宏基因组实验计划
宏基因组项目报告
宏基因组项目报告一、引言宏基因组研究是一种利用高通量测序技术对不同环境中微生物的DNA进行直接测序，从而获得未经培养的微生物群落的全基因组信息的研究方法。
宏基因组项目旨在揭示细菌、真菌等微生物群落的复杂性和多样性，以及它们在各种环境中的功能特征，为人类提供更多关于微生物界的了解和应用。
二、项目设计本次宏基因组项目选择了一个自然河流水样品和一个土壤样品作为研究对象，采用Illumina HiSeq平台进行测序。
首先，对样品进行DNA提取，并进行多次PCR扩增，得到足够的片段数目进行测序。
然后，对测序得到的片段进行质量控制和去除低质量序列、接头序列和宿主DNA。
之后，使用比对软件将高质量测序读序比对到相关数据库，如NR、Kegg等，分析序列的生物学功能、多样性等。
三、结果分析1.宏基因组的物种多样性分析通过序列比对和分类，我们发现水样品中含有大量的细菌，真菌和病毒等微生物，其中以细菌为主要成分。
而土壤样品中细菌的数量明显高于真菌和病毒。
此外，从解析结果中，我们还发现了一些未知物种，这些物种可能是新的微生物，为我们探索未知微生物的多样性提供了线索。
2.宏基因组的功能分析通过对序列的注释和比对，我们可以了解微生物群落的功能特征。
我们利用Kegg数据库进行宏基因组的功能注释和代谢通路分析，发现了许多参与碳、氮、磷循环等重要代谢通路的微生物，并对其基因编码产物进行分析和功能预测。
此外，我们还发现了一些与环境适应性和生存竞争力相关的基因。
3.宏基因组的群落结构分析通过对序列的分析，我们还可以了解微生物群落的结构特征。
我们使用OTU(Operational Taxonomic Unit)对宏基因组的群落结构进行了描述和分析，发现了丰度较高的菌群，并推断其在不同环境中的生态角色和相互之间的相互作用。
此外，通过构建菌群之间的共生和拮抗网络，我们可以了解不同微生物之间的互动关系，从而进一步探究宏基因组在生态系统中的功能和影响。
小鼠胰腺组织测序宏基因组
小鼠胰腺组织测序宏基因组
摘要：
一、背景介绍
二、实验方法
三、实验结果
四、结果分析
五、结论
正文：
一、背景介绍
近年来，随着生物信息学技术的不断发展，宏基因组学在研究生物系统中微生物群落结构及其功能方面取得了突破性进展。
本文以小鼠胰腺组织为研究对象，通过测序技术对宏基因组进行研究，旨在揭示胰腺组织中微生物群落的组成及其与宿主相互作用的机制。
二、实验方法
1.样本收集：从实验小鼠胰腺组织中提取微生物DNA。
2.宏基因组测序：采用Illumina HiSeq 平台进行微生物DNA 的测序。
3.数据分析：通过生物信息学方法对测序数据进行处理，包括序列拼接、质控、OTU 分析等。
4.功能注释：对差异丰度物种进行功能注释，揭示其在宿主生理功能中的作用。
三、实验结果
1.胰腺组织中检测到丰富的微生物多样性，包括细菌、古菌和真菌等。
2.实验组与对照组小鼠胰腺组织微生物群落结构存在显著差异，表明宿主生理状况对微生物群落有显著影响。
3.差异丰度物种的功能注释结果表明，微生物群落在胰腺组织的生理功能中发挥着重要作用，如能量代谢、免疫调控等。
四、结果分析
通过对小鼠胰腺组织宏基因组的测序和分析，揭示了微生物群落在胰腺组织中的重要作用。
这些发现为进一步研究宿主- 微生物相互作用及其在胰腺疾病中的作用提供了依据。
五、结论
本研究采用测序技术对小鼠胰腺组织宏基因组进行了研究，揭示了微生物群落在胰腺组织中的重要作用。
宏基因组学技术实验流程
宏基因组学技术实验流程
宏基因组学技术是将一个物种的细胞基因组测序后，利用生物信息学方法从测序结果中揭示细胞基因组结构、功能结构及动态变异的重要技术。
宏基因组学技术为广大生物学家开辟了一条全新的活跃的研究道路，丰富了多学科间的联系，有助于深入了解我们不同物种及地理环境间的关系。
宏基因组学技术实验流程主要包括以下几步：第一步，准备实验样本，利用细胞培养或蛋白质学实验制备实验样本；第二步，实行基因组测序，采用高通量测序技术进行基因组测序；第三步，数据分析，对测序结果进行深度分析，使用生物信息学工具分析表达水平、进化变异等；第四步，科学解释，将所得结果进行深入的科学解释，结合生物学原理和其它实验结果，揭示整个分析问题的本质和规律。
宏基因组学技术可广泛应用于多学科之间，特别是对大规模基因组技术的累积分析，能够更准确而精确地确定不同物种或地理环境间的变异和关联，为生物财主类的比较和研究提供了高学术价值的分子标记和高拆分率的研究方法，在现代生命科学研究过程中发挥着重要作用。
中国高校和高等教育机构在推广运用宏基因组学技术研究中可以充分发挥学术积极性和多学科跨界思维的特点，为进一步开拓和拓展现代生命科学研究打下坚实的基础。
宏基因组文库构建
宏基因组文库构建宏基因组文库构建分子微生物生态学的研究业已证明环境中大量存在未能培养的微生物，某些环境中采用现有培养技术能够培养的微生物不到1%，超过99%的微生物尚未能培养(1)，可见基于微生物分离培养的技术途径开发利用微生物资源受到了极大的限制。
为了突破上述限制，充分挖掘和利用微生物的多样性基因资源，人们在寻找新技术方法上倾注了极大的热情。
“宏基因组（Metagenome）”是由Handelsman等1998年提出的新名词，其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature”，即生境中全部微小生物遗传物质的总和，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和（2 ）。
宏基因组文库既包含了可培养的又包含了未能培养的微生物基因，避开了微生物分离培养的问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间。
目前已采用土壤、海水、海洋浮游生物、海棉、甲虫、人唾液等环境样品成功构建了宏基因组文库，已筛选到的生物活性物质有各种酶类及一些次生代谢产物，包括脂酶/酯酶、蛋白酶、淀粉酶、氧化酶、几丁质酶、核酸酶、膜蛋白、4-羟基丁酸代谢酶系、生物素合成酶系、色素、抗菌抗肿瘤活性物质及抗生素抗性基因等（3、4、5）。
一、实验原理1、基本原理从环境样品中直接提取总DNA，经纯化后部分酶切，然后把这些DNA片段连接到载体上，转化替代宿主细胞，形成一个重组DNA文库即宏基因组文库。
获得的克隆子根据宿主细胞获得的新功能进行筛选, 或用相关已知序列设计探针或PCR引物寻找并分离目的基因片段，加上表达调控元件后使目的基因表达，从而获得产物。
2、载体促使宏基因或基因簇在重组克隆子中表达或提高表达量，载体起着重要作用。
载体的选择主要是针对有利于感兴趣的目标产物基因的表达、目标基因的扩增及在筛选细胞毒类物质时表达量的调控等。
1）大片段插入载体由于很多微生物活性物质是其次生代谢产物，代谢途径由多基因簇调控，尽量插入大片段DNA以获得完整的代谢途径多基因簇是很有必要的。
小鼠肠道微生物宏基因组分析流程
揭开老鼠小肠微生物的秘密本身就是一场冒险！所有这一切都从收集一些老鼠的便便开始（是的，你读的对），开始到提取微生物DNA
的微弱。
我们用特别的药包将DNA从粪便样本中分离出来一旦我们得到了DNA，我们把它通过一些质量检查，以确保它为下一阶段——测序。
然后我们潜入一个激动人心的世界，准备DNA库，我们
把它分解成碎片，添加一些测序适配器，用一点PCR动作来推动它。
同样的，我们的DNA库都准备开始下一个冒险——在一个超级高科技的下一代评台上进行排序。
这就像发送我们的DNA库关闭一个令
人兴奋的滚球车的发现！
一旦测序完成，我们就会清理原始数据，以清除任何像低质量读取和
适配器序列这样的垃圾。
然后我们仔细看看好东西找出肠道里挂着的细菌我们还试图找出这些细菌可能做的什么工作比如破坏食物或制造维生素这可以让我们更好地了解肠道是如何运作的，以及它对我们
的健康会有什么影响。
对小鼠肠道微生物元素进行综合分析时遵循了一个结构化的工作流程，该流程通过样本收集、DNA提取、测序和生物法分析。
这一方法对于确定肠道微生物的准确位置和功能潜力至关重要，这反过来又为调查
微生物对健康和疾病的影响提供了宝贵的见解。
通过深入了解肠道微
生物的遗传位置，研究人员可以发现其对宿主新陈代谢，免疫功能和
整体福祉的影响。
这种办法符合战略方向和政策框架，以推动我们了
解微生物与宿主生理学之间的复杂关系，从而为公共卫生和生物医学研究方面的循证决策提供信息。
病原宏基因组测序实验方案
病原宏基因组测序实验方案
病原宏基因组测序实验方案是一种用于研究病原微生物群落内基因组的技术方法。
它通过测序病原体样本中的DNA或RNA，生成大量的测序数据，并利用生物信息学分析方法来解析样本中存在的病原体群落。
该实验方案的实施步骤如下：
1. 样品采集与制备：首先，需要从疾病患者或环境中收集病原体样品。
样品可
以是血液、组织、粪便等。
接下来，需要对样品进行处理，包括提取DNA或RNA，并进行质量检测。
2. 文库构建：经过样品制备后，将提取得到的DNA或RNA进行文库构建。
这一步骤包括DNA片段化、连接测序引物、PCR扩增等。
构建好的文库将被用于下
一步的测序。
3. 测序：使用高通量测序技术，如Illumina测序平台，对构建好的文库进行测序。
该步骤将产生数百万条短读长序列，形成所谓的测序数据。
4. 数据分析：测序完成后，需要对产生的测序数据进行生物信息学分析。
这一
步骤包括序列拼接、质控、去除人类宿主序列、物种注释等。
通过这些分析方法，可以得到病原体群落的基因组组成和功能特征。
5. 结果解释和研究：最后，根据数据分析结果，可以解释病原体群落的组成和
特征。
这对于研究病原体的致病机制、药物抗性等具有重要意义。
病原宏基因组测序实验方案为研究者提供了一种全面了解病原体群落结构和功
能的方法。
它可以用于研究不同疾病的病原微生物组成，探究其与疾病发生发展的关系，并为疾病的预防、诊断和治疗提供重要依据。
同时，这一技术方法也有助于了解病原体的毒力机制、耐药性乃至新病原体的发现。
宏基因组及其应用
宏基因组及其应用学习笔记吕涛15010906一、宏基因组及宏基因组学1.概念宏基因组( Metagenome)（也称微生物环境基因组Microbial EnvironmentalGenome, 或元基因组）是由Handelsman 等1998 年提出的新名词，其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature” , 即环境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
2.宏基因组学宏基因组( Metagenome)（也称微生物环境基因组Microbial EnvironmentalGenome, 或元基因组）是由Handelsman 等1998 年提出的新名词，其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature” , 即环境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
3.发展历程环境基因组学——微生物基因组学——宏基因组学——人类基因组学人类基因组学：把人体内所有微生物菌群基因组的总和称为“人体宏基因组”(humanmetagenome)。
人类宏基因组学(human metagenomics)研究人体宏基因组结构和功能、相互之间关系、作用规律和与疾病关系的学科。
它不仅要把总体基因组序列信息都测定出来，而且还要研究与人体发育和健康有关的基因功能。
人类宏基因组计划目标是：把人体内共生菌群的基因组序列信息都测定出来，而且要研究与人体发育和健康有关的基因功能。
4.研究步骤5.研究方法二、宏基因组学的应用1.水体宏基因组学●海表层水样为研究海洋生命的代谢潜力和海洋生态学提供了前所未有的原始素材；海洋蕴藏着巨大的生物多样性和复杂性，宏基因组学将极大地促进人们对他的认识。
宏基因组
一、宏基因组简介
1.产生背景
❖ 人类基因组计划(human genome project，HGP)的 完成，从结构基因组学进入以功能性基因组研究为 主的后基因组时代
❖ 人体的生理代谢和生长发育不仅受自身基因控制， 还与其他生物基因组相关。已证明体内菌群的组成 和活动与人的生长发育、生老病死息息相关。
❖ 优点：操作容易、成本低、DNA提取率高、重复性 好
❖ 缺点：纯度低，腐植酸等污染严重，还需要经过纯 化处理才能满足后续分子生物学操作的需要。此外， 由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小 (1—50 kb) )且多为平端，不利于建库。
（2）间接提取法
❖ 操作方法：采用物理方法将微生物细胞从环境中分 离出来，然后采用较温和的方法抽提DNA，如先采 用密度梯度离心分离微生物细胞，然后包埋在低熔 点琼脂糖中裂解，脉冲场凝胶电泳回收DNA。
❖ 要想了解生命的起源、本质、进化和相互作用及影 响，就必须对彼此密切相关的生物进行各个基因组 学及其相互关系的研究。
2.宏基因组（广义）
❖ 广义宏基因组是指特定环境下所有生物 遗传物质的总和，它决定了生物群体的 生命现象。它是以生态环境中全部DNA 作为研究对象，通过克隆、异源表达来 筛选有用基因及其产物，研究其功能和 彼此之间的关系和相互作用，并揭示其 规律的一门科学
10
λphage
24
Cosmid,fosmid 35~45
BAC
120~300
PAC
100~300
YAC
250~2000
MAC
>1000
Vector structure
Expresslion hosts
宏基因组测序
宏基因组测序1宏基因组研究概况宏基因组学（Metagenomics，又称元基因组学）这一概念最早在1998年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Handelsman等提出，随后伯克利分校的研究人员Kevin Chen和Lior Pachter将宏基因组定义为：应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落，而不需要在实验室中分离单一的菌株的科学。
鉴于环境中99%的微生物不可培养，宏基因组无需进行微生物分离操作的技术特点打破了传统微生物学基于纯培养研究的限制，为充分认识全球和人体范围内微生物和开发利用未培养微生物，并从完整的群落水平上研究微生物的活动和发掘潜在功能提供了可能。
传统的宏基因组学研究通过直接从环境样本中提取DNA，构建DNA克隆载体的宏基因组文库，并利用基于核酸序列差异分析、克隆子的特殊代谢活性、底物诱导基因的表达和（或）稳定同位素和荧光原位杂交等技术对宏基因组文库进行筛选和分析，从而有效地利用环境中丰富的微生物资源和挖掘新的特殊功能代谢物。
在宏基因组学研究的发展前沿中，核酸测序技术测序速度和通量的增长引人注目。
在下一代测序技术（NGS，又称第二代高通量测序技术）出现之前，基于宏基因组测序的核酸序列差异分析通常使用Sanger测序（主要基于双脱氧核苷酸链终止反应）方法，对宏基因组克隆文库或功能扩增子进行测序，来研究环境中微生物群落多样性及功能特征。
但Sanger测序方法通量较小、测序周期较长且价格昂贵。
随着新一代测序技术的迅猛发展以及广泛应用，宏基因组测序的方法也发生了翻天覆地的变化，目前科学家们可以对环境中的微生物全部基因组进行测序，在获得海量的数据后，全面地分析微生物群落结构以及基因功能组成，了解微生物如何耐受极端环境，发觉新的生物资源并探索微生物与环境间的相互作用。
下一代测序方法使用了几种不同的高通量平台，最先使用的是基于焦磷酸聚合酶乳液的RocheGS20 454测序仪（又称焦磷酸测序仪）。
宏基因组学测序解决方案
宏基因组学测序解决方案※ 概述宏基因组学（Metagenomics）是将环境样品中的微生物群落作为整体进行研究的学科。
与传统的微生物个体研究相比，宏基因组学的研究手段是直接从环境样品中提取基因组DNA后进行测序分析。
去年华大测序了124个欧洲人的肠道微生物群，通过基因组比对，GO分析等深入分析了肠道微生物对人体健康的重要作用，文章发表在Nature上。
基于此，我们推出宏基因组测序的完整解决方案，协助您一起探索生物奥秘。
※ 实验技术流程※ 生物信息分析策略※ 生物信息分析1、物种鉴定将所得序列（通常为16S/18S rRNA等兼具保守及高变特性的序列）与专业数据库（Silva、RDP等）进行比对，得出样品中所含物种的信息。
2、多样性统计学分析将所得序列（通常为16S/18S rRNA等兼具有保守及高变特性的序列）进行聚类，得到相应的OTUs（分类操作单元）。
通过统计学手段，分析出环境样品中的主要成分及不同样品间的明显差异因素。
结合物种鉴定，可以得到关键菌群。
3、宏基因组拼接对环境样品DNA进行大规模测序后，通过严格的拼接方式，可获得较长的DNA片段。
当样品的生物多样性较低，且达到一定测序通量后，很有可能直接获得一个或多个微生物基因组草图。
4、功能分析将所得序列与已有的数据库进行比对，进行基因功能的注释。
其中，常用的数据库包括NT、NR、GO、COG、KEGG、SEED、Swiss-Prot等。
5、微生物群落结构及功能通过大量测序，可以获得样品的群落结构信息，如微生物物种在该环境下的分布情况及成员间协作关系等。
通过实验还可以确定一些特殊的主要基因或DNA片段。
对于多个样品，还可做相应的比较分析，发掘样品间的相同点与不同点。
※ 参考文献1、Zehr JP, et al., Globally distributed uncultivated oceanic N2-fixing cyanobacteria lack oxygenic photosystem II[J]. Science, 2008, 322(5904):1110-11122、Qin J, et al., A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature, 2010, 464(7285):59-65.。
利用宏基因组技术筛选脂肪酶基因方法的研究与分析
利用宏基因组技术筛选脂肪酶基因方法的研究与分析一. 提取总DNA。
这一步可得到四组DNA，然后分别进行以后的实验。
1.提取土壤总DNA.我们先采集土壤样品，将其分A1,A2,A3,B1,B2,B3两组，A组直接提DNA，在B组土壤中加适量橄榄油、植物油及各种营养成分，搅拌后37℃培养一周后提DNA。
以达到富集和扩大基因总量的目的。
这两组分别进行一下两步实验。
运用改良的方法：取5 g过筛研磨过的土样，加入15 mL洗涤液洗涤土样，9 000 r/min离心10 min，去上清，反复洗涤3次;加入11．5 mL提取液和250μL溶菌酶，37℃下225 r/min 水浴30 min;加入50μL蛋白酶K，37℃下225 r/min水浴30 min;加入1．5 mLSDS，65℃下225 r/min水浴2 h;4 000 r/min离心10 min;取上清，加入等体积氯仿，异戊醇抽提(9 000 r/min 离心10 min)3次;取上清，加入1 /1预冷无水乙醇，－20℃沉淀30 min;9 000 r/min离心10 min，加入1 mL蒸馏水溶解沉淀，4℃保存．2.提取污水总DNA.同样，我们先采集污水及少量污泥样品，将其分为C1，C2，C3, D1，D2, D3两组，C组直接提DNA，在D组中倒入橄榄油、植物油及各种营养成分并培养。
这两组分别进行一下两步实验。
本实验用低熔点琼脂糖包埋法提取水样的宏基因组大片段DNA，得到的片段长度在48Kb以上。
由于单一包埋块中基因组DNA含量较低，因此多个琼脂糖包埋块一起用酶法纯化后浓缩以达到提高基因组DNA的浓度。
为了满足建库要求，以后用吹打法对其进行了小片段化。
样品基因组DNA的提取在CTAB-NaCl基础上稍作修改。
（1）取样品1ml于1.5ml离心管，12，000rpm离心5min弃上清，重复该操作3次；（2）加入567μlTE，用吸管反复吹打使菌体重悬；（3）加30μl10%SDS和3μl 20mg/ml蛋白酶K，用旋涡振荡仪混匀，37℃温浴60min；（4）加100μl 5mol/L NaCl充分混匀，再加入80μl的5%CTAB/NaCl溶液，混合并置65℃温浴30min；（5）加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀。
宏基因组分析方案_微基生物
宏基因组的测定流程
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宏基因组测序及分析
宏基因组测序及分析在样品收集和处理阶段，我们需要根据研究目的选择合适的样品类型，并进行必要的处理，如过滤、离心等，以去除样品中的杂质。
DNA提取是宏基因组测序的关键步骤之一，它是将微生物样品中的DNA提取出来。
有许多不同的DNA提取方法，包括机械破碎法、化学溶解法等。
选择合适的提取方法能够最大限度地提取到目标微生物的DNA，并减少宿主DNA的污染。
测序样本库制备是为了将DNA样品转化为高通量测序所需的文库，并对其进行放大、纯化等步骤。
根据实验要求，我们可以选择不同的文库构建方法，如16SrRNA基因文库、全基因组文库等。
DNA测序是宏基因组测序中的关键一步，它使用高通量测序平台（如Illumina MiSeq、Ion Torrent等）对文库进行测序。
这些平台能够同时测序多个样品，从而减少了测序时间和成本。
数据分析是宏基因组测序的核心步骤，它包括对测序数据进行质量控制、数据过滤、序列比对、OTU聚类（操作税的单元，Operational Taxonomic Unit）等分析。
通过这些分析，我们可以了解样品中微生物的群体结构、物种多样性及其功能。
宏基因组测序及分析在许多领域都有广泛的应用。
例如，在环境科学中，它可以用于研究土壤中微生物的功能，揭示微生物对土壤质量和养分循环的贡献；在医学领域，它可以研究肠道微生物群落与人类健康之间的关系，为疾病的诊断和治疗提供新的思路。
总之，宏基因组测序及分析为我们认识微生物世界提供了全新的视角，通过揭示微生物群体的组成和功能，帮助我们更好地理解生态系统的结构和功能。
随着测序技术的不断发展，相信它将在更多的领域中发挥重要作用。
宏基因组实验流程
宏基因组实验流程一、样本采集。
这宏基因组实验，第一步就是样本采集啦。
这采集样本就像去寻宝一样，要特别小心谨慎。
咱得根据研究目的来选择采集的样本类型哦。
比如说，如果想研究土壤里的微生物群落，那就要去合适的地方挖土。
这个地方可不能随便选，要考虑土壤的类型、周围的环境之类的。
要是研究人体肠道微生物呢，那就得找志愿者啦，用专门的采样工具从肠道里采集样本。
采集的时候一定要保证样本的质量，就像挑水果一样，得挑那种新鲜又能代表整体情况的。
要是样本采得不好，后面的实验可就全白搭喽。
二、样本处理。
样本采好后就进入处理阶段啦。
对于土壤样本，里面可能有很多杂质，像小石子啊、植物残渣啥的。
这时候就得想办法把这些杂质去掉，不然会干扰实验结果。
就像淘米一样，把脏东西淘出去，只留下咱们想要的东西。
对于生物样本，可能还需要进行一些特殊的处理，比如说破碎细胞，把细胞里的DNA释放出来。
这就像是打开宝藏的盒子，把里面的宝贝拿出来一样。
不过这个过程要很轻柔，不能把DNA弄坏啦，DNA 可是很脆弱的呢，就像小玻璃球一样，一不小心就碎了。
三、DNA提取。
接下来就是DNA提取啦。
这可是个关键步骤哦。
有好多方法可以提取DNA呢，就像有好多条路都能到达目的地一样。
但是不管用哪种方法，目的都是要得到高质量、高纯度的DNA。
提取出来的DNA要足够多，这样才能满足后面实验的需求。
而且要保证没有其他杂质，要是有杂质混在里面，就像在白米饭里混进了沙子，那可不行。
这个过程就像是从矿石里提炼黄金一样，要把最纯的DNA提炼出来。
四、宏基因组文库构建。
有了DNA之后，就要构建宏基因组文库啦。
这就像是给DNA建一个小房子，让它们都住进去。
在这个过程中，要把DNA进行一些加工，比如说把它切成合适的片段，然后再把这些片段连接到一些载体上。
这个载体就像一辆小车子，带着DNA片段到处跑。
构建文库的时候要特别注意各个环节的准确性，要是哪个地方出了错，就像搭积木搭歪了一样，整个文库可能就构建不好了。
宏基因组
环境保护和污染修复
挖掘降解基因和功能菌株，进行生物修复 获取任何序列的基因或功能，由此合成新物质或发 现新的生物物种。 发掘极端环境为生物的新物种，了解其耐受机制， 帮助极端环境的污染修复。 从宏基因组中分离的重要基因元件组编成具有其他 活性成分、或可降解污染物功能的基因簇，以替代 原有不易降解化合物，或直接降解环境中石油烃、 有害有害化合物、重金属。
宏基因组的研究步骤
分离特定环境生物DNA 纯化大分子量DNA进行克隆 将带有宏基因组DNA的载体通过转化方式转 入模式ronment samples
Enrichment Cultivation
DNA isolation( in-situ and ex-situ lysis) Small size (plasmid) Vectors ligation Large size (Cosmid,Fosmid, BAC,YAC)
底物诱导基因表达筛选 (substrate-induced gene-expression screening ， SIGEX) 缺点：
目标基因的结构性和适应性很敏感， 无法用于分析不能进入细胞质的底物， FACS对进样设备的要求也比较高； 代谢特定底物的调控子和操纵子在位置上不一定都 相邻； 有些基因的表达除了受底物诱导外，还可能受其他 因子的诱导， 有些基因并不需要诱导，是本底水平表达的， 有些可诱导基因在新的宿主中有可能不可被诱导表 达
底物诱导基因表达筛选 (substrate-induced gene-expression screening，SIGEX)
优点： 提供了一个有效的和经济的检测手段 增加了筛选的容量和效率 节省了时间 为高通量筛选提供了保障 不需要对在颜色筛选中使用的底物进行修改，勿需担心 因修改底物而产生毒性 可以从底物来推断得出未知的酶，继而推断基因的功能 尤其适合在工业上使用
宏基因组学的研究
宏基因组学的研究宏基因组学研究的主要目标之一是通过对微生物基因组的整体分析来了解不同环境条件下微生物的多样性和功能。
微生物在环境中扮演着重要的角色，包括环境维持、能量转化、物质循环等。
传统的基因组学研究主要关注微生物的培养菌株，但是只有很小一部分微生物能够被培养出来。
然而，宏基因组学通过直接从环境样品中提取DNA来研究微生物群落，不需要进行培养过程。
这种方法可以更全面地了解微生物世界的多样性。
宏基因组学研究的另一个重要方面是揭示微生物之间的相互作用。
微生物群落中的微生物之间存在着复杂的相互作用关系，包括共生、竞争、共存等。
通过宏基因组学方法，可以了解微生物之间的相互作用模式，进而理解微生物在生态系统中的功能和生态角色。
为了开展宏基因组学研究，研究人员需要进行一系列的实验和分析步骤。
首先，需收集环境样品，例如土壤样品、水样或生物体表面样品。
然后，通过提取DNA，获得微生物基因组的整体信息。
随后，通过高通量测序技术对获取的DNA进行测序，得到大量的序列信息。
最后，通过计算机分析这些序列信息，包括序列组装、比对和功能注释等，以获得微生物基因组的主要信息。
宏基因组学研究在环境科学、生态学和生物技术领域具有广泛的应用。
首先，它可以用于快速鉴定环境样品中的微生物，从而为环境监测和生物资源开发提供支持。
其次，宏基因组学可以揭示微生物在特定环境中的功能，例如植物和土壤中的微生物群落对植物生长具有重要的调节作用。
此外，它还可以用于微生物组学的研究，例如人体肠道菌群的研究，可以帮助理解人体健康和疾病的发生机制。
总之，宏基因组学是一门重要的研究领域，通过揭示微生物基因组的整体信息和微生物之间的相互作用关系，可以更全面地了解微生物的多样性和功能。
它在环境科学、生态学和生物技术领域具有广泛的应用前景，对于解决环境问题和改善生物资源利用具有重要意义。
随着技术的发展和研究的深入，宏基因组学必将在未来的研究中发挥更大的作用。
小鼠测宏基因组每组3只的文献
小鼠测宏基因组每组3只的文献摘要：1.研究背景及目的2.实验方法2.1 小鼠选取与分组2.2 宏观基因组测序2.3 数据分析与生物信息学处理3.结果与分析3.1 宏观基因组特征3.2 基因功能注释3.3 物种间基因保守性分析4.结论与展望正文：随着生物科技的发展，宏观基因组研究已成为探索生物进化、基因功能及遗传变异等领域的重要手段。
本文旨在通过小鼠测宏观基因组，探讨其基因组特征及与其它物种间的基因保守性，从而为相关领域的研究提供理论依据。
本研究共选取了3组小鼠进行宏观基因组测序，每组3只。
实验方法如下：1.小鼠选取与分组：在实验开始前，对小鼠进行遗传背景调查，确保实验小鼠具有较高的同源性。
然后将小鼠分为3组，每组3只，分别进行宏观基因组测序。
2.宏观基因组测序：采用Illumina HiSeq平台对3组小鼠的基因组进行测序，获得原始测序数据。
3.数据分析与生物信息学处理：对原始测序数据进行质量控制、比对、基因预测等生物信息学分析，以获取小鼠基因组的详细信息。
结果与分析：1.宏观基因组特征：经过生物信息学处理，获得了小鼠宏观基因组的详细数据。
分析结果显示，小鼠基因组大小约为2.6亿个碱基对，基因组覆盖率超过95%，表明测序数据质量较高。
2.基因功能注释：对预测到的基因进行功能注释，发现小鼠基因组中富含多种生物学功能的基因，如代谢酶、转录因子等。
这些基因为进一步研究小鼠的生物学特征提供了重要依据。
3.物种间基因保守性分析：将小鼠基因组与已知的其它哺乳动物基因组进行比对，发现小鼠与人类、大鼠等哺乳动物具有一定的基因保守性。
这为进一步研究小鼠在生物进化中的地位提供了线索。
结论与展望：本研究通过小鼠测宏观基因组，揭示了其基因组特征及与其它物种间的基因保守性。
这些研究成果为小鼠作为模式生物在遗传、生理、疾病等方面的研究提供了有力支持。
超大规模宏基因组学研究思路
超大规模宏基因组学研究思路导读微生物是人体的重要组成部分，人体微生物的基因数目远远超过人体自身基因数。
其中，肠道微生物是人体微生物组的主体，口腔、皮肤、阴道微生物均为人体微生物组的重要组成部分。
有研究表明，人体不同部位的微生物组成更是存在很大差异1。
人类基因组计划完成之后，人体微生物组研究逐渐提上日程：美国国立卫生研究院于2007年底启动人体微生物组计划（Human Microbiome Project, HMP）旨在通过对人体微生物遗传和代谢的整体研究，了解人体微生物组；紧随其后，欧盟于2008年初启动人体肠道宏基因组学计划（Metagenomics of the Human Intestinal Tract, MetaHIT），旨在通过对比疾病人群，解析人体微生物与健康或疾病的关系，促进人类健康。
由于微生物在代谢及免疫调节等方面的重要作用，与人体健康密切相关。
所以，近年来，微生物研究也已成为各大科研机构的研究热点，微生物相关产品和应用更是层出不穷。
以微生物为研究对象的宏基因组学研究也变得火热起来。
加上，近年来，高通量测序技术的快速发展，使得测序成本大大降低，大规模宏基因组研究更是得以迅速开展。
作为宏基因组研究的重要工具，宏基因组鸟枪法测序技术使我们能够从基因水平、物种水平、功能水平全方位刻画微生物组；宏基因组关联分析作为宏基因组研究的一种重要分析方法，其探究微生物与多种复杂疾病如2型糖尿病、肥胖等的关系，也为疾病预防、诊断、治疗提供了新的思路。
本次特别邀请了深圳华大生命科学研究院宏基因组研究所的研究团队，结合宏基因组已有研究基础与当前宏基因组关联分析的进展，对大规模宏基因组研究思路作一总结和概述。
16s rRNA基因扩增子测序与宏基因组鸟枪法测序不同于单一物种的基因组研究，宏基因组研究以环境样品中全部微生物基因组为研究对象，其丰富的物种多样性成为宏基因组研究的难点。
16S rRNA基因扩增子测序方法以分类学标记基因为基础，能够鉴定样品中存在的微生物种类，研究微生物与疾病之间的关系。
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宏基因组学方法研究明永冰川的初步实验计划
起草人：李浩宇
宏基因组学研究方向及意义
研究：环境胁迫对集体遗传变异的过程和机理。
发掘：环境应激和应答基因的多态性。
探究：多态性基因的功能。
实验大体步骤：
I.环境样品的采集：
1）避免人源污染，采样的器具都要高温灭菌，采样过程中要戴手套。
2）样品的迅速处理保存。
有条件最好用液氮冷冻运输，没有条件可以将装有样品的容器至于干冰泡沫箱中。
带回实验室之后要尽快处理，特别是固体样品，迅速用预冷缓冲液(多为PBS)重悬，离心收集沉淀。
分装成小份，冻存于液氮或者‐80 ℃冰箱中，避免反复冻融。
3）如果后续用间接法提取总DNA 的话，此处需要收集菌体，采取的策略是稀释之后的差速离心，一般适用于水样。
II.DNA提取方法的选择：
总DNA 的提取按照处理样品方式的不同划分为直接提取法和间接提取法。
直接提取法就是直接对样品进行裂解，释放其中的DNA。
间接提取法则是先分离样品中的微生物，后对微生物进行裂解。
两种方法的适用范围不同，各自都有优缺点。
直接提取法的优缺点：直接提取法多用在提取固体样品(如土壤、污泥、湖泊沉积物等) 总DNA 的试验中。
其最大的优点在于得率高，在某些环境样品总DNA 提取实例中，比间接提取法高数倍至数百倍。
造成这种情况的最主要原因一是环境样品中存在丰富的胞外DNA；二是许多微生物与基质形成复杂的结构，间接提取法不易对其进行分离。
在样品较珍贵时多采用此法。
其缺点同样明显，所得DNA 的纯度远不及间接提取法所得，基质中含的腐殖质一并被保留下来，使得所得DNA 呈现黄褐色甚至黑色。
可以考虑MoBio 和Epicentre的DNA提取的商业试剂盒(主要用于提取土壤样品)。
间接提取法的优缺点：间接提取法则既可以用来提取固相样品总DNA 也可以用来提取液体样品总DNA。
在提取液体样品(如海水、河流等样品)总DNA 时，需要用抽滤的方式浓缩。
与直接提取法刚好相反，其最大的优点在于提取DNA 纯度高，既使在提取固体样品微生物总DNA 时，也可以用缓冲液对收集的菌体进行反复冲洗以去除表面所带杂质。
其缺点是DNA 得率低。
土壤DNA 直接提取法：
(1) 从超低温冰箱中取出保存样品(5 g)；
(2) 于室温融化；
(3) 加入13.5 ml CTAB 抽提缓冲液和50 μl 蛋白酶K 贮存液；
(4) 离心管于37oC 225 rpm 水平振荡30 min；
(5) 加入1.5 mL20%SDS；
(6) 65oC 水浴2 h，每隔15 min 轻轻颠倒数次；
(7) 室温6,000g 离心10 min，收集上清液，转移至一个新的50 ml 离心管中；
(8) 沉淀中再加入4.5 ml 提取液和0.5 ml 20%SDS，轻轻涡旋至混匀；
(9) 浸入液氮中冷冻3 min 后，于沸水中煮沸3 min；
(10) 室温6,000g 离心10 min，收集上清液，与上次上清液合并；
(11) 重复(8)、(9)、(10)一次；
(12) 将三次提取所获上清液与等体积的苯酚：氯仿(1:1 v/v) 混合，摇匀后于4 ℃12,000g 离心10 min；
(13) 将上层水相转移至一新的50 ml 离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，混匀后于4 ℃12,000g 离心10 min；
(14) 再次转移上清至一新的离心管中，加入0.6 倍体积的异丙醇于室温沉淀1 h；
(15) 室温12,000g 离心20 min；
(16) 收集沉淀，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀；
(17) 向离心管中加入1 ml TE，于4 ℃放置过夜，分装保存于‐20 ℃。
实验过程中的注意事项及一些技巧：
(1) 整个提取过程吹吸动作要轻柔，避免剧烈震荡(试剂盒提取除外)。
(2) 用到的枪头在灭菌之前最好将头部剪掉，避免机械剪切。
(3)酚氯仿抽提时，中间相一定不要吸到，宁可多丢弃一些。
(4) 异丙醇沉淀时不要放在低温，0.7 倍体积室温沉淀足够了。
(5) DNA 溶解时可以放在4℃静置过夜，次日离心取上清去除多余杂质。
(6) 水平震荡可以用左右摇晃的震荡器。
水样DNA 间接提取法：
(1)抽滤的方式浓缩采集到的水样。
(2)采取差速离心取得水样中的菌体。
(3)取得微生物后进行裂解提取。
此方法还在查证中，具体前期对样品的处理方法还在整理中。
例如：用多少的水样进行浓缩，差速离心的转速选择。
会不会有DNA的丢失等等。
Epicentre推出了宏基因组DNA分离试剂盒（Metagenomic DNA Isolation Kit for Water）,能从水样中分离已随机剪切的，可直接用于fosmid克隆的DNA片段。
此试剂盒能从水样中的培养或未培养微生物（包括革兰氏阳性菌）中提取40kb大小的DNA。
提取的DNA可立即进行末端修复，并在乙醇沉淀洗涤后克隆到Epicentre的PCC1FOS 载体上。
优势：
1.无需化学剪切，琼脂糖块或大小选择。
2.无需纯化柱或酚/氯仿提取。
3.产量更高，从低丰度的微生物中回收DNA的概率更大。
4.Fosmid载体与DNA的克隆只需要90分钟。
下图为方法与流程：
粗提DNA 的纯化
采用直接提取法提取的总DNA 或多或少都含有腐殖质的存在。
它的存在对后续的分子生物学操作会有影响，时常会导致PCR 扩增不出来，酶切困难，连接转化率低。
需要进行纯化。
纯化的方法包括：胶回收，柱纯化，电泳/电洗脱，梯度离心。
a 胶回收
胶回收最大的优点在于快捷，可以在很短的时间内完成。
纯化后的DNA 往往能够满足PCR 要求。
但其缺点在于，膜截留式的纯化方式难免会对DNA 分子造成机械损伤，使得DNA 弥散，完整度下降。
如果后续的实验室分析16S r DNA，则这种纯化方式不失为一种好方法。
b 柱纯化
柱纯化相对于胶回收来说更为快速，十几分钟内可完成。
与胶回收相比，其纯化效果要差一些。
但通常情况下，纯化之后的DNA 也能够满足PCR 需求。
这种方法也会造成DNA 分子的机械损伤，使得DNA 弥散，完整度下降。
c 电泳/电洗脱
电泳/电洗脱法相对于前两种有很多优点：其一，其价格低；其二，整个过程都很温和，能够保证DNA 的完整性；其三，纯化后的DNA 纯度较之前两种要好一些。
但是其亦有些许不便：其一，过程耗时长，包括透析袋的准备，电洗脱，洗脱液的浓缩等；其二，DNA 损失量较前两种大，透析袋上会残留DNA。
如果样品不是很珍贵，并且后续要进行Metagenomic 研究，这种方法不失为一种好方法。
如果有脉冲场凝胶电泳系统，用此方法可以得到高纯大片段DNA，可以满足后续的metagenomic C/Fosmid 文库构建。
d 蔗糖/氯化铯密度梯度离心
如果实验室有超速离心机(100,000g 以上)，那么这种方法无疑也是一种好方法。
与电泳电洗脱法相同，这种方法在连续介质中对DNA 及杂质进行分离，可以很好的纯化DNA。
纯化得到的DNA 经过低熔点凝胶电泳切胶回收，可以得到高纯度大片段的DNA，可以满足后续的metagenomic C/Fosmid 文库构建。
纯化质量的检测
DNA 纯化完毕之后往往需要对纯化效果做一个初步的判断，主要包括两方面：其一，完整度判断；其二，纯度判断。
a 完整度判断
完整度判断同前所述，千万要记得的是加纯化之前的DNA 样品做对照。
结果可以告诉我们纯化得率及完整度。
同样，最好能跑脉冲场凝胶电泳。
b 纯度判断
纯度判断通常可以采用两种方法：分光光度计法和PCR 扩增法。
分光光度计可以测定双链DNA 在260nm 处的吸收值及杂质在其他波长的吸收值。
通过不同波长吸收值的比，可以对DNA 纯度做出判定。
通常这种方法由于灵敏性较高，所以在存在杂质时误差较大。
III. 所提DNA 完整性检测
DNA 的完整性主要采用普通琼脂糖凝胶电泳进行指示。
最好采用0.8% 琼脂糖凝胶电泳，低电压长时间跑。
至少要用lambda DNA/Hind III 做marker，如果在23 kb 处有一条完整或略拖尾的带，则证明DNA 完整性尚好。
如有条件，可以采用脉冲场凝胶电泳对提取DNA 的完整度进行分析。
用脉冲场凝胶电泳分析时，除了上面提及的那个maker，至少还应该有完整lambda DNA (约48 kb)充当另一个maker。
以上为送测序前样品的采集，DNA的提取，验证等前期处理与方法的大致步骤与方法。
Illumina所进行的测序是由Genome Analyzer测序仪所完成的：
以上为Genome Analyzer技术的基本原理IV.在DNA提取，检验完成后送BGI进行后续测序。