感，分离纯化困难 仅限于克隆蛋白质编码基因
三、目的基因的获得
（一）对已知序列基因的分离
1.核酸杂交法－菌落 和空斑的原位杂交 （P108、150）
2）特异分离程序 提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收 目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆 特异分离程序较适用于mRNA丰度高(50～90%)的 目的基因克隆，如血红蛋白基因等
3）差异分离程序 利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异 mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分 离克隆新基因 例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新 基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之 后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因， 进而研究其生物学功能
目的基因获得的主要方法基因法 鸟枪法 cDNA法 化学合成法e bank）： 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以 克隆的形式存在DNA（含有全部蛋白质编码的结构基 因）
（3）基因组DNA与载体的连接 将基因组DNA片段与载体DNA片段用T4DNA 连接酶连接，然后重组体DNA与λ噬菌体外壳蛋白 在体外包装 （4）转化受体细胞 重组噬菌体感染细胞将重组DNA导入，重组 DNA在细胞内增殖并裂解宿主细胞，产生菌落原位杂交法、基因产物功能检测法
3） cDNA双链末端的处理
用上述方法合成的双链往往为平头末端， 要与载体分子连接，需进行一定的处理， 即使其变为粘性末端，一般多采用同聚物 加尾法和接头法等。
（4） cDNA与载体的连接
双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入 载体中： 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是GC同聚物尾，这 样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插 入片段 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收
基 因 组 文 库建过程中，最应引起重视 的问题是：严禁外源DNA片段之间的连接！！！ 为了避免上述情况的发生，可采取下列措施 的组合： 将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）在DNA片段的 末端上增补同聚尾末端
（3） cDNA克隆片段的获得
1） cDNA第一链的合成 2） cDNA第二条链的合成 自身引导合成法 置换合成法 PCR合成法 3） cDNA双链末端的处理
1） cDNA第一链的合成
2）cDNA第二条链的合成
a
2） cDNA第二条链的合成
b
2） cDNA第二条链的合成
c. PCR合成法（引物合成法）：不会丢失末的构建与目的基因的克隆
基因工程或DNA重组技术操作的前提条件是从生物 体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或 确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系 统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目 的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞 内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。 一般来说，目的基因的克隆战略分为两用 PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因， 然后将之的方法，称为鸟枪法或散弹射击法，意味着从 含有众多的基因序列克隆群中去获取目的基因或序列。 当生物基因组比较小时，此法较易成功；工程量也很大。2. 基因组的构建程序 （1）载体和受体的选择
b.基因组DNA的切割 用于基因组构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制 性内切酶酶切两种方法，其目的是： 第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区 第二，保证DNA片段大小均一 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基 因断开， 大小不可控 部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如： Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分 离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！
2.，分别从各孔中吸取少 量培养物，并将同一行和列孔中的培养物混合， 以此混合物为模板进行PCR扩增，最后根据凝 胶电泳的结果判定相应行或列混合孔中是否含 有阳性克隆。对含有阳性克隆的行或列孔中的 培养物再次分装培养板，并经培养后进行第二 轮PCR，如此反复操作，直到获得阳性克隆或 将气范，不同组织和细胞在 不同时段的mRNA 种类不同（即基因的过程
（1） cDNA克隆载体的选择
由于绝大多数真核生物的m对载体进行去磷酸化处理，可 防止载体自身环化，并保证重组分子的形成
（2） mRNA的提取与富集
例如，已知某目的基因位于 1.8 kb的SalI片段中，将染色体 DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳 分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此凝 胶块中回收DNA片段，景知 识 不能获得的最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构（二）cDNA的构建 1. cDNA的定义：
以mRNA为模板，经反转录酶催化合成DNA，则此DNA序 列与mRNA互补，称为互补DNA或cDNA。提取出组织细胞的 全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体 或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并 能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的c有一部分表达，而 且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表特异表达的因组DNA文 库所含的是带有DNA。
（2）基因组DNA的制备与切割
a.基因组DNA的制备 为了最大限度地保证 度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中 含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备 性也就越高 用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100 kb左 右；如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有 SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb 大所含克隆数N之间的关 系可用下式表示： N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f ) 其中的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp，基因文 库中克隆片段的平均大小为15大以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度避免基因被分 隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域以 利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选
4. 鸟枪法操作的改进
A.使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 使用这一改进方法的前提条件是：目的基因 的酶切图谱已知。 如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶 处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保 证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重 组子的出现频率，
B.在连接前将DNA片段进行 分级分离