第四章目的基因的制备连接导入与基因文库的构建优秀课件
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基因工程ppt课件
提取某种生物的全部DNA 用适当的限制酶切
一定大小的DNA片段
将DNA片段与: cDNA合成法
+ 第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补 的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。
+ 第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解， 使之变成单链的的基因主要是指___编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因_
请举出三个以上的例子
供体生物细胞
2、获人工化学合成
限制酶
取出 DNA 用限制酶剪 去与模板互补的DNA双链） 重复循环
16
实际具体过程
17
PCR技术
• 原理： DNA复制 • 前提：
一段已知目的基因的核苷酸序列 • 原料
模板DNA；DNA引物；四种脱氧 核苷酸；热稳定DNA聚合酶 （Taq酶）
• 方式：以_指__数__方式扩增，
PCR扩增仪
即_2_n__（n为扩增循环的次数）
18
1、概念：
基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。 通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种 基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物 的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。
1
2. 基因工程最基本的工具 ──限制性内切酶
以大肠杆菌中的一种叫做EcoRІ的限制酶为例：
限制酶
结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。
终止子：位于基因的尾端的 一段特殊的DNA片断，能 终止mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别 受体细胞中是否含有目的基 因，从而将有目的基因的细
27
1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 ABCD
A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因
一定大小的DNA片段
将DNA片段与: cDNA合成法
+ 第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补 的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。
+ 第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解， 使之变成单链的的基因主要是指___编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因_
请举出三个以上的例子
供体生物细胞
2、获人工化学合成
限制酶
取出 DNA 用限制酶剪 去与模板互补的DNA双链） 重复循环
16
实际具体过程
17
PCR技术
• 原理： DNA复制 • 前提：
一段已知目的基因的核苷酸序列 • 原料
模板DNA；DNA引物；四种脱氧 核苷酸；热稳定DNA聚合酶 （Taq酶）
• 方式：以_指__数__方式扩增，
PCR扩增仪
即_2_n__（n为扩增循环的次数）
18
1、概念：
基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。 通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种 基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物 的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。
1
2. 基因工程最基本的工具 ──限制性内切酶
以大肠杆菌中的一种叫做EcoRІ的限制酶为例：
限制酶
结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。
终止子：位于基因的尾端的 一段特殊的DNA片断，能 终止mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别 受体细胞中是否含有目的基 因，从而将有目的基因的细
27
1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 ABCD
A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因
目的基因的制备基因文库法ppt课件
组织或细胞染色体DNA 限带的所有基 因组DNA片段的集合.
克隆载体 重组DNA分子
受体菌 含重组分子的转化菌
genomic library
每个细胞含有一个基因组 DNA片段与载体的重组DNA分 子，许多细胞组成一个含有基 因组的色概率基因 该种生物所有基因 应用范围 ◆ 基因原始结构功能的研究 ◆ 对比分析内含子、外显子及调控区域 ◆ /46
逆转录
以单链RNA为模板合成双链DNA的反应。
DNA mRNA
14/46
逆转录病毒细胞内的逆转录现象：
RNA 模板 逆转录酶
RNA酶
DNA-RNA 杂化双链
Байду номын сангаас
单链DNA
双链DNA
逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样具
有遗传物质的传代与表达功能。
15/46
逆转录酶的应用:
应用于基因工程
基因
mRNA 蛋白质多肽链
7/46
2.经验值
Transcription 从cDNA中获得的是经过剪切去除内含子的基因。
ln(1－P)
start codon Plasmid or phage
N=
非翻译区的序列特征对基因的表达具有重要的调控作用，编码序列则是合成基因产物—蛋白质模板。
ln(1－f/g) 某细胞的mRNA分子数为500 000，某个丰度为3500拷贝/细胞的mRNA基因，最小值为500 000/3500=143，丰度为14拷贝/细胞的mRNA
58330
人
3.2×109
320000
1473652
128000
589459
71111
327476
10/46
第四章 目的基因的制取
第四章目的基因的制取内容提要•目的基因的制取策略•鸟枪法制取目的基因•物理化学法分离目的基因•化学合成基因•反转录合成DNA第一节目的基因制取的策略一、外源基因与目的基因基因工程主要是通过人工方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而进行遗传研究或是获得表达产物。
通常我们把插入载体的DNA片段称为“外源基因”；将那些已被或准备要被分离、改造、扩增或表达的DNA片段称为“目的基因”。
原核细胞含有上千个基因，真核细胞基因组内的基因数目更是庞大。
目的基因一般都很小，都仅由几千或几百甚至更少的碱基对组成（人生长激素释放抑制因子的基因仅有42bp）。
要想获得某个特定的目的基因，必须对其性质、结构有所了解，根据其特点来制定分离方案。
二、目的基因制取的策略目的基因制取的策略可分为直接制取和间接制取。
一般来说，大部分低等生物基因组的碱基序列已测定，可以直接制取目的基因（确切定位）。
对于高等哺乳动物来说，目的基因在DNA上无法定位，只能间接制取。
获取目的基因的方法：1、直接制取法：以机械的方法或是限制性内切酶对总DNA进行切割，再直接分离特点位点的DNA分子。
2、逆转录法（互补cDNA法）：以RNA为模板，逆转录合成cDNA。
缺点是cDNA中不含天然基因的内含子。
3、PCR扩增法：对于含极微量mRNA的细胞大多采用PCR扩增，再进行目的基因的制取。
4、鸟枪法（散弹法）：可快速和高纯度地从单拷贝或多拷贝基因中筛选获得天然的目的基因。
5、人工化学合成法。
6、其它方法：mRNA差异显示法、限制性片段长度多态性探针技术等。
目前，真核基因，利用DNA合成仪合成目的基因的成本较高；利用cDNA文库获得目的基因需大量前期工作；直接以生物细胞染色体DNA为模板可获得目的基因，但模板的扩增会产生非特异性产物；一般通过构建完整的基因文库，再从文库中“钓取”出目的基因。
第二节鸟枪法制取目的基因一、“鸟枪法”的概念“鸟枪法”是指将基因组按染色体分开后，将它全部打乱，切成碎片，进行随机测序，测序后再将它们拼接起来的方法。
高中生物课件《目的基因获取和基因表达载体的构建 》
d．要求
□ 模板： 23 _目_的__基__因__两__条_链___
原料：dNTP
酶：热稳定□24 __D_N_A__聚__合_酶_____(□25 ____T_aq__酶_______) 引物：人工合成的两条□26 __D__N_A__片_段______(引物 1，引物 2)
知识点一
知识点二
课时精练
②利用 PCR 技术扩增目的基因
a．PCR 含义：是多聚酶链式反应的缩写，是一项在生物体外 □19
__复__制__特__定__D_N_A__片__段______的核酸合成技术。
□ b．PCR 原理： 20 __D_N__A_双__链__复__制__。
知识点一
知识点二
课时精练
c．前提条件：有一段已知目的基因的□21 _____核_苷__酸______序列，以便根 据这一序列合成□22 ____引__物________。
知识点一
知识点二
Hale Waihona Puke 课时精练d．构建过程
知识点一
知识点二
课时精练
e ． 提 取 依 据 ： 根 据 基 因 的 有 关 信 息 ， 如 □17 _基_因__的__核__苷__酸_序__列_ 、 □18
__基__因__的__功_能_____、基因在染色体上的位置、基因的转录产物 mRNA 以及基因 的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
提示：PCR 过程中，DNA 双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶； 由于 PCR 过程温度较高，所以需要能耐高温的 DNA 聚合酶。
知识点一
知识点二
课时精练
提示
典题分析 题型一 目的基因获取方法的辨析 [例 1] 下列有关获取目的基是工作量 大，具有一定的盲目性 B．由于真核细胞的基因中含有不表达的 DNA 片段，所以一般使用人工 合成的方法获取真核细胞中的目的基因 C．如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以利用化学方法直接人工 合成 D．PCR 技术的原理是 DNA 复制，需 DNA 连接酶催化 DNA 合成
□ 模板： 23 _目_的__基__因__两__条_链___
原料：dNTP
酶：热稳定□24 __D_N_A__聚__合_酶_____(□25 ____T_aq__酶_______) 引物：人工合成的两条□26 __D__N_A__片_段______(引物 1，引物 2)
知识点一
知识点二
课时精练
②利用 PCR 技术扩增目的基因
a．PCR 含义：是多聚酶链式反应的缩写，是一项在生物体外 □19
__复__制__特__定__D_N_A__片__段______的核酸合成技术。
□ b．PCR 原理： 20 __D_N__A_双__链__复__制__。
知识点一
知识点二
课时精练
c．前提条件：有一段已知目的基因的□21 _____核_苷__酸______序列，以便根 据这一序列合成□22 ____引__物________。
知识点一
知识点二
Hale Waihona Puke 课时精练d．构建过程
知识点一
知识点二
课时精练
e ． 提 取 依 据 ： 根 据 基 因 的 有 关 信 息 ， 如 □17 _基_因__的__核__苷__酸_序__列_ 、 □18
__基__因__的__功_能_____、基因在染色体上的位置、基因的转录产物 mRNA 以及基因 的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
提示：PCR 过程中，DNA 双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶； 由于 PCR 过程温度较高，所以需要能耐高温的 DNA 聚合酶。
知识点一
知识点二
课时精练
提示
典题分析 题型一 目的基因获取方法的辨析 [例 1] 下列有关获取目的基是工作量 大，具有一定的盲目性 B．由于真核细胞的基因中含有不表达的 DNA 片段，所以一般使用人工 合成的方法获取真核细胞中的目的基因 C．如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以利用化学方法直接人工 合成 D．PCR 技术的原理是 DNA 复制，需 DNA 连接酶催化 DNA 合成
基因文库的构建
洗菌体碎片和 Pr
使单链DNA牢 固结合在膜上
• ⑵ 免疫结合法
• 噬菌斑转印到硝酸纤维膜上，各种cDNA 表达并呈现在噬菌体表面的蛋白质便牢 固地结合在膜上。然后将膜放入含有特 异抗体的溶液中进行免疫结合反应，洗 去未结合的抗体后，再与125 I 标记的第 二抗体结合, 从而找出带有放射性示踪信 号的斑点, 进而找出对应噬菌斑, 克隆扩 增, 提取DNA后经酶切可获目的基因。
衔接头：一端为平头，一端为粘末端。
（2）cDNA与载体相连
cDNA与一个载体在T4连接酶作用下以粘末端 互相连接，即为重组DNA 分子。
（3）导入宿主细胞 重组体在一定条件下导入宿主细胞培
养或保存。 宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆
体，以保证它们的遗传性状相同。
筛选目的基因
⑴ 核酸杂交法 特殊标记的寡核苷酸链为 探针
利
用
基
因
文
库
筛
选某一Fra bibliotek基因
片 段
An efficient technique commonly used to detect a bacterial colony carrying a particular DNA clone.
4.7 DNA与蛋白质相互作用技术
•凝胶阻滞法
•DNase Ⅰ足迹法
4.7.1 凝胶阻滞实验
DNA来 源
基因组的大 小
（bp）
被克隆的 DN95 P=0.99
大肠杆 菌 酵母 果蝇
4.639X106 1.4X107 1.8X108
1.4X104 1.4X104 1.4X104
720 2300 2300
0
940 300皿内所形成的菌落或噬 菌斑）转印到硝酸纤维素膜上，碱解后加 带标记的探针进行杂交，能显示特异结合 探针的点（克隆）便是目的基因所在处。 确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取， 再用限制性酶切出cDNA基因片断，即为目 的基因。（如图）
使单链DNA牢 固结合在膜上
• ⑵ 免疫结合法
• 噬菌斑转印到硝酸纤维膜上，各种cDNA 表达并呈现在噬菌体表面的蛋白质便牢 固地结合在膜上。然后将膜放入含有特 异抗体的溶液中进行免疫结合反应，洗 去未结合的抗体后，再与125 I 标记的第 二抗体结合, 从而找出带有放射性示踪信 号的斑点, 进而找出对应噬菌斑, 克隆扩 增, 提取DNA后经酶切可获目的基因。
衔接头：一端为平头，一端为粘末端。
（2）cDNA与载体相连
cDNA与一个载体在T4连接酶作用下以粘末端 互相连接，即为重组DNA 分子。
（3）导入宿主细胞 重组体在一定条件下导入宿主细胞培
养或保存。 宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆
体，以保证它们的遗传性状相同。
筛选目的基因
⑴ 核酸杂交法 特殊标记的寡核苷酸链为 探针
利
用
基
因
文
库
筛
选某一Fra bibliotek基因
片 段
An efficient technique commonly used to detect a bacterial colony carrying a particular DNA clone.
4.7 DNA与蛋白质相互作用技术
•凝胶阻滞法
•DNase Ⅰ足迹法
4.7.1 凝胶阻滞实验
DNA来 源
基因组的大 小
（bp）
被克隆的 DN95 P=0.99
大肠杆 菌 酵母 果蝇
4.639X106 1.4X107 1.8X108
1.4X104 1.4X104 1.4X104
720 2300 2300
0
940 300皿内所形成的菌落或噬 菌斑）转印到硝酸纤维素膜上，碱解后加 带标记的探针进行杂交，能显示特异结合 探针的点（克隆）便是目的基因所在处。 确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取， 再用限制性酶切出cDNA基因片断，即为目 的基因。（如图）
2023届高三一轮复习生物：基因表达载体的构建、目的基因的导入课件
谢谢聆听
知新： 阅读书本P81资料卡，解决农杆菌转化法的相关问题：
资料1: 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子 叶植物和裸子植物，而对绝大多数单子叶植物没有侵染能力。
资料2: 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上 的T—DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其 整合到该细胞的染色体DNA上
图中质粒没有标明的结构是___________，该结构的作用是_____________________T。—DNA
（2）过程②常用农杆菌转化法将重组质粒导入愈染伤色组体织D，NA该方法能够借助Ti质粒上的_______
将BT毒蛋白基因整合到愈伤组织的________________________。
2、如何处理受体细胞？
吸收
Ca2+处理
3、处理后的细胞具备什么样的特点？
细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
Ca2+ 感受态细胞
【典例】下列关于目的基因导入受体细胞的方法中，不正确的是( D )
A.我国利用花粉管通道法培育了转基因抗虫棉 B.用Ca2＋处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞 C.将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是显微注射法 D.利用农杆菌转化法培育大多单子叶转基因植物
【习题检测】下图是基因工程培育抗虫植物的示意图。下列叙述正确的是( D )
A．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与B．③ 侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上C．④的染 色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状D．⑤只要表现 出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
【习题检测】玉米是二倍体植物，某科研人员将BT毒蛋白基因导入玉米细胞，培育转基因抗虫玉
cDNA文库构建-PPT课件 135页PPT
某一时期特定细胞或组织中mRAN， 是转录水平，仅反映某一时期特定组织库可真实显示基因组的全部结构信息，由于制备DNA 片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的DNA片段既可能 是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因 外还包含着两侧的邻近DNA顺序库
•构建流程
抽提基因组 DNA 鸟枪法制备DNA片 段 DNA片段与载体重组
转化宿主菌
筛选目的基因（核酸探序列分析 基因在染色体上的定位 克隆鉴定基因调控元件 基因组中基因的结构和组织形式分析
根据基因类型（重组DNA片段的供体） 基因组 和cDNA1、基因组
★ 基因组(gene library)：用重组DNA
技术，将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后，然后转移到适当的宿主 细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克 隆），这些存在于所有重组时已排除了其它的RNA，使假阳性率减低。 (5) cDNA可在细菌中表达，可用多种策略进行筛选。
一个细胞在任何时间可以产生几千种不同的蛋白质，所 有的蛋白质都有相应的mRNA分子。为了鉴别其中任何一个 mRNA分子，每一单独mRNA的克隆都得考虑，但是mRNA 不能直接用于克隆，因为它很不稳定，因此，可以合成与选 定组织中所有mRNA互补的DNA分子（complementary 的表达。
注意
(1) 细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的mRNA要求很 高的克隆数(要用公式来计算)。 (2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得其mRNA并非 易事。用不同发育阶段，或。 不能用于基因结构和调节的研究。一个基因经不同的剪接可 产生不同的部分重叠的cDNA克隆。 基因与基因库（gene bank） 区别
基因库是指选取其中重组体形式贮存起来; ☆ 是和缺失型DNA，或不同时空、不同环 境条件下的两种CDNA样品反复杂交，去处杂交体后，将剩余位 点及选择标记，可通过细菌培养修饰
•构建流程
抽提基因组 DNA 鸟枪法制备DNA片 段 DNA片段与载体重组
转化宿主菌
筛选目的基因（核酸探序列分析 基因在染色体上的定位 克隆鉴定基因调控元件 基因组中基因的结构和组织形式分析
根据基因类型（重组DNA片段的供体） 基因组 和cDNA1、基因组
★ 基因组(gene library)：用重组DNA
技术，将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后，然后转移到适当的宿主 细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克 隆），这些存在于所有重组时已排除了其它的RNA，使假阳性率减低。 (5) cDNA可在细菌中表达，可用多种策略进行筛选。
一个细胞在任何时间可以产生几千种不同的蛋白质，所 有的蛋白质都有相应的mRNA分子。为了鉴别其中任何一个 mRNA分子，每一单独mRNA的克隆都得考虑，但是mRNA 不能直接用于克隆，因为它很不稳定，因此，可以合成与选 定组织中所有mRNA互补的DNA分子（complementary 的表达。
注意
(1) 细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的mRNA要求很 高的克隆数(要用公式来计算)。 (2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得其mRNA并非 易事。用不同发育阶段，或。 不能用于基因结构和调节的研究。一个基因经不同的剪接可 产生不同的部分重叠的cDNA克隆。 基因与基因库（gene bank） 区别
基因库是指选取其中重组体形式贮存起来; ☆ 是和缺失型DNA，或不同时空、不同环 境条件下的两种CDNA样品反复杂交，去处杂交体后，将剩余位 点及选择标记，可通过细菌培养修饰
《目的基因的制备》课件
表达
让目的基因在目标生物体 中得到表达，产生所需的 蛋白质或产物。
常用的制备方法
1
PCR法
通过聚合酶链式反应扩增目的基因，需设计引物与模板DNA配对。
2
连接法
通过连接酶催化，将目的基因与载体DNA连接，形成重组DNA。
3
重组法
利用重组酶切割DNA，然后将目的基因嵌入到载体DNA中。
PCR法的制备步骤
重组法的制备步骤
1. 将目的基因和载体DNA以及重组酶一起反应。 2. 重组酶切割DNA，使目的基因与载体DNA形成黏性末端。 3. 将目的基因嵌入载体DNA中，即形成重组DNA。 4. 将重组DNA转化入宿主细胞，进行表达。 5. 检测表达产物的功能和纯度。
目的基因的应用
科学研究
目的基因的制备使得科学家可 以深入研究细胞、生物体和人 类基因等重要领域。
1. 设计引物，使其与目的基因的序列互补。 2. 提取模板DNA。 3. 设置PCR反应体系，包括引物、酶、酶缓冲液等。 4. 进行PCR扩增，包括变性、退火、延伸等步骤。 5. 检测PCR产物的纯度和大小。
连接法的制备步骤
1. 准备目的基因、载体DNA和连接酶。 2. 将目的基因与载体DNA进行切割，暴露黏性末端。 3. 用连接酶将目的基因与载体DNA连接。 4. 转化连接产物入宿主细胞，形成重组DNA。 5. 筛选含有目的基因的克隆，进一步分析。
医学研究
目的基因的制备有助于研究疾 病发生机制、疾病基因与药物 治疗的关系，推进医学进步。
农业应用
通过改良作物品种，提高产量 和抗病能力，目的基因的制备 对农业发展具有重要意义。
常见问题及解决方法
1 降低质量
使用高质量的试剂和操作规范可以减少目的基因制备过程中的质量问题。
目的基因与载体连接PPT课件
为了进一步提高启动子的强度，使目的记忆高效 表达，将上述的lac启动子和trp启动子串联起来，提 高了转录速度。例如pTAC12质粒载体。
病毒载体大都含有较强的启动子，能保证插入的 外源基因有效转录和表达，且转染的效率要高于转化， 因而也长作为目的基因的表达载体。
第9页/共29页
第三节 连接前的处理
第23页/共29页
第六节 人工接头连接
人工接头（衔接物或适配子）：指人工合成的具 有一个或是个特定限制性内切酶识别和切割序列的双 股平端DNA短序列。其分子长度约为8-12bp，具有一定 碱基序列，在其序列内具有一个或多个限制性内切酶 识别位点。利用人工合成的接头可以很方便地将具有 平端的DNA片段结合到可怜载体上。
一般用连接酶将人工接头连接到外源片段的两端， 利用内切酶切割成黏性末端，最后利用连接酶连接。 此方法适用于没有所需限制酶切位点的外源片段。
第24页/共29页
1、人工接头连接平端的DNA片段（图） 2、人工接头连接黏端的DNA片段
注意：人工接头的选择要以外源片段上的限制酶 识别位点为主，要避免二者具有相同的酶切位点，都 在会给后续其它操作带来麻烦。
酸（添加同聚物造成延伸部分）。 如果把所需要的DNA片段加上低聚腺嘌呤核苷酸
（dA），而把载体分子接上低聚胸腺嘧啶核苷酸 （dT），那么由于二者之间能形成氢键互补，同样可
（3）、克服载体自身的环化：连接过程中，载体自 身除了环化外，还能形成串联寡聚物。
用高浓度的DNA（目的基因：载体为3：1）和牛 小肠碱性磷酸酶（CIP）处理载体，去除5’－P使之 不能自身环化，缺口在宿主内可得到修复。图
第18页/共29页
三、双酶切片段的定向克隆 以两种不同的限制性内切酶切割目的基因，使之
病毒载体大都含有较强的启动子，能保证插入的 外源基因有效转录和表达，且转染的效率要高于转化， 因而也长作为目的基因的表达载体。
第9页/共29页
第三节 连接前的处理
第23页/共29页
第六节 人工接头连接
人工接头（衔接物或适配子）：指人工合成的具 有一个或是个特定限制性内切酶识别和切割序列的双 股平端DNA短序列。其分子长度约为8-12bp，具有一定 碱基序列，在其序列内具有一个或多个限制性内切酶 识别位点。利用人工合成的接头可以很方便地将具有 平端的DNA片段结合到可怜载体上。
一般用连接酶将人工接头连接到外源片段的两端， 利用内切酶切割成黏性末端，最后利用连接酶连接。 此方法适用于没有所需限制酶切位点的外源片段。
第24页/共29页
1、人工接头连接平端的DNA片段（图） 2、人工接头连接黏端的DNA片段
注意：人工接头的选择要以外源片段上的限制酶 识别位点为主，要避免二者具有相同的酶切位点，都 在会给后续其它操作带来麻烦。
酸（添加同聚物造成延伸部分）。 如果把所需要的DNA片段加上低聚腺嘌呤核苷酸
（dA），而把载体分子接上低聚胸腺嘧啶核苷酸 （dT），那么由于二者之间能形成氢键互补，同样可
（3）、克服载体自身的环化：连接过程中，载体自 身除了环化外，还能形成串联寡聚物。
用高浓度的DNA（目的基因：载体为3：1）和牛 小肠碱性磷酸酶（CIP）处理载体，去除5’－P使之 不能自身环化，缺口在宿主内可得到修复。图
第18页/共29页
三、双酶切片段的定向克隆 以两种不同的限制性内切酶切割目的基因，使之
DNA文库的构建和目的基因ppt课件
含
▪ 从特定组织提取的染色制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因 91)基因组 (Genomic library) ：
▪ 是指将某种生物体基因组转录的全部
mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克 隆载体重组，储存于某种受体ntary DNA，互补
DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发 育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形 成的互补DNA。
因，因此从特定组织中制备的mRNA通常会 富集某些特异序列。所以起始材料的选择 十分重要。
30
1、mRNA的制备: 动物细胞或植物细胞mRNA的制备
2、mRNA的来源: 选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等方
法提高mRNA的含量。 3、mRNA完整性的检测
1)mRNA分子的大小：哺乳动物mRNA长度为5008000bp，大部分mRNA位于1.51
▪ 外源基因：插入到载体内的那个特定
的片段基因。
▪ 目的基因：那些已被或者准备要分离、
改造、扩增或表达的特定基因或DNA片 段。
2
对于高等真核生物而言，基因组DNA 十分庞大,基因可达数万个，且基因组成 结构复杂，除编码序列，还有非编码序 列及调控序列，基因间还存在大量的间 隔序列和重复序列，因此，单个目的基 因在整个基因组中所占的比例极其微小， 除少数例外，绝大多数基因难以直接分 离得到。
15
（二）基因组DNA的不完全酶切 1、根据实验需要选择合适的限制性内切 酶 2、分离目的酶切片段大小的确定
a) 克隆单个基因：< 10 kb b) 克隆基因族：< 20kb 3、DNA不完全酶切条件的确定 a) 确定限制酶用量，改变酶切时间 b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量
16
▪ 从特定组织提取的染色制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因 91)基因组 (Genomic library) ：
▪ 是指将某种生物体基因组转录的全部
mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克 隆载体重组，储存于某种受体ntary DNA，互补
DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发 育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形 成的互补DNA。
因，因此从特定组织中制备的mRNA通常会 富集某些特异序列。所以起始材料的选择 十分重要。
30
1、mRNA的制备: 动物细胞或植物细胞mRNA的制备
2、mRNA的来源: 选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等方
法提高mRNA的含量。 3、mRNA完整性的检测
1)mRNA分子的大小：哺乳动物mRNA长度为5008000bp，大部分mRNA位于1.51
▪ 外源基因：插入到载体内的那个特定
的片段基因。
▪ 目的基因：那些已被或者准备要分离、
改造、扩增或表达的特定基因或DNA片 段。
2
对于高等真核生物而言，基因组DNA 十分庞大,基因可达数万个，且基因组成 结构复杂，除编码序列，还有非编码序 列及调控序列，基因间还存在大量的间 隔序列和重复序列，因此，单个目的基 因在整个基因组中所占的比例极其微小， 除少数例外，绝大多数基因难以直接分 离得到。
15
（二）基因组DNA的不完全酶切 1、根据实验需要选择合适的限制性内切 酶 2、分离目的酶切片段大小的确定
a) 克隆单个基因：< 10 kb b) 克隆基因族：< 20kb 3、DNA不完全酶切条件的确定 a) 确定限制酶用量，改变酶切时间 b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量
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高中生物基因工程的基本操作程序课件新人教版选修
生物固氮：通过基因工程将固氮微生物的固氮基因导入植物体内，提高植物的固氮能力， 从而增加土壤肥力，提高农作物的产量和品质。
在工业领域的应用
生物制药：基因工程药物的生产，如胰岛素、生长激素等 生物农药：利用基因工程生产高效、低毒的生物农药，如Bt杀虫剂 生物材料：利用基因工程生产生物可降解材料，如聚乳酸（PLA） 生物能源：利用基因工程生产生物燃料，如酒精、生物沼气等
在环境保护领域的应用
检测和鉴定环境污染的程度 治理污染的生物 生物降解 基因工程生产具有降解作用的微生物
基因工程的安全性问题
基因污染：基因工程可能会导致基 因污染，即插入的外源基因在环境 中扩散。
潜在风险：基因工程可能带来潜在 风险，如产生新的疾病或使某些生 物变得更具侵略性。
添加标题
体重组后转入细胞内进行扩增，并表达产生所需蛋白质的技术 • 基因工程的基本原理：基因重组、基因克隆等 • 基因工程的应用：医药、工业、农业等领域 • 基因工程的发展前景：随着技术的不断进步，基因工程将在未来发挥更加重要的作用
限制性核酸内切酶
作用：切割DNA分子，暴露 出黏性末端或平末端
分类：限制性内切酶和非限 制性内切酶
疫苗研发：利用基因工程技术生产 疫苗，如乙肝疫苗等。
在农业领域的应用
抗虫、抗病：通过基因工程培育出具有抗虫、抗病能力的农作物，提高农作物的抗病、抗 虫能力，减少农药使用量，降低环境污染。
抗逆性：通过基因工程培育出能够适应恶劣环境的农作物，提高农作物的抗逆性，从而增 加农作物的产量和品质。
转基因技术：将外源基因导入植物体内，产生具有特定性状的转基因植物，提高农作物的 产量和品质。
定义：能够识别DNA分子内 部的特异序列并准确切割的 酶
应用：在基因工程中用于切 割目的基因和控制其表达的
在工业领域的应用
生物制药：基因工程药物的生产，如胰岛素、生长激素等 生物农药：利用基因工程生产高效、低毒的生物农药，如Bt杀虫剂 生物材料：利用基因工程生产生物可降解材料，如聚乳酸（PLA） 生物能源：利用基因工程生产生物燃料，如酒精、生物沼气等
在环境保护领域的应用
检测和鉴定环境污染的程度 治理污染的生物 生物降解 基因工程生产具有降解作用的微生物
基因工程的安全性问题
基因污染：基因工程可能会导致基 因污染，即插入的外源基因在环境 中扩散。
潜在风险：基因工程可能带来潜在 风险，如产生新的疾病或使某些生 物变得更具侵略性。
添加标题
体重组后转入细胞内进行扩增，并表达产生所需蛋白质的技术 • 基因工程的基本原理：基因重组、基因克隆等 • 基因工程的应用：医药、工业、农业等领域 • 基因工程的发展前景：随着技术的不断进步，基因工程将在未来发挥更加重要的作用
限制性核酸内切酶
作用：切割DNA分子，暴露 出黏性末端或平末端
分类：限制性内切酶和非限 制性内切酶
疫苗研发：利用基因工程技术生产 疫苗，如乙肝疫苗等。
在农业领域的应用
抗虫、抗病：通过基因工程培育出具有抗虫、抗病能力的农作物，提高农作物的抗病、抗 虫能力，减少农药使用量，降低环境污染。
抗逆性：通过基因工程培育出能够适应恶劣环境的农作物，提高农作物的抗逆性，从而增 加农作物的产量和品质。
转基因技术：将外源基因导入植物体内，产生具有特定性状的转基因植物，提高农作物的 产量和品质。
定义：能够识别DNA分子内 部的特异序列并准确切割的 酶
应用：在基因工程中用于切 割目的基因和控制其表达的
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使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的 基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必 需的双引物
目的基因
5
5
‘
变性
加热
‘
5 ‘
退火
5 ‘
5 聚合
‘ 5 ‘
5
‘ 变性
5 ‘
5 ‘
引物
5 ‘
底物
5 ‘
加热
5 ‘
5
‘
3
1
5 ‘
5
‘
2
退火 引物
5 ‘
5 5‘
‘ 聚合
5
‘ 5 退火
1.2 化学合成的单元操作
化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个 个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、 分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。
从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯 法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两 种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离 程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的
化学合成的单元操作
DMT O CH2 O G
HH
H
H
DMT： 二甲氧基三苯甲基
OH
Me O P
亚磷酰胺
Me
N
Me
CH CH
Me
Me
DMT O
激活
CH2 O G
H H
O
H H
H
四唑
Me O Me
PH N Me
CH CH
Me
Me
亚磷酰胺四唑活性中间体
脱取代基
氧化
缩合
碘液
脱保护基(一般对A、C碱基采用苯甲酰基保护；G 碱基用异丁酰基保护；T碱基不必保护；亚磷酸用 腈乙基保护)
一般来说，目的基因的克隆战略分为两利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然 后将之克隆表达。
目的基因设计需要考虑的问题
基因的长度及引物的设计
5’ A
A PCR扩增产物 5’
T7 lacZ MCS ori 5’
T
Apr T T 载体 5’
3 cDNA法
cDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA法分离目的基因的基本程序 cDNA法法克隆目的基因的局限性
cDNA法克隆目的基因的基本战略
cDNA第一链的合成
G 5‘ppp’5G G 5‘ppp’5G
限制性酶切位点的去处与添加 去除基因内部正反向重复序列 使用宿主偏爱的密码子 添加起始与终止密码子 添加表达所需特殊序列，如信号肽、调整阅 读框、核糖体结合位点等
目的基因制备方法
化学合成法 PCR法 cDNA法 鸟枪法
1 化学合成法
化学合成法的基本战略 化学合成的单元操作 DNA化学合成的用途
1.1 化学合成法的基本战略
连接臂
三氯乙酸 玻璃珠
1.3 DNA化学合成的用途
合成天然基因
如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素 基因等
修饰改造基因
如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等
设计新型基因 制备探针、引物、接头
2 PCR法 PCR法定向扩增目的基因的基本原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶 链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序
‘ 5 ‘
5 ‘
变性
5 ‘ 5
‘ 聚合
5 ‘ 5 ‘
5
5‘
底物 ‘
5
‘ 5
引物 ‘
5 ‘
5
加热
‘
5
5
‘
底物 ‘
5 ‘ 5
PCR克隆目的基因的基本程序
由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带 有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因 为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基 的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接 ，也可以使用专门的T载体克隆
第四章目的基因的制备连接导入与基因 的构建第一节 目的基因的制备
基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组 中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和 生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌 （细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回 细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。
设计的简并探针序列
C
T GATG G G T T
C
TGTATGGACGAIATGA
CGA
TGTATGGATGAIATGA
CGG
TGCATGGACGAIATGA
CGT
TGCATGGATGAIATGA
CGC
A
expressed sequence tag
G
此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计
生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针 探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间 探针内部不应出现可能的互补区域
探针等寡聚核苷酸合成
某段连续的氨基酸序列 CysMetAsp Glu Met Lys Arg Asn Ile
所有可能的DNA序列
TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA
1.1.2 探针等寡聚核苷酸合成
在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸 序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其 编码的DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到 的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子
由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时 必须考虑下列问题：
1.1.1 全基因合成
化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：
小片段粘接法：
根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段
混合退火
T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体
补钉延长法：
根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链 DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段
混合退火
Klenow酶聚合 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体
大片段酶促法：
根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段
混合退火
Klenow酶聚合 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体
上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就 愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合 成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片 段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95% 则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%
目的基因
5
5
‘
变性
加热
‘
5 ‘
退火
5 ‘
5 聚合
‘ 5 ‘
5
‘ 变性
5 ‘
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引物
5 ‘
底物
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加热
5 ‘
5
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3
1
5 ‘
5
‘
2
退火 引物
5 ‘
5 5‘
‘ 聚合
5
‘ 5 退火
1.2 化学合成的单元操作
化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个 个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、 分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。
从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯 法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两 种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离 程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的
化学合成的单元操作
DMT O CH2 O G
HH
H
H
DMT： 二甲氧基三苯甲基
OH
Me O P
亚磷酰胺
Me
N
Me
CH CH
Me
Me
DMT O
激活
CH2 O G
H H
O
H H
H
四唑
Me O Me
PH N Me
CH CH
Me
Me
亚磷酰胺四唑活性中间体
脱取代基
氧化
缩合
碘液
脱保护基(一般对A、C碱基采用苯甲酰基保护；G 碱基用异丁酰基保护；T碱基不必保护；亚磷酸用 腈乙基保护)
一般来说，目的基因的克隆战略分为两利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然 后将之克隆表达。
目的基因设计需要考虑的问题
基因的长度及引物的设计
5’ A
A PCR扩增产物 5’
T7 lacZ MCS ori 5’
T
Apr T T 载体 5’
3 cDNA法
cDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA法分离目的基因的基本程序 cDNA法法克隆目的基因的局限性
cDNA法克隆目的基因的基本战略
cDNA第一链的合成
G 5‘ppp’5G G 5‘ppp’5G
限制性酶切位点的去处与添加 去除基因内部正反向重复序列 使用宿主偏爱的密码子 添加起始与终止密码子 添加表达所需特殊序列，如信号肽、调整阅 读框、核糖体结合位点等
目的基因制备方法
化学合成法 PCR法 cDNA法 鸟枪法
1 化学合成法
化学合成法的基本战略 化学合成的单元操作 DNA化学合成的用途
1.1 化学合成法的基本战略
连接臂
三氯乙酸 玻璃珠
1.3 DNA化学合成的用途
合成天然基因
如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素 基因等
修饰改造基因
如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等
设计新型基因 制备探针、引物、接头
2 PCR法 PCR法定向扩增目的基因的基本原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶 链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序
‘ 5 ‘
5 ‘
变性
5 ‘ 5
‘ 聚合
5 ‘ 5 ‘
5
5‘
底物 ‘
5
‘ 5
引物 ‘
5 ‘
5
加热
‘
5
5
‘
底物 ‘
5 ‘ 5
PCR克隆目的基因的基本程序
由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带 有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因 为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基 的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接 ，也可以使用专门的T载体克隆
第四章目的基因的制备连接导入与基因 的构建第一节 目的基因的制备
基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组 中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和 生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌 （细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回 细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。
设计的简并探针序列
C
T GATG G G T T
C
TGTATGGACGAIATGA
CGA
TGTATGGATGAIATGA
CGG
TGCATGGACGAIATGA
CGT
TGCATGGATGAIATGA
CGC
A
expressed sequence tag
G
此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计
生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针 探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间 探针内部不应出现可能的互补区域
探针等寡聚核苷酸合成
某段连续的氨基酸序列 CysMetAsp Glu Met Lys Arg Asn Ile
所有可能的DNA序列
TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA
1.1.2 探针等寡聚核苷酸合成
在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸 序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其 编码的DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到 的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子
由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时 必须考虑下列问题：
1.1.1 全基因合成
化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：
小片段粘接法：
根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段
混合退火
T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体
补钉延长法：
根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链 DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段
混合退火
Klenow酶聚合 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体
大片段酶促法：
根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段
混合退火
Klenow酶聚合 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体
上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就 愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合 成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片 段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95% 则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%