目的基因的获得及方法
获取目的基因的方法
获取目的基因的方法目的基因的获取是分子生物学和遗传工程研究中的重要步骤，它对于揭示基因功能、研究疾病机制以及开发基因治疗等方面具有重要意义。
下面将介绍几种常用的获取目的基因的方法。
1. PCR扩增法。
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的目的基因获取方法。
通过PCR 技术，可以在体外迅速扩增目的基因，从而获得大量的目的基因。
PCR扩增法具有操作简便、快速、灵敏度高等优点，是获取目的基因的常用手段。
2. 限制性内切酶切割法。
限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并在其特定位置切割DNA的酶。
通过选择合适的限制性内切酶，可以将目的基因从DNA中切割出来。
这种方法具有选择性强、操作简便等优点，被广泛应用于目的基因的获取。
3. 基因克隆法。
基因克隆是一种常用的获取目的基因的方法。
通过基因克隆技术，可以将目的基因插入到载体DNA中，形成重组DNA。
然后，利用细菌或酵母等生物体的复制机制，可以获得大量含有目的基因的重组DNA。
基因克隆法具有获取大量目的基因、易于保存和传播等优点，是获取目的基因的重要手段之一。
4. 基因合成法。
随着合成生物学的发展，基因合成技术逐渐成熟。
基因合成法是一种通过化学合成的方式获取目的基因的方法。
通过合成DNA序列，可以获得具有特定功能的目的基因。
基因合成法具有获取特定序列的目的基因、避免限制性内切酶位点的限制等优点，被广泛应用于基因工程和合成生物学领域。
5. 基因组克隆法。
基因组克隆是一种获取目的基因的重要手段。
通过基因组克隆技术，可以直接从生物体的基因组中获取目的基因。
这种方法适用于大片段DNA的获取，对于研究复杂基因组的结构和功能具有重要意义。
综上所述，获取目的基因的方法多种多样，研究者可以根据具体的实验目的和条件选择合适的方法。
随着生物技术的不断发展，相信将会有更多更高效的方法出现，为基因研究和应用提供更多可能性。
高中生物1.2基因工程的基本操作程序课件选修3
一二
农杆菌转化法分析
知识精要 典题例解 迁移应用
一二
知识精要 典题例解 迁移应用
(1)完成基因表达载体的构建,需要限制性核酸内切酶和DNA连接 酶。 (2)基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌的常用方法是用Ca2+处理。 (3)目的基因能够在受体细胞内稳定维持和表达的关键是目的基因 插入受体细胞染色体DNA上。 (4)由受体细胞形成植株通常需要用到植物组织培养技术。
高中生物1.2基因工程的基本操作 程序课件选修3
目标导航 预习导引
1.简述基因工程原理及基本操作程序。 2.记住目的基因导入受体细胞的方法。 3.说出目的基因检测与鉴定的方法。
目标导航 预习导引 一 二 三 四
基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤:目的基因的获取、 基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检 测与鉴定。
目的基因表达
载体的提纯→ 取卵→显微注 射→受精卵发 育→获得具有 新性状的动物
Ca2+处理细胞→感 受态细胞→表达载 体与感受态细胞混
合→感受态细胞吸 收 DNA 分子
一二
知识精要 典题例解 迁移应用
2.目的基因的检测与鉴定的方法比较
类型 检测内容
方法
判断指标
第一 分步 子 第二 检步 测 第三
合成的对象 DNA 分子
DNA 片段
一二
知识精要 典题例解 迁移应用
联系
DNA 复制
PCR 技术
①模板:均需要脱氧核苷酸链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸 ③酶:均需要 DNA 聚合酶进行催化 ④引物:均需要引物,使 DNA 聚合酶从引物的 3'端
开始连接脱氧核苷酸
一二
知识精要 典题例解 迁移应用
目的基因的检测与鉴定的基本条件
目的基因的检测与鉴定是遗传学研究中的重要环节，其结果对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。
目的基因的检测与鉴定需要具备一定的基本条件，以下将从样本的获取、实验方法、数据分析等方面进行详细介绍。
一、样本的获取1. 标本的来源：目的基因检测与鉴定所需的样本可以来源于各种不同的组织或细胞，包括血液、唾液、组织活检等。
2. 样本的保存和处理：为了保证检测结果的准确性，样本的保存和处理至关重要。
必须采取适当的方法将样本保存在恒温条件下，避免样本受到损伤或者污染。
二、实验方法1. PCR扩增技术：PCR是目的基因检测的一种重要技术手段，通过PCR扩增可以获得目的基因的大量拷贝，为后续的检测和鉴定提供了充分的样本。
2. 测序技术：常用的测序技术包括Sanger测序和高通量测序技术，可以对PCR扩增得到的目的基因进行准确的测序分析。
3. 分子标记技术：分子标记技术如Southern blotting、Northern blotting等也是目的基因检测与鉴定中常用的手段。
三、数据分析1. 数据质控：对实验获得的数据进行质控，包括检查PCR产物的纯度和大小，测序结果的质量等，保证数据的准确性和可靠性。
2. 数据解读：对检测到的目的基因进行数据分析和解读，鉴定该基因的具体序列和功能，判断其与特定疾病的关联性。
四、设备和实验环境1. 实验设备：目的基因的检测与鉴定需要使用PCR仪、电泳仪、测序仪等一系列专业设备进行实验操作。
2. 实验室条件：实验室必须具备一定的洁净度和恒温条件，保证实验的稳定进行。
以上是目的基因检测与鉴定的基本条件，只有在具备了样本的获取、实验方法、数据分析和实验环境等方面的基本条件后，才能保证检测结果的准确性和可信度。
相信随着科学技术的不断进步和发展，目的基因检测与鉴定的方法会更加完善和高效，为疾病的诊断和治疗提供更为可靠的依据。
为了确保目的基因检测与鉴定的准确性和可靠性，除了基本条件外，还需要特别关注样本的质量控制、实验方法的优化和数据分析的精细化。
获取目的基因的四个途径
获取目的基因的四个途径获取目的基因的四个途径引言：目的基因是指在人类或动物体内具有特定功能或特征的基因。
获取目的基因的研究对于科学研究、医学治疗和农业改良有着重要的意义。
本文将介绍获取目的基因的四个途径，包括突变、基因转移、基因编辑和基因合成，以帮助读者更全面地了解这一领域的研究进展和应用前景。
一、突变突变是指基因组发生突变或突变体产生的过程。
通过突变，可以获得新的目的基因或改良现有基因的功能。
突变的方式包括自然发生的自发突变和人工诱导的突变。
自发突变通常是由于DNA复制过程中的错误或外界环境的影响，而人工诱导的突变则是通过化学物质或辐射来诱导基因的改变。
突变的技术有助于研究基因的功能和相互关系，以及生成新的基因型来满足特定需求。
二、基因转移基因转移是通过将目的基因从一个生物体转移到另一个生物体来实现的。
这可以通过不同的方法进行，包括基因工程技术、转座子和病毒介导的转移。
基因工程技术是一种将特定基因加入目标生物体的方法，通常通过DNA重组技术和酶切酶技术来实现。
转座子是一种能够自主移动到基因组中不同位置的DNA序列，通过转座子可以将目的基因插入到特定基因组位置，实现目的基因的转移。
病毒介导的基因转移则是通过利用病毒的感染机制将目的基因传递到宿主生物体中。
三、基因编辑基因编辑是一种修改特定基因的方法，通过这种方法可以实现指定基因的特定改变。
目前最常用的基因编辑技术是CRISPR-Cas9系统，它利用一种特定的酶可以精确剪切DNA，并对基因进行修改。
通过CRISPR-Cas9系统，可以实现基因的插入、缺失、替代和修复等功能。
这种基因编辑技术在基因疾病治疗、农业改良和基因组研究方面具有广阔的应用前景。
四、基因合成基因合成是指通过合成DNA序列来获得目的基因。
这种方法可以通过化学或酶切酶技术将目的基因的DNA序列合成，并将其插入到目标生物体中。
基因合成技术的发展使得科学家可以根据需要设计合成基因，从而实现特定功能的基因表达和产物合成。
第三章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序
第2节基因工程的基本操作程序一、目的基因的筛选与获取1．培育转基因抗虫棉的四个步骤(1)目的基因的筛选与获取。
(2)基因表达载体的构建。
(3)将目的基因导入受体细胞。
(4)目的基因的检测与鉴定。
2．目的基因的筛选与获取目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
主要指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
(1)筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
(2)利用PCR获取和扩增目的基因①PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在生物体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
②目的：快速扩增目的基因。
③原理：DNA半保留复制。
④基本条件：DNA模板、4种脱氧核苷酸、2种引物、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液。
⑤过程a．变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链。
b．复性：温度下降至50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
c．延伸：温度升至72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
⑥结果：每一次循环后，目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数)。
⑦鉴定：采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。
⑧仪器：PCR扩增仪。
(3)在获得转基因产品的过程中，还可以通过构建基因文库来获取目的基因。
【强化记忆】图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答：(1)图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？提示第3轮。
(2)图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。
提示第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。
分离目的基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子生物学技术，学习并掌握目的基因的分离方法，包括基因组DNA提取、目的基因的克隆、扩增和鉴定等步骤。
通过实验，使学生熟悉实验原理、操作步骤和注意事项，提高学生的动手能力和实验技能。
二、实验原理目的基因分离是指从生物基因组中提取出特定的基因片段，并进行克隆、扩增和鉴定。
实验步骤主要包括以下几部分：1. 基因组DNA提取：利用各种方法从生物组织中提取出基因组DNA。
2. 目的基因的克隆：利用PCR技术扩增目的基因，并克隆到载体上。
3. 目的基因的鉴定：通过限制性内切酶酶切、DNA测序等方法对克隆的目的基因进行鉴定。
4. 目的基因的表达：将目的基因导入宿主细胞，进行表达和功能验证。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：大肠杆菌、质粒载体、目的基因DNA模板等。
2. 试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA测序试剂盒等。
四、实验步骤1. 基因组DNA提取（1）取适量生物组织，按照DNA提取试剂盒说明书进行操作。
（2）提取的基因组DNA用琼脂糖凝胶电泳检测，确保DNA提取质量。
2. 目的基因的克隆（1）设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因。
（2）按照PCR试剂盒说明书进行PCR扩增，获得目的基因。
（3）将PCR产物与载体连接，转化大肠杆菌。
（4）通过蓝白斑筛选，获得阳性克隆。
3. 目的基因的鉴定（1）对阳性克隆进行酶切鉴定，验证目的基因是否成功克隆。
（2）对阳性克隆进行DNA测序，确定目的基因序列。
4. 目的基因的表达（1）将目的基因克隆到表达载体上，构建表达系统。
（2）将表达载体导入宿主细胞，进行目的基因的表达。
（3）检测目的基因的表达产物，验证目的基因的功能。
五、实验结果与分析1. 基因组DNA提取：提取的基因组DNA在琼脂糖凝胶电泳中呈现清晰的主带，说明DNA提取成功。
2. 目的基因的克隆：通过PCR扩增，获得目的基因片段，大小与预期相符。
第四章 目的基因的制取
第四章目的基因的制取内容提要•目的基因的制取策略•鸟枪法制取目的基因•物理化学法分离目的基因•化学合成基因•反转录合成DNA第一节目的基因制取的策略一、外源基因与目的基因基因工程主要是通过人工方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而进行遗传研究或是获得表达产物。
通常我们把插入载体的DNA片段称为“外源基因”；将那些已被或准备要被分离、改造、扩增或表达的DNA片段称为“目的基因”。
原核细胞含有上千个基因，真核细胞基因组内的基因数目更是庞大。
目的基因一般都很小，都仅由几千或几百甚至更少的碱基对组成（人生长激素释放抑制因子的基因仅有42bp）。
要想获得某个特定的目的基因，必须对其性质、结构有所了解，根据其特点来制定分离方案。
二、目的基因制取的策略目的基因制取的策略可分为直接制取和间接制取。
一般来说，大部分低等生物基因组的碱基序列已测定，可以直接制取目的基因（确切定位）。
对于高等哺乳动物来说，目的基因在DNA上无法定位，只能间接制取。
获取目的基因的方法：1、直接制取法：以机械的方法或是限制性内切酶对总DNA进行切割，再直接分离特点位点的DNA分子。
2、逆转录法（互补cDNA法）：以RNA为模板，逆转录合成cDNA。
缺点是cDNA中不含天然基因的内含子。
3、PCR扩增法：对于含极微量mRNA的细胞大多采用PCR扩增，再进行目的基因的制取。
4、鸟枪法（散弹法）：可快速和高纯度地从单拷贝或多拷贝基因中筛选获得天然的目的基因。
5、人工化学合成法。
6、其它方法：mRNA差异显示法、限制性片段长度多态性探针技术等。
目前，真核基因，利用DNA合成仪合成目的基因的成本较高；利用cDNA文库获得目的基因需大量前期工作；直接以生物细胞染色体DNA为模板可获得目的基因，但模板的扩增会产生非特异性产物；一般通过构建完整的基因文库，再从文库中“钓取”出目的基因。
第二节鸟枪法制取目的基因一、“鸟枪法”的概念“鸟枪法”是指将基因组按染色体分开后，将它全部打乱，切成碎片，进行随机测序，测序后再将它们拼接起来的方法。
人教版高中生物学选择性必修3生物技术与工程精品课件 第3章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序
酶的主要原因是
。
答案:(1)解旋酶 加热至90 ℃以上 氢键
(2)Taq DNA聚合酶热稳定性高,而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
知识点一
知识点二
知识点三
知识点四
解析:(1)体内进行DNA复制时,需用解旋酶破坏氢键使双链DNA解旋,而 利用PCR技术扩增目的基因时,是借助高温加热至90 ℃以上使DNA变性。 (2)PCR反应体系中进行互补链的合成时,温度需控制在72 ℃左右,则应使 用耐高温的DNA聚合酶,即Taq DNA聚合酶,而不能使用大肠杆菌DNA聚 合酶(高温下会失活)。
知识点一
知识点二
知识点三
知识点四
(2)在PCR技术中,为什么不直接加入解旋酶对DNA进行解旋?为什么要 求所加入的DNA聚合酶具有耐高温的特性?子链的合成为什么需要引物?
提示:DNA解旋酶既可以打开双链模板DNA,又可以打开模板DNA与引 物结合的部分,会导致复制与解旋不断地重复,达不到扩增效果。因 此,PCR反应中利用高温代替解旋酶使DNA解旋。PCR反应需要高温变性, 因此需要耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶只能将单个的脱氧核苷酸连 接到已有的短单链核酸上,因此需要一段已知序列的短单链核酸作为引物。
知识点一
知识点二
知识点三
知识点四
3.启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别
项目 本质 位置
作用
启动子
终止子
起始密码子 终止密码子
有特殊序列结构 有特殊序列结构 mRNA上三个 mRNA上三个
的DNA片段
的DNA片段 相邻碱基
相邻碱基
基因上游
基因下游
mRNA首端 mRNA尾端
RNA聚合酶识别
和结合的部位,驱 终止转录
专题21(押江苏卷非选择题) 基因工程(解析版)
专题21（押江苏卷非选择题）基因工程从近几年的新课标卷的考查知识点来看，第23题主要考查基因工程知识。
基因工程的流程和应用是高考的必考点，且常考常新，预计2022年高考也不例外，依然会对其进行考查，有可能与新的科研实事结合，综合考查基因工程的流程和应用，比如新冠病毒疫苗的研发，还可能与细胞工程、胚胎工程等综合起来考查。
能准确识记课本内容，会正确分析图形，并从题干中摘取关键信息，规范答题。
能够结合背景材料分析问题、解决问题。
从题图中提取有效信息并结合这些信息，运用所学知识与观点，通过比较、分析与综合等方法对某些生物学问题进行解释、推理，做出合理的判断或得出正确结论。
把握知识间的内在联系，要求能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象1．（2021江苏高考真题）某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag 标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题：(1)目的基因的扩增①提取真菌细胞______，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。
②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致______。
③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增，下列叙述正确的有______A．Taq酶最适催化温度范围为50～60℃B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性(2)重组质粒的构建①将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进______，形成A-m结合体。
将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及______酶等，完成质粒的环化。
基因工程 第五章目的基因的获取
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入1220个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶 合成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA mRNA 5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶 Oligo dT引物
5’
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ：
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。
随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法 （1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I
BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。 （1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。
目的基因的获得
（2）、从染色体以外的遗传物质中 获得目的基因是常用的做法
方法二、化学合成法
人工合成寡聚核苷酸技术：<60bp 在60bp与120bp之间
1.2元/bp 6.8元/bp
提供DNA合成服务的公司： 上海生工生物工程有限公司 上海英俊生物科技有限公司 上海华诺生物科技有限公司 北京奥科生物技术有限责任公司 等
特点： 1、 合成的产物是单链DNA
2、 5’、3’末端均为羟基
3、应用场合： 真核生物基因在原核中表达； 难以得到模板的情况；
获得双链的方法：
（1）、3’末端部分反向互补，混 合后在DNA聚合酶作用下互为模 板形成双链
（2）分段合成法 OH，先用激酶处理，使磷酸化
OH，先用激酶处理，使磷酸化
连接酶
（3）、分段合成，结合PCR技术 PCR
方法三、PCR技术 （1）、直接从原核微生物细胞或质粒 中扩增目的片段
（2）、引入突变
a、引物5’端引入 b、定点突变，SOE技术 c、易错PCR
方法四、RT-PCR技术
针对真核生物基因不连续的特点，利用mRNA为核 苷酸信息资源，用逆转录---PCR法获得目的基因
5’
AAA…AAA 3’
T T T…T T T
Complimentary DNA
RT：Reverse Transcriptase
Summary: 1、细胞中提取； 2、化学合成； 3、PCR技术； 4、RT-PCR
前言
基因工程技术又称为重组DNA技术， 指将某些特定的基因或DNA片断，通过载 体或其它手段送入受体细胞，使它们在受 体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。
目前用基因工程生产的蛋白质药物已达数十种，许多以前 本不可能大量生产的生长因子，凝血因子等蛋白质药物， 现在用基因工程办法便可能大量生产。
教学设计1：3.2.1 目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建
第2节基因工程的基本操作程序一、教学目标（1）阐明基因工程的原理和基本操作程序。
（2）针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。
（3）尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
二、教学重点（1）基因工程基本操作程序的四个步骤。
（2）DNA片段的扩增及电泳鉴定。
三、教学难点（1）利用PCR获取和扩增目的基因。
（2）DNA片段的扩增及电泳鉴定。
四、课时安排2课时五、教学过程（一）新课导入展示抗虫棉与普通棉的对比图片。
转基因抗虫棉是如何培育出来的？下面我们来学习它的操作步骤。
培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
（二）讲授新课第1课时目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建一、第一步：目的基因的筛选与获取（1）目的基因：用于改变受体细胞性状或获取预期表达产物等的基因，这些基因主要是指编码蛋白质的基因。
（基因通常是指有遗传效应的DNA片段）改变受体细胞性状：如抗逆性、抗虫性、抗病性、生长迅速、品质优良。
获得预期表达产物：生产药物、毒物降解酶、工业用酶等。
（2）区分抗虫棉目的基因：来源：苏云金杆菌（Bt），原核生物苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白）：破坏鳞翅目昆虫的消化系统Bt抗虫基因（Bt基因）原理：Bt抗虫蛋白在碱性环境中被酶分解为多肽，多肽可以和昆虫肠上皮细胞膜上特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，害虫死亡。
而人和牲畜胃呈酸性，Bt抗虫蛋白不能分解为相应的多肽，肠上皮细胞膜上也没有相应的受体。
所以对人和牲畜无害。
1、筛选合适的目的基因（1）方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选（2）实例：苏云金杆菌常用于制成生物杀虫剂，研究表明其杀虫作用与Bt基因有关，科学家已经了解了Bt基因的结构、功能以及其翻译产生的Bt抗虫蛋白的结构与功能。
（3）三大核酸序列数据库：GenBank（美国）、EMBL（欧洲）、DDBJ（日本）上面有许多生物的全基因组测序数据，以及一些研究清楚的基因的结构及功能注释，可以直接从中获得目的基因的序列以及它在染色体上的位置。
第五章目的基因的获取
目的标签法、非目的标签法
五、图位克隆（mapbased cloning）获 得目的基因
图位克隆：又叫定位克隆，1986年首先由剑
桥大学的Alancoulson提出。
根据目的基因在染色体上的位置进行分离基因，
无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先
六、mRNA差别显示技术（mRNA differential display）获得差异表达的基因
mRNA差别显示技术：对组织特异性 或诱导专一性表达基因进行分离的有效方 法之一。将mRNA逆转录和PCR技术相 互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技 术，也称为DDRT-PCR，
DDRT-PCR理论基础
3’ 5’
template templat因库（gene pool）：特定生物体全基因组的
集合（天然存在）e bank） 通过克隆的方法将某一基因组DNA或mRNA 保存于适当宿主菌中形成的转化子群。所有重 组DNA组合代表该基因组的全序列。
探针：目的基因局部片段、由氨基酸序列
获得的简并序列、近缘物种的同源序列
四、转座子标签法获得目的基因
（一）转座子的相关知识
转座子（transposon,Tn）:指位于染色体上
可以从基因组的一个位置转移到另一个位置的 DNA片段或基因。（jumping gene）
简单转座子：除转座所需基因外不携带任何
实验结果： 240组在能分出20000多条带！ 如果每条带相当于一种特定mRNA， 20000 mRNA基本上反映了一种特定细 胞中全部的mRNA。
DDRT-PCR操作步骤
*差异分离目的基因程序
利用两组细胞mRNA经过DDRT-PCR
后，分析比较cDNA种类的差异，分别回收 cDNA测序隆新基因。
基因克隆实验流程
基因克隆实验流程基因克隆技术，又称重组 DNA 技术，是将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA 进行体外重组，获得新的重组DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白，以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。
一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。
获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。
该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。
原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。
2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。
此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。
因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。
3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。
在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。
4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。
用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。
用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。
二、选择适当的载体按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。
为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。
获得目的基因的方法
常用的方法有P1
就是从酶，DNA进行部分酶解，得到DNA限制性片段②选用适当的限制性内切酶酶解λ噬菌体载体DNA。③经适当处理，将基因组DNA限制性片段与λ噬菌体载体进行体外重组。④利用体外包装系统将重组体包装成完整的颗粒。⑤以重组噬菌体颗粒侵染大肠杆菌，形成大量噬菌斑，从来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑
3.
最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散Байду номын сангаас射击法”。
这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。鸟枪法的具体做法是：用限制酶（即限制性内切酶）将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分别在受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法吧带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫，抗病毒的基因都可以用上述方法获得。
用“鸟枪法”获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。
二、人工合成
1
主要针对是序列已知的基因，通过DNA自动合成仪，通过固相亚磷酸酰胺法合成，可以按照已知序列将核苷酸一个一个连接上去成为核苷酸序列，一般适于分子较小而不易获得的基因。对于大的基因一般是先用化学合成法合成引物，再利用引物获得目的基因录而成的cD是，在真核生物基因组中合有大量的间隔序列或内含子，但在大肠杆菌等原核生物中没有类似序列的存在，所以大肠杆菌不能从真核生物基因的初级转录本中去除间隔序列，即不能表达真核生物DNA。而在真核生物成熟mRNA中已不存在间隔序列（已在拼接过程中被去除），所以可以以真核生物成熟mRNA为模板，逆转录而成的cDNA可被大法。
第六章 目的基因获取和DNA重组
DNA片段的组装连接方法有2种：
第一种方法：粘末端连接法
第 二 种 方 法二、 基因法获取目的基因即直接从基因中生物基因组所程
第一节 目的基因的获得
获得目的基因的方法：主要有4种 1
一、基因合成技术
基因合成，指利用4种单体脱氧核糖核苷酸 (Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ），通过化学反应，合成出一 条与已知基因序列完全相同的DNA链。
对不参加反应的集团加保护基
◆合成过程使用的保护基团，有些可以通过酸处理 移去，有的可通过碱处理移去。所以不论是5′端 的保护基团、还是3′端的保护基团，都可以通过 酸或碱的脱保护，消除掉保护集团。这样的一个 带有5′端保护的合成的二核苷酸分子，又可以同 下一个带3′端保护的单核苷酸或二核苷酸进行第 二次缩合反应，形成一个三核苷酸或四核苷酸分 子，这种从缩合反应开始，到保护基团消除，进 而再进行新的缩合反应的循环周期库是一项十分繁重的工作，一般的 基因工程实验室都难以完成此亿碱基对，即3×106kb. (2)常用的克隆载体质粒、λ噬菌体和COS质粒克隆外 源DNA的能力分别为15kb、25kb和45kb. （3）选取克隆能力最大的COS质粒载体，则需要构建 至少6.8万个克隆才可能包含整个人的基因组DNA
（2）mRNA的纯化和完整性鉴定
在典型的哺乳动物细胞中含有10000～30000种不同的 mRNA序列，但并不是任一基因的mRNA在每一细胞中都有同样 的转录数量，在特定的mRNA分子集群中，有些基因的mRNA数 量很高，而另一些基因的mRNA数量却很低，例如编码像珠蛋 白、免疫球蛋白质和卵清蛋白的mRNA，占特定类型的分化细 胞总mRNA的50%～90%，属高丰度mRNA，而相当数量的其它基 因mRNA的含量在细胞总mRNA中少于0.5%，属低丰度mRNA或稀 有mRNA。 对高丰度mRNA来讲，其所对应的A之前不需要进一步纯化和富集。但对低丰度mRNA的分离 则需要采用特殊是脱氧核糖核苷三磷酸为合成原材料。
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mRNA差示显示法获得目的基因 mRNA
Ø 原理：一般15%基因表达，而且在不同状 15% 态表达的基因是不同的 Ø 方法：PCR扩增（标记）→测序电泳→筛 PCR 选差异 Ø 优点：简便；灵敏度高；重复性好；多能 性；快速
选择原则
Ø 根据获得目的基因的目的选择方法 Ø 根据目的基因本身特点选择方法 Ø 根据实验室条件选择方法
双杂交技术原理与应用
基本原理
Ø 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即 这些因子由两个或两个以上相互独立的结构域构 成, 其中有DNA结合结构域(DB)和转录激活结构 域(AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。 Ø 单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转 录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合 蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。 Ø 例子：酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一 个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然 可结合到Gal4结合位点并激活转录。
筛选目的基因
Ø 核酸杂交法：探针 Ø 免疫结合法：抗体 Ø 其他程：组织细胞
↓温和破碎细胞 DNA片段与载体的连接包装 ↓限制性内切酶消化，噬菌体或粘粒 导入细胞 ↓核酸杂交 筛选目的基因
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 人工合成目的基因片段
Ø 原理：DNA是由3’，5’磷酸二酯键连接 DNA 3 5 ’ ’ Ø 技术：DNA自动合成仪 DNA Ø 方法
反转录合成cDNA
Ø 合成cDNA第一链：反转录酶 cDNA Ø 合成cDNA第二链： cDNA
Ø置换合成法：RNA酶H；DNA聚合酶Ⅰ； RNA H DNA T4 DNA连接酶 Ø外加引物合成法：全长双链头或衔接头 cDNA Ø cDNA与载体相连 cDNA Ø 导入宿主细胞进行克隆
Ø 猎物表达载体 ：三种
Ø VP16来自于单纯疱疹病毒，它的转录激活活性高于下 述两个 Ø 酵母Gal4的转录激活域 Ø B42来自E.coli，转录激活活性弱，可以缓和有毒性的 基因表达对细胞的影响，其后插入流感病毒HA抗原， 易于将蛋白分离纯化
基于双杂交原理的其他方法
Ø 三杂交系统：两个蛋白之间通过第三者发生相互作用，第 三物可以是蛋白质、小分子或RNA Ø 负选择系统：BDX/ADY转录激活的报告基因在特定的条 件下有毒性。如表达URA3基因的酵母在缺乏5氟乳清酸的 培养基上能够正常生长。在含5氟乳清酸的培养基上该酶将 5氟乳清酸转变成毒性复合物，使细胞停止生长或死亡 Ø 双诱饵系统：使用两种不同的诱饵激活选择性和负选择两 种报告基因的转录 Ø 哺乳动物的双杂交系统：高等生物中发现蛋白相互作用 Ø 单杂交系统：确定识别特异DNA结合蛋白的方法 Ø SOS恢复系统：研究膜受体、细胞外分泌蛋白等非核蛋白相 互作用 Ø 泛素专一性蛋白酶系统：检测蛋白相互作用中的动力学 Ø 大规模双杂交筛选：蛋白组学中的应用
Ø Ø Ø Ø Ø
质粒 ( plasmid ) 噬菌体 M13 噬菌体 逆转录病毒 DNA 昆虫病毒 DNA（插入动物细胞 ） 从
Ø ( 二 ) 目的基因的来源
Ø Ø库接合，直接筛选二倍体
细菌双杂交系统 1
Ø 利用百日咳博代杆菌中cya基因编码的钙调蛋白(CaM)依 赖性腺苷酸环化酶，其激活区可以分成T18和T25两个相 对独立的功能片段 Ø 将这两种片段引入大肠杆菌DHP1(cya)中独立表达，它们 不能彼此识别与作用，因此不能互补大肠杆菌DHP1的 cya缺陷型性状，表现为β 半乳糖苷酶活性很低，生长在 MacConkey/麦芽糖平板上的菌落呈白色 Ø 若这两个功能区分别与一对可相互作用的蛋白质融合表 达，它们可形成有功能的腺苷酸环化酶，互补大肠杆菌 DHP1的cya缺陷型，使菌株β 半乳糖苷酶活性上升，生 长在MacConkey/麦芽糖平板上菌落显红色 Ø 因此应用这个双杂交系统研究蛋白质间的相互作用即可根 据β 半乳糖苷酶和麦芽糖酶的活力来检测
mRNA的分离 mRNA
Ø 10 5 μg/细胞，80~85%为rRNA，15%小分 g/ 80~85% rRNA 15% 子量RNA（tRNA等）15%mRNA，28S： RNA tRNA 1 5%mRNA 28S ： 18S=2：1 18S=2
Ø 提取总RNA ：常规方法；Trizon Ø 提取纯化mRNA：oligodT柱 mRNA oligo dT
RNA介导的三杂交系统
Ø与AD融合的蛋白是具有RNA结合域的蛋白（如细菌MS2），能够与RNA AD RNA MS2 分子的臂环结构结合；RNA除具有臂环结构外，还有诱饵序列（test）。 RNA test 这样RNA分子与DB蛋白复合物构成了双杂交系统中的诱饵，它结合于报 RNA DB 告基因的上游；第3个分子是AD蛋白，如果该蛋白识别诱饵序列test并结 3 AD test 合，则报告基因转录。
Ø 选材：mRNA丰富，目的基因表达活跃 mRNA Ø 注意点：防止RNA酶污染 RNA
构建流程
组织细胞 ↓破碎细胞，除去DNA与蛋白质 提取总RNA ↓oligo（dT）纤维素亲合柱层析 合成cDNA第一链 ↓反转录 合成cDNA第二链 ↓插入载体 重组泛素专一性蛋白酶系统
Ø 泛素与蛋白质形成的融合蛋白可以被泛素专一性 蛋白酶（UBPS）分解，并且需要泛素正确折叠 Ø 泛素的两个结构域分别表达时就能够正确折叠， 当N端发生错义突变时不能正确折叠 Ø 当两个蛋白（A、B）分别与泛素的N端、C端融 合，若A、B相互作用，则N端错义突变引起的不 正确折叠能够得到纠正，C端和N端能够正确折 叠，UBPS水解使得二氢叶酸还原酶释放 Ø 该系统可检测蛋白相互作用中的动力学性质
大规模双杂交筛选1
a 矩阵法：以横向方式 生长的是含有诱饵的单 倍体酵母，竖线方式生 长的是猎物库的单倍体 酵母 复印膜,单倍体接合 后，在交叉处的酵母则 融合成二倍体 将二倍体分别在含X Gal和Leu培养基上进 行筛选
大规模双杂交筛选2
B 一一对应方法：诱 饵与猎物相对应， 接合于丰富培养基 上，拷贝膜在选择 培养基上进行筛选
负选择系统
Ø a 报告基因不转 录，细胞生长； Ø b 报告基因转 录，细胞不生长 或死亡（在含5 氟乳清酸的培养 基上，URA3基 因表达产物降解 5氟乳清酸为有 毒物质）
反向双杂交系统应用
Ø可更有效地蛋白间作用的关键位点或起决 定作用的个别氨基酸， 进而分析蛋白结构 和功能的关系 Ø可筛选能阻止某些蛋白间相互作用的肽或 小分子物质用作临床治疗制剂 Ø研究相互作用的蛋白间的结构特征 Ø筛选蛋白突变体 Ø确定能够打破特异的蛋白相互作用的试剂
目的基因的用途
Ø 研究该基因的全貌与内涵：结构、功能、 调控 Ø 寻找异常基因异常点，探索疾病的机理与 治疗 Ø 研究生物种系进化与相关同源性 Ø 基因工程重组表达 Ø 改造某些基因 Ø 基因治疗
原
理
Ø 原核目的基因获得：直接分离 Ø 真核目的基因获得： Ø ( 一 ) 载体 ：宿主细胞内可独立复制的完整 DNA 分子 。
双杂交系统工作原理示意图
a 天然Gal4蛋白具有DNA结合域和转录激活域，诱导Gal1LacZ转录； Gal4 DNA Gal1 LacZ 转录； b 只有DNA结合域（上）或转录激活域（下）的杂合蛋白不能激活报告基因的转录； DNA 结合域（上）或转录激活域（下）的杂合蛋白不能激活报告基因的转录； c 蛋白X和Y之间的相互作用使Gal4的两个结构域接近导致报告基因的转录 X Y Gal4
基本技术
Ø染 Ø筛选 Ø假阳性剔除 Ø测序 Ø生物学功能验证
双杂交系统的发展
Ø 报告基因的多样化
Ø 多报告基因系统：LacZ，酵母营养缺陷型Leu2和His3
Ø 诱饵表达载体 ：两种
Ø Gal4和LexA，后者结合于E.coli的LexA操纵子且不具 有核定位序列
单杂交系统
Ø用于确定识别特异DNA结合蛋白的方法 Ø在系统中诱饵是报告基因一段特定的上游 序列 Ø将DNA复制起始序列ACS与现并分离了酵母ORC6——DNA复 制复合物蛋白之一
SOS恢复系统
Ø 上述反应都是在核中进行的，对于研究膜蛋白， 分泌蛋白，膜受体及胞质蛋白有很大的局限性 Ø SOS恢复系统是针对于膜受体、细胞外分泌蛋白 的一种方法 Ø 原理：酵母温度敏感株是由于在ras信号途径中存 在突变体，不能将外来信号传递给膜上的RAS蛋 白，在36℃不能存活 Ø 将野生性SOS与X融合，豆蔻酰化信号与Y融合， 使Y定位于膜上。若X与Y结合，则SOS蛋白定位 于膜上，与RAS接近，激活ras途径，完成SOS过 程，36℃下生长
蛋白质三杂交系统
a ：蛋白Z稳定了 蛋白A和B之间 的作用； B： 蛋白质A和B 通过蛋白Z相互 作用； C： 蛋白Z改变了 A的结构，使得 B能与之作用
通过小分子的三杂交系统
利用FK506与地塞 FK506 米松杂合分子，将 与LexABD融合 LexA BD 的糖皮质激素受体 及杂合分子作为诱 饵，用于筛选与 饵，用于筛选与FK506 蛋白FKBP12 FKBP12
三杂交系统应用
Ø分析确定RNA蛋白作用的精确结构域，甚 至单个核苷酸或氨基酸残基 Ø鉴定和克隆识别结合有重要生理功能 RNA(如转录、定位、RNA病毒包装和感染 等)的蛋白质，可用于调控的机理研究、疾 病的防治以及抗病毒药物的研制开发 Ø通过构建杂交RNA库，可筛选与特定蛋白 结合的RNA Ø有可能在此基础上发展四杂交系统研究 RNARNA间的相互作用
双诱饵系统
Ø 使用两种不同的诱饵激活选择性和负选择两种报 告基因的转录 Ø 用于区分桥蛋白与识别蛋白 Ø 还可以区分野生型蛋白和病理条件下的蛋白变种
哺乳动物的双杂交系统
Ø 酵母毕竟是一种较低等的生物，蛋白的翻译后修 饰（糖基化、二硫键的形成等）程度很低 Ø 要进一步研究蛋白产物的生物学功能，还必须建 立高等生物体系的双杂交系统 Ø 系统采用单纯疱疹病毒VP16的AD区段 Ø 用氯霉素乙酰转移酶为报告基因，其活性可以在 细胞提取物中检测 Ø 采用磷酸钙共沉淀转化入Hela细胞培养 Ø 该方法主要用于检验已知蛋白的相互作用