目的基因的获得及方法

负选择系统
Ø a 报告基因不转 录，细胞生长； Ø b 报告基因转 录，细胞不生长 或死亡（在含5­ 氟乳清酸的培养 基上，URA3基 因表达产物降解 5­氟乳清酸为有 毒物质）
反向双杂交系统应用
Ø可更有效地蛋白间作用的关键位点或起决 定作用的个别氨基酸， 进而分析蛋白结构 和功能的关系 Ø可筛选能阻止某些蛋白间相互作用的肽或 小分子物质用作临床治疗制剂 Ø研究相互作用的蛋白间的结构特征 Ø筛选蛋白突变体 Ø确定能够打破特异的蛋白相互作用的试剂
RNA介导的三杂交系统
Ø与AD融合的蛋白是具有RNA结合域的蛋白（如细菌MS2），能够与RNA AD RNA MS2 分子的臂­环结构结合；RNA除具有臂­环结构外，还有诱饵序列（test）。 ­ RNA ­ test 这样RNA分子与DB­蛋白复合物构成了双杂交系统中的诱饵，它结合于报 RNA DB ­ 告基因的上游；第3个分子是AD­蛋白，如果该蛋白识别诱饵序列test并结 3 AD ­ test 合，则报告基因转录。
目的基因的用途
Ø 研究该基因的全貌与内涵：结构、功能、 调控 Ø 寻找异常基因异常点，探索疾病的机理与 治疗 Ø 研究生物种系进化与相关同源性 Ø 基因工程重组表达 Ø 改造某些基因 Ø 基因治疗
原
理
Ø 原核目的基因获得：直接分离 Ø 真核目的基因获得： Ø ( 一 ) 载体 ：ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ主细胞内可独立复制的完整 DNA 分子 。
筛选目的基因
Ø 核酸杂交法：探针 Ø 免疫结合法：抗体 Ø 其他方法：双杂交；基因芯片
构建基因组文库筛选目的基因
Ø 要求：全 Ø 流程：组织细胞
↓温和破碎细胞 DNA片段与载体的连接包装 ↓限制性内切酶消化，噬菌体或粘粒 导入细胞 ↓核酸杂交 筛选目的基因
人工合成目的基因片段
Ø 原理：DNA是由3’，5’­磷酸二酯键连接 DNA 3 5 ­ ’ ’ Ø 技术：DNA自动合成仪 DNA Ø 方法
mRNA的分离 mRNA
­ ­ Ø 10 5 μg/细胞，80~85%为rRNA，15%小分 g/ 80~85% rRNA 15% 子量RNA（tRNA等）1­5%mRNA，28S： RNA tRNA 1 5%mRNA 28S ­ ： 18S=2：1 18S=2
Ø 提取总RNA ：常规方法；Trizon Ø 提取纯化mRNA：oligo­dT柱 mRNA oligo dT ­
Ø Ø Ø Ø Ø
质粒 ( plasmid ) 噬菌体 M13 噬菌体 逆转录病毒 DNA 昆虫病毒 DNA（插入动物细胞 ） 从cDNA 中分离 人工合成 反转录 基因文库 PCR 其他方法：差异显示，基因陷阱等
Ø ( 二 ) 目的基因的来源
Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø
构建cDNA文库筛选目的基因 cDNA
SOS恢复系统 SOS
泛素专一性蛋白酶系统
Ø 泛素与蛋白质形成的融合蛋白可以被泛素专一性 蛋白酶（UBPS）分解，并且需要泛素正确折叠 Ø 泛素的两个结构域分别表达时就能够正确折叠， 当N端发生错义突变时不能正确折叠 Ø 当两个蛋白（A、B）分别与泛素的N端、C端融 合，若A、B相互作用，则N端错义突变引起的不 正确折叠能够得到纠正，C端和N端能够正确折 叠，UBPS水解使得二氢叶酸还原酶释放 Ø 该系统可检测蛋白相互作用中的动力学性质
单杂交系统
Ø用于确定识别特异DNA结合蛋白的方法 Ø在系统中诱饵是报告基因一段特定的上游 序列 Ø将DNA复制起始序列ACS与报告基因LacZ 连接，用来筛选杂交表达文库（即与AD融 合的蛋白文库） Ø应用：发现并分离了酵母ORC6——DNA复 制复合物蛋白之一
SOS恢复系统
Ø 上述反应都是在核中进行的，对于研究膜蛋白， 分泌蛋白，膜受体及胞质蛋白有很大的局限性 Ø SOS恢复系统是针对于膜受体、细胞外分泌蛋白 的一种方法 Ø 原理：酵母温度敏感株是由于在ras信号途径中存 在突变体，不能将外来信号传递给膜上的RAS蛋 白，在36℃不能存活 Ø 将野生性SOS与X融合，豆蔻酰化信号与Y融合， 使Y定位于膜上。若X与Y结合，则SOS蛋白定位 于膜上，与RAS接近，激活ras途径，完成SOS过 程，36℃下生长
大规模双杂交筛选3
C 文库对文库的接合：即单倍体诱饵文库与 单倍体猎物文库接合，直接筛选二倍体
细菌双杂交系统 1
Ø 利用百日咳博代杆菌中cya基因编码的钙调蛋白(CaM)依 赖性腺苷酸环化酶，其激活区可以分成T18和T25两个相 对独立的功能片段 Ø 将这两种片段引入大肠杆菌DHP1(cya­)中独立表达，它们 不能彼此识别与作用，因此不能互补大肠杆菌DHP1的 cya­缺陷型性状，表现为β 半乳糖苷酶活性很低，生长在 MacConkey/麦芽糖平板上的菌落呈白色 Ø 若这两个功能区分别与一对可相互作用的蛋白质融合表 达，它们可形成有功能的腺苷酸环化酶，互补大肠杆菌 DHP1的cya­缺陷型，使菌株β 半乳糖苷酶活性上升，生 长在MacConkey/麦芽糖平板上菌落显红色 Ø 因此应用这个双杂交系统研究蛋白质间的相互作用即可根 据β 半乳糖苷酶和麦芽糖酶的活力来检测
Ø 猎物表达载体 ：三种
Ø VP16来自于单纯疱疹病毒，它的转录激活活性高于下 述两个 Ø 酵母Gal4的转录激活域 Ø B42来自E.coli，转录激活活性弱，可以缓和有毒性的 基因表达对细胞的影响，其后插入流感病毒HA抗原， 易于将蛋白分离纯化
基于双杂交原理的其他方法
Ø 三杂交系统：两个蛋白之间通过第三者发生相互作用，第 三物可以是蛋白质、小分子或RNA Ø 负选择系统：BD­X/AD­Y转录激活的报告基因在特定的条 件下有毒性。如表达URA3基因的酵母在缺乏5­氟乳清酸的 培养基上能够正常生长。在含5­氟乳清酸的培养基上该酶将 5­氟乳清酸转变成毒性复合物，使细胞停止生长或死亡 Ø 双诱饵系统：使用两种不同的诱饵激活选择性和负选择两 种报告基因的转录 Ø 哺乳动物的双杂交系统：高等生物中发现蛋白相互作用 Ø 单杂交系统：确定识别特异DNA结合蛋白的方法 Ø SOS恢复系统：研究膜受体、细胞外分泌蛋白等非核蛋白相 互作用 Ø 泛素专一性蛋白酶系统：检测蛋白相互作用中的动力学 Ø 大规模双杂交筛选：蛋白组学中的应用
Ø 选材：mRNA丰富，目的基因表达活跃 mRNA Ø 注意点：防止RNA酶污染 RNA
构建流程
组织细胞 ↓破碎细胞，除去DNA与蛋白质 提取总RNA ↓oligo（dT）纤维素亲合柱层析 合成cDNA第一链 ↓反转录 合成cDNA第二链 ↓插入载体 重组DNA ↓导入大肠杆菌扩增 构建cDNA文库
反转录合成cDNA
Ø 合成cDNA第一链：反转录酶 cDNA Ø 合成cDNA第二链： cDNA
Ø置换合成法：RNA酶H；DNA聚合酶Ⅰ； RNA H DNA T4 DNA连接酶 Ø外加引物合成法：全长双链 ØPCR PCR
构建cDNA文库 cDNA
Ø cDNA两端加接头或衔接头 cDNA Ø cDNA与载体相连 cDNA Ø 导入宿主细胞进行克隆
大规模双杂交筛选1
a 矩阵法：以横向方式 生长的是含有诱饵的单 倍体酵母，竖线方式生 长的是猎物库的单倍体 酵母 复印膜,单倍体接合 后，在交叉处的酵母则 融合成二倍体 将二倍体分别在含X­ Gal和Leu­培养基上进 行筛选
大规模双杂交筛选2
B 一一对应方法：诱 饵与猎物相对应， 接合于丰富培养基 上，拷贝膜在选择 培养基上进行筛选
蛋白质三杂交系统
a ：蛋白Z稳定了 蛋白A和B之间 的作用； B： 蛋白质A和B 通过蛋白Z相互 作用； C： 蛋白Z改变了 A的结构，使得 B能与之作用
通过小分子的三杂交系统
利用FK506与地塞 FK506 米松杂合分子，将 与LexA­BD融合 LexA BD ­ 的糖皮质激素受体 及杂合分子作为诱 饵，用于筛选与 饵，用于筛选与 AD融合的Jurkat AD cDNA文库，分离 cDNA 了与FK506结合的 FK506 蛋白FKBP12 FKBP12
双诱饵系统
Ø 使用两种不同的诱饵激活选择性和负选择两种报 告基因的转录 Ø 用于区分桥蛋白与识别蛋白 Ø 还可以区分野生型蛋白和病理条件下的蛋白变种
哺乳动物的双杂交系统
Ø 酵母毕竟是一种较低等的生物，蛋白的翻译后修 饰（糖基化、二硫键的形成等）程度很低 Ø 要进一步研究蛋白产物的生物学功能，还必须建 立高等生物体系的双杂交系统 Ø 系统采用单纯疱疹病毒VP16的AD区段 Ø 用氯霉素乙酰转移酶为报告基因，其活性可以在 细胞提取物中检测 Ø 采用磷酸钙共沉淀转化入Hela细胞培养 Ø 该方法主要用于检验已知蛋白的相互作用
mRNA差示显示法获得目的基因 mRNA
Ø 原理：一般15%基因表达，而且在不同状 15% 态表达的基因是不同的 Ø 方法：PCR扩增（标记）→测序电泳→筛 PCR 选差异 Ø 优点：简便；灵敏度高；重复性好；多能 性；快速
选择原则
Ø 根据获得目的基因的目的选择方法 Ø 根据目的基因本身特点选择方法 Ø 根据实验室条件选择方法
双杂交技术原理与应用
基本原理
Ø 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即 这些因子由两个或两个以上相互独立的结构域构 成, 其中有DNA结合结构域(DB)和转录激活结构 域(AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。 Ø 单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转 录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合 蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。 Ø 例子：酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一 个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然 可结合到Gal4结合位点并激活转录。
化学合成法：固相 Ø 酶促合成法：需模板 Ø PCR Ø PCR
Ø
其他方法
构建差示文库（扣除文库）筛选 特殊基因
Ø 差示文库：反映不同组织细胞或同一种细 胞在不同功能状态下，基因表达差异的 胞在不同功能状态下，基因表达差异的 cDNA文库。用于研究细胞的发育、分化、 cDNA 细胞的分裂周期、细胞对药物和生长因子 的诱导反应以及肿瘤等疾病的分子基础。 Ø 方法：构建两个cDNA文库→杂交→羟基磷 cDNA 灰石柱分离→构建cDNA文库
三杂交系统应用
Ø分析确定RNA­­蛋白作用的精确结构域，甚 至单个核苷酸或氨基酸残基 Ø鉴定和克隆识别结合有重要生理功能 RNA(如转录、定位、RNA病毒包装和感染 等)的蛋白质，可用于调控的机理研究、疾 病的防治以及抗病毒药物的研制开发 Ø通过构建杂交RNA库，可筛选与特定蛋白 结合的RNA Ø有可能在此基础上发展四杂交系统研究 RNA­RNA间的相互作用
基本技术
Ø诱饵融合表达质粒构建 Ø融合表达cDNA文库构建 Ø文库扩增，重组DNA收集 Ø共转染 Ø筛选 Ø假阳性剔除 Ø测序 Ø生物学功能验证
双杂交系统的发展
Ø 报告基因的多样化
Ø 多报告基因系统：LacZ，酵母营养缺陷型Leu2和His3
Ø 诱饵表达载体 ：两种
Ø Gal4和LexA，后者结合于E.coli的LexA操纵子且不具 有核定位序列
双杂交系统工作原理示意图
a 天然Gal4蛋白具有DNA结合域和转录激活域，诱导Gal1­LacZ转录； Gal4 DNA Gal1 LacZ ­ 转录； b 只有DNA结合域（上）或转录激活域（下）的杂合蛋白不能激活报告基因的转录； DNA 结合域（上）或转录激活域（下）的杂合蛋白不能激活报告基因的转录； c 蛋白X和Y之间的相互作用使Gal4的两个结构域接近导致报告基因的转录 X Y Gal4
法方及得获的因基的目 法方及得获的因基的目
Ø目的基因概念 Ø获得目的基因方法
Ø
构建cDNA文库 cDNA 构建基因组文库 人工合成目的基因 PCR合成 PCR 其他方法：差异显示，基因陷阱
Ø Ø Ø
Ø
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目的基因的概念
Ø 基因是DNA分子上含特定遗传信息的核酸 DNA 序列的总称，是遗传物质的最小功能单 位。 Ø 目的基因：对基因组中某个基因通过克隆 扩增，获得该基因进行研究或应用称这种 基因为目的基因。