宏基因组测序讲解
完整版)宏基因组测序讲解
完整版)宏基因组测序讲解宏基因组测序的目的是研究藻类物种的分类、与特定环境相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部、微生物与环境以及与宿主的关系。
宏基因组，也称为微生物环境基因组或元基因组，是由Handelsman等于1998年提出的新名词。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
宏基因组学是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的微生物研究方法。
它通过功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及与环境之间的关系为研究目的。
一般XXX包括从环境样品中提取基因组DNA，进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组文库是一种重要的研究工具，可以利用转入大肠杆菌中的宏基因组DNA载体，使以前无法研究的不可培养微生物的DNA得到复制、表达，从而进行研究。
所有带有宏基因组DNA载体的模式微生物克隆构成宏基因组文库。
对于宏基因组文库的DNA进行分析，有很多分析方法，主要分为表型功能筛选和序列基因型分析两类。
表型功能筛选是利用模式微生物表型的变化筛选某些目的基因，例如从文库中筛选能表达抗菌物质的克隆。
而序列基因型分析则是对文库中所有或部分的DNA进行测序分析，以应用于生态学研究，例如分析文库中16SrRNA序列，对所研究生态环境的多样性进行评估。
一个典型的宏基因组分析涉及多个轮次，以确保从生态环境标本中分离到目的基因，并尽可能多地分析DNA序列所编码的信息。
XXX是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的新的微生物研究方法。
它主要通过功能基因筛选和测序分析来研究微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系。
在宏基因组学研究中，样品总DNA的提取及基因或基因组DNA的富集是非常关键的步骤。
提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。
宏基因组学
广义的宏基因组：特定环境下所有生物遗传物质的总和 狭义的宏基因组：特定环境样品中细菌和真菌的基因组总和
宏基因组测序（Metagenomics Next Generation Sequencing,mNGS)
NGS:也称高通量测序，是一种可以同时对数十万到数百万条DNA分子序列进行读取的测序技术。 mNGS:m指宏基因组。mNGS指宏基因组二代测序，以特定环境中整个微生物群落作为研究对象，利 用高通量测序平台进行基因组DNA测序，DNA不需要进行PCR扩增，测序结果具有较好的无偏性， 不仅可以提示微生物群落的物种组成，更能获需段序列分析不依赖 于任何已知序列信息进行筛选。其中以功能筛选法最为常用。
能够直接发现全新的活性物质和功能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子 缺陷：
工作量大,效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。
谢谢！请大家批评指正
其前端关键性技术是环境DNA(e DNA)的提取A的提取
直接提取法（原位提取法） 不经过样品中微生物的培养和分离，通过化学法、酶解法或物理法直接破碎环境中的微生物细胞而使DNA得以释 放，并对DNA进行纯化。 操作简便、省时、成本低，所获得DNA具有较好的完整性，并能够代表某一生境的微生物群落多样性。 但常会出现细胞裂解不完全或DNA与土壤杂质成分产生共沉淀而无法有效地去除等问题，所以一般需要进一步的 DNA纯化处理，同时所提取获得的DNA片段较用离心介质或者梯度离心等方法先把微生物从环境样品中分离出来，再按处理纯培养细胞的方法裂解微生物 细胞提取DNA。 该法获得的宏基因组DNA受到胞外杂质污染干扰较少，纯度较高、DNA完整性好(20kb~大、DNA得率较低，其产率只是直接裂解法的1%~10%,且获得的DNA往 往不能完全代表样品所在生境的生态学多样性。
小鼠胰腺组织测序宏基因组
小鼠胰腺组织测序宏基因组
摘要：
一、背景介绍
二、实验方法
三、实验结果
四、结果分析
五、结论
正文：
一、背景介绍
近年来，随着生物信息学技术的不断发展，宏基因组学在研究生物系统中微生物群落结构及其功能方面取得了突破性进展。
本文以小鼠胰腺组织为研究对象，通过测序技术对宏基因组进行研究，旨在揭示胰腺组织中微生物群落的组成及其与宿主相互作用的机制。
二、实验方法
1.样本收集：从实验小鼠胰腺组织中提取微生物DNA。
2.宏基因组测序：采用Illumina HiSeq 平台进行微生物DNA 的测序。
3.数据分析：通过生物信息学方法对测序数据进行处理，包括序列拼接、质控、OTU 分析等。
4.功能注释：对差异丰度物种进行功能注释，揭示其在宿主生理功能中的作用。
三、实验结果
1.胰腺组织中检测到丰富的微生物多样性，包括细菌、古菌和真菌等。
2.实验组与对照组小鼠胰腺组织微生物群落结构存在显著差异，表明宿主生理状况对微生物群落有显著影响。
3.差异丰度物种的功能注释结果表明，微生物群落在胰腺组织的生理功能中发挥着重要作用，如能量代谢、免疫调控等。
四、结果分析
通过对小鼠胰腺组织宏基因组的测序和分析，揭示了微生物群落在胰腺组织中的重要作用。
这些发现为进一步研究宿主- 微生物相互作用及其在胰腺疾病中的作用提供了依据。
五、结论
本研究采用测序技术对小鼠胰腺组织宏基因组进行了研究，揭示了微生物群落在胰腺组织中的重要作用。
(完整版)宏基因组测序讲解
宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。
技术简介宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
宏基因组二代测序流程
宏基因组二代测序流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测方法宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16sDNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA 测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
宏基因组测序介绍
宏基因组测序介绍
宏基因组测序（Metagenomics Sequencing）又称为环境基因组测序，是一种对复杂环境中所有微生物生物群体的遗传信息进行分析的高通量测序技术。
与传统分离培养方式不同，宏基因组测序可以直接提取环境样品中所有微生物的总DNA，并通过测序技术进行分析，从而得到环境样品中所有微生物群体的遗传信息。
宏基因组测序的优点是高通量、快速、高效、无偏差、不需要微生物分离和培养，可以对满足各种环境条件的微生物进行整体性的研究，从而更加真实地反映生物在环境中的生态学特征，为生态学、环境保护等领域的研究提供了数据支持。
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
宏基因组测序及分析
12
大大纲
什么是宏基因组研究 宏基因组研究的分析流程 宏基因组研究的相关应用
13
研究案例（一一）
Science：牛牛胃中微生生物酶可用用于开发生生物燃料
背景：纤维素是自自然界中最丰富的碳水水 化合物资源。牛牛在反刍过程中涉及到纤 维素的分解，研究牛牛的消化机制，有利 于寻找应用用于生生产生生物燃料的酶。
• EMP
• Earth Microbiome Project • 地球微生生物计划
4
宏基因组研究的分析流程
提取环境样本DNA 获取测序数据
生生物信息学分析
5
提取环境样本DNA
宏基因组测序:
• 浓度≥50ng/ul;
PowerWater® DNA Isolation Kit
• OD260/280:1.8-2.0;
量测序来研究样品中的微生生物组成及群落功能。
3
宏基因组研究热点
MetaHIT
• Metagenomics of Human Intestinal Tract • 人人类肠道宏基因组计划
• HMP
• Human Microbiome Project • 人人类微生生物组计划
• GOS
• Global Ocean Sampling expedition • 全球海洋调查
背景：反刍动物排 放的CH4 是温室气气 体的重要来源之一一
羊羊排放的甲烷气气体 量存在差异性
应用宏基因组与宏 转录组测序发现两 组之间是否存在差18
究思路
样本收集：
4 highest, 4 lowest, and 2 intermediate CH4 yields two separate times (20 samples total)
病原宏基因组测序实验方案
病原宏基因组测序实验方案
病原宏基因组测序实验方案是一种用于研究病原微生物群落内基因组的技术方法。
它通过测序病原体样本中的DNA或RNA，生成大量的测序数据，并利用生物信息学分析方法来解析样本中存在的病原体群落。
该实验方案的实施步骤如下：
1. 样品采集与制备：首先，需要从疾病患者或环境中收集病原体样品。
样品可
以是血液、组织、粪便等。
接下来，需要对样品进行处理，包括提取DNA或RNA，并进行质量检测。
2. 文库构建：经过样品制备后，将提取得到的DNA或RNA进行文库构建。
这一步骤包括DNA片段化、连接测序引物、PCR扩增等。
构建好的文库将被用于下
一步的测序。
3. 测序：使用高通量测序技术，如Illumina测序平台，对构建好的文库进行测序。
该步骤将产生数百万条短读长序列，形成所谓的测序数据。
4. 数据分析：测序完成后，需要对产生的测序数据进行生物信息学分析。
这一
步骤包括序列拼接、质控、去除人类宿主序列、物种注释等。
通过这些分析方法，可以得到病原体群落的基因组组成和功能特征。
5. 结果解释和研究：最后，根据数据分析结果，可以解释病原体群落的组成和
特征。
这对于研究病原体的致病机制、药物抗性等具有重要意义。
病原宏基因组测序实验方案为研究者提供了一种全面了解病原体群落结构和功
能的方法。
它可以用于研究不同疾病的病原微生物组成，探究其与疾病发生发展的关系，并为疾病的预防、诊断和治疗提供重要依据。
同时，这一技术方法也有助于了解病原体的毒力机制、耐药性乃至新病原体的发现。
病毒宏基因组测序
40
Eukaryotic DNA viruses
No. of samples
30
20
10
0
Unclass. ABneeAtallloptovhriarqiGtduoaaermeqviumrueCUasviMtrinrocucaorlssqvatuisarseud.vseCinriurocsvoivruiBrBsaiedbgaueoUvminruocGslvaMyiUsrrusoan.ssvcPtilrroaNueslvsyasion.ruGmosveaimBrvuoiirsncidaivapierairdvaoevirus
病毒宏基因组测序又称宏病毒组（Virome），是在宏基因组学理论的基础上，结合现有的病毒分子生物学检测技术而兴起的一个新的学科分支。宏
病毒组直接以环境中所有病毒的遗传物质为研究对象，能够快速准确的鉴定出环境中所有的病毒组成，在病毒发现、病毒溯源、微生物预警等研究方面具 测序策略与深度
分析内容
项目周期
病毒宏基因组测序
自然群体
DNA/cDNA总量≥3ug，浓度≥50ng/ul，无降解，无粘稠、无颜色异常，无RNA/蛋白质污染； 干冰寄送，使用无DNase管子存放，标记清晰。
（病毒富集、核酸提取和反转录、随机扩增可参考raw data
集数据库比对 基于reads的整合注释
多样本标准分析 丰度热图
主成分分析 聚类分析
显著性差异分析
35～75个自然日
案例解析
［案例一］ 针对炎症性肠病病毒基因组变化的研究[1]
本研究对剑桥、芝加哥、洛杉矶三个地区感染炎症性肠病（IBD）的人 群及其健康家属的粪便进行高通量测序，结果显示：在三组人群中有尾 目噬菌体和小噬菌体科物种相对丰度最高，并且两种病毒相对丰度呈负 相关趋势。比较剑桥地区IBD样本与对照，揭示了噬菌体丰度不成比例 主要与IBD有关，并初步验证肠病毒与IBD有关。
宏基因组测序
宏基因组测序1宏基因组研究概况宏基因组学（Metagenomics，又称元基因组学）这一概念最早在1998年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Handelsman等提出，随后伯克利分校的研究人员Kevin Chen和Lior Pachter将宏基因组定义为：应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落，而不需要在实验室中分离单一的菌株的科学。
鉴于环境中99%的微生物不可培养，宏基因组无需进行微生物分离操作的技术特点打破了传统微生物学基于纯培养研究的限制，为充分认识全球和人体范围内微生物和开发利用未培养微生物，并从完整的群落水平上研究微生物的活动和发掘潜在功能提供了可能。
传统的宏基因组学研究通过直接从环境样本中提取DNA，构建DNA克隆载体的宏基因组文库，并利用基于核酸序列差异分析、克隆子的特殊代谢活性、底物诱导基因的表达和（或）稳定同位素和荧光原位杂交等技术对宏基因组文库进行筛选和分析，从而有效地利用环境中丰富的微生物资源和挖掘新的特殊功能代谢物。
在宏基因组学研究的发展前沿中，核酸测序技术测序速度和通量的增长引人注目。
在下一代测序技术（NGS，又称第二代高通量测序技术）出现之前，基于宏基因组测序的核酸序列差异分析通常使用Sanger测序（主要基于双脱氧核苷酸链终止反应）方法，对宏基因组克隆文库或功能扩增子进行测序，来研究环境中微生物群落多样性及功能特征。
但Sanger测序方法通量较小、测序周期较长且价格昂贵。
随着新一代测序技术的迅猛发展以及广泛应用，宏基因组测序的方法也发生了翻天覆地的变化，目前科学家们可以对环境中的微生物全部基因组进行测序，在获得海量的数据后，全面地分析微生物群落结构以及基因功能组成，了解微生物如何耐受极端环境，发觉新的生物资源并探索微生物与环境间的相互作用。
下一代测序方法使用了几种不同的高通量平台，最先使用的是基于焦磷酸聚合酶乳液的RocheGS20 454测序仪（又称焦磷酸测序仪）。
宏基因组测序讲解
或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组研究将使人们摆脱物种界限，揭示更高更复杂层次上的生命运动
在目前的基因结构功能认识和基因操作技术背景下，细菌宏基因组细菌多样性。如宏基因组
并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和对策。一般
DNA 的提取、与载体连接和在宿主细胞建立中克隆[17]equence based screening)两种方法。
宏基因组学的研究步骤
一般包括从环境样品中提取基因组DNA，克隆DNA 到
蛋白等的试剂盒，在食品工业、NA构建
模式微生物并不能把所
DNA表达出来，降低了表型筛选的效率。宏基因组表型筛选的效率
从上万个克隆中一般只能筛选到几个有用的克隆。这表明宏基因组学的提
但受限于技术瓶颈，还未在实际工作中产生理论
DNA提取方法的改进[68]。
(细胞提取法)。直接裂解法是将
继而抽提纯化，包括物理法(如冻融法、
)和化学法、酶法等。不同直接裂解法的
此法操作容易、成本低、DNA提取率高、
但由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小(1-50kb)，难以
DNA，如先采用密度梯度离心分离微生物细胞，
DNA。此法可获得大片段
4个步骤。特别要指出的是，在基
其研究目标通常是测定单一物种的基因组序列；而在宏基因
(community)的混合基因组序
这种差别的关键就பைடு நூலகம்，绝大多数细菌是不可培养的，因此没有足够的研究材
分离特定环境生物DNA
DNA的做法，而是首先直接收集能
然后利用各种理化方法破碎微生物，使
DNA，再利用密度梯度离心等方法进行分离纯化。
扩增子测序和宏基因组测序的基本原理,二者的共同点和区别-概述说明以及解释
扩增子测序和宏基因组测序的基本原理，二者的共同点和区别-概述说明以及解释1.引言概述部分的内容可以如下编写：1.1 概述扩增子测序和宏基因组测序是现代生物学研究中常用的两种高通量测序技术。
它们都是通过对样本中的DNA进行测序来研究微生物群落的组成和功能。
扩增子测序主要侧重于特定基因片段的扩增和测序。
它利用PCR扩增技术选择性地放大目标基因片段，然后进行高通量测序，从而获得群落中各种微生物的扩增子序列。
这些扩增子序列可以用来研究微生物群落的种类、数量和相对丰度等信息。
宏基因组测序则是对样品中的所有基因组DNA进行测序，从而能够获得群落中各种微生物的完整基因组信息。
宏基因组测序通常使用高通量测序技术，并结合数据分析方法，可以获得微生物群落的功能潜力、代谢途径和基因编组等详细信息。
虽然扩增子测序和宏基因组测序都可以用于研究微生物群落，提供群落结构信息，但它们也有一些区别。
扩增子测序只能检测特定基因片段，而宏基因组测序可以获得完整基因组信息。
这意味着宏基因组测序可以提供更全面和详细的微生物信息，但也需要更高的测序深度和数据处理能力。
综上所述，扩增子测序和宏基因组测序作为两种重要的高通量测序技术，在研究微生物群落中各自发挥着独特的作用，有助于我们更好地理解微生物的多样性、功能和生态等方面的信息。
1.2 文章结构本文将围绕着“扩增子测序和宏基因组测序的基本原理，二者的共同点和区别”展开阐述。
文章共分为引言、正文和结论三个部分。
在引言部分，我们会首先概述扩增子测序和宏基因组测序的基本概念和重要意义，以便读者对这两种测序方法有一个整体的认识。
接着，我们会介绍本文的结构，明确文章的目录和主要内容。
最后，我们会明确本文的目的，即帮助读者全面了解扩增子测序和宏基因组测序的原理、共同点和区别。
在正文部分，我们将详细介绍扩增子测序和宏基因组测序的基本原理。
首先，我们会深入讲解扩增子测序的基本原理，包括PCR扩增和序列测定的过程和方法。
宏基因组测序技术检测方法
简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = ， 260/230 = ，电泳检测DNA 应是完整的一条带。
宏基因组二代测序报告、标本类型、送检保存要求、标本运输、内容解释及微生物致病概率分级
送检mNGS宏基因组二代测序报告情况、标本类型、送检保存要求、标本运输要求、测序情况、内容解释、微生物致病概率分级及解读宏基因组二代测序(mNGS) 是基于核酸检测的微生物鉴定技术其非预设性、高通量等优点而得到广泛应用。
下呼吸道感染主要包括社区获得性肺炎、医院获得性肺炎、免疫抑制宿主肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重、支气管扩张症合并感染等类型，临床表现多样，感染微生物种类复杂，感染和定植鉴别困难，加之mNGS 技术本身存在的局限性，mNGS 诊断效力的发挥有赖于选择恰当患者、采用适宜标本以及进行合理解读。
需送检mNGS情况(1) 免疫抑制宿主疑似发生LRTI 且临床表现提示非CAP 常见病原微生物所致者；(2) LRTI 患者发病初期即出现需要使用血管活性药物的感染性休克、需要有创机械通气的呼吸衰竭、多脏器功能不全等危及生命的状况时；LRTI 经规范经验性抗感染治疗48—72 h 后，感染症状仍持续加重或影像学快速进展者；(3) 聚集性发病疑似具有传染性、但无法明确病原体的LRTI；有特殊病史且经验性治疗无效，病情较为严重的LRTI；临床考虑特殊病原体(感染且病势迅疾或迁延者，常规培养困难或所在医疗机构无法提供可靠的传统检测方案时；(4) 患者有LRTI 症状或影像表现，经规范抗感染治疗后病灶吸收延迟、病程迁延，需鉴别是否由非感染性疾病所致，可以在常规病原微生物检测、感染生物标志物、病理等相关检查同时送检mNGS 以帮助鉴别诊断。
不建议送检 mNGS情况(1) 免疫功能健全宿主罹患LRTI（包括重症肺炎)，经过规范的经验性抗感染治疗病情已好转；(2) LRTI 已通过其他方法获得病原学结果，与临床特点相符，或针对性治疗有效；(3) 无法获取优质标本。
mNGS 标本类型在LRTI 的病原微生物诊断中，可用于mNGS 检测的标本包括痰(含诱导痰)、气管吸引物、支气管肺泡灌洗液（BALF）、经支气管肺活检（TBLB）标本、经支气管内超声（EBUS）活检标本、经皮肺穿刺活检标本、血液等。
宏基因组测序简介(发布版)
10
最早的宏基因组应用——环境宏基因组[14-15]
11
2008年——死后查因[16]
临床宏基因组应用先锋
2014年——首例临床，免死诊断[17]
2019年——病前预测[18]
3个病人在同一天接受同一个捐献者 的器官移植。在移植后4~6周均出现 发热后去世。
培养、PCR、血清学筛查、芯片检测 均为发现有用信息。
几秒到几 分钟（培 养后）
极个别顶尖三甲
1~2天 （Nanopor e可将时间 缩短至几 小时）
几乎未开展
6
定义：
宏基因组测序（MetaGenomics Next Generation Sequencing，mNGS），最早由威斯康辛大学植物 病理学部门的Jo Handelsman等于1998年提出，后被 伯克利分校的研究人员Kevin Chen和Lior Pachter等 定义为“应用现代基因组学的技术直接研究自然状 态下的微生物的有机群落，而不需要在实验室中分 离单一的菌株”[12]。
2016年，FDA发布NGS用于感染疾病监测指南：微 生物鉴定、抗菌药物耐药性、独立标志物[20]
2018年4月，高通量测序技术写入中国成人医院获得性 肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南[21]
2019年
2020年 14
15
宏基因组测序检测流程
样本采集
样本处理
NGS测序
数据分析
报告解读
质控！ 《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》 《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》
优势：
1、无偏倚，如一个标本中既有曲霉菌又有白色念 球菌，培养时，如果白色念球菌生长较快，便会影 响曲霉菌的生长，所以培养是有偏倚的，但理论上， 宏基因组测序对病原学诊断是没有偏倚的。 2、广覆盖，可以同时检测多种病原（如细菌、真 菌、病毒、寄生虫、支原体/衣原体、分枝杆菌等）。 3、无需先证知识，mNGS可以无需提前知道该样本 中的感染病原。
土壤微生物宏基因组测序方法及原理
土壤微生物宏基因组测序方法及原理下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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宏基因组测序在临床中的应用mNGS
下呼吸道感染
发病人数＞1000万/年 死亡率30%
15-62%病因不明
病因不明导致抗生素滥用
病原微生物（病原体）是指可以侵犯人体，引起感染甚至传染病的微生物，其中以细菌和病 毒的危害性最大。近年来，抗菌药物滥用致使细菌耐药，病原微生物感染已成为全球关注的 焦点。
全球每年约70万人死于抗生素耐药 中国住院患者使用抗生素比例约80%-90% 儿童发生感染性疾病居多，也是应用抗菌药物最多的群体。 我国儿科抗菌药物使用与国外比较： 1.抗菌药物使用强度高 2.用药种类多 3.药物抗菌谱广 4.注射用药比例高 5.新型、昂贵、光谱的第三代头孢菌素、 β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂 复合制剂类药物使用逐年增加。
宏基因组测序检测范围
宏基因组检测原理
mNGS是利用宏基因组学酸测序，与微生物专用数据库进行比对分析，获得疑似致病微生物的种属 信息，并提供全面深入的报告参数。
mNGS检测步骤
样本采集：根据不同采样方法收集感染 部位的样本 核酸提取：利用试剂盒对采集的样息分析：下机数据经过预处理质 检合格后，与微生物专用数据库进行比 对分析 出具检测结果：获得疑似致病微生物的 种属信息
难以检测新发/罕见病原，难 以检测疑难混合感染
深入提供病原鉴定，分 型
以序列为基础，可检测 新发病原体，并进行溯源
分类
其他检测方法VS宏基因组
诊断方法 涂片镜检
阳性率 ＜10%
细菌培养后质谱鉴定 ＜10%
耗时 1小时
3-14天
通量 1种微生物 几十种微生物
抗原抗体检测
＜10%
3-5天
1种微生物
PCR检测
10%-30% 2小时-3天 1种微生物
多重PCR检测 mNGS
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宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。
技术简介宏基因组（ Metagenome）（也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组）。
是由Handelsman 等1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学（或元基因组学，metagenomics）就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/ 或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
一般包括从环境样品中提取基因组DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA 到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组（ Metagenome）（也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组）。
是由Handelsman 等1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学（或元基因组学，metagenomics）就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/ 或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
一般包括从环境样品中提取基因组DNA,进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
特定生物种基因组研究使人们的认识单元实现了从单一基因到基因集合的转变，宏基因组研究将使人们摆脱物种界限，揭示更高更复杂层次上的生命运动规律。
在目前的基因结构功能认识和基因操作技术背景下，细菌宏基因组成为研究和开发的主要对象。
细菌宏基因组细菌人工染色体文库筛选和基因系统学分析使研究者能更有效地开发细菌基因资源，更深入地洞察细菌多样性。
如宏基因组成为生物催化剂的新来源。
宏基因组学研究的策略和基本过程研究策略“宏基因组学”是一种整体性的研究策略，它建立在微生物基因组学的迅速发展和聚合酶链式反应广泛应用的基础之上，是一种不依赖于人工培养的微生物基因组分析技术，涵盖了生物信息统计分析和基因组两方面的意义和技术，其策略是从特定环境中直接分离所有微生物DNA将大片段的DNA克隆到受体菌中表达，然后根据某些生物活性筛选有应用价值的克隆。
包括两个方面［9 20］:①宏基因组文库的构建：宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方法，并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和对策。
一般包括样品总DNA的提取、与载体连接和在宿主细胞建立中克隆［1 7］。
②宏基因组文库的筛选：根据其研究目的，宏基因组文库筛选通常有功能筛选(functional screening) 和序列筛选(sequenee based screening) 两种方法。
2宏基因组学的研究步骤基因组学的研究过程，一般包括从环境样品中提取基因组DNA克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的克隆等4个步骤。
特别要指出的是，在基因组学研究领域中，其研究目标通常是测定单一物种的基因组序列；而在宏基因组学中，则是要测定由多种微生物组成的复杂群体(community)的混合基因组序列。
这种差别的关键就是，绝大多数细菌是不可培养的，因此没有足够的研究材料。
2.1 分离特定环境生物DNA方法上不同于传统的先培养微生物再提取DNA勺做法，而是首先直接收集能够代表特定生物环境生物多样性的样品；然后利用各种理化方法破碎微生物，使其释放DNA再利用密度梯度离心等方法进行分离纯化。
2.2纯化的大分子量DNA进行克隆在对DNA酶切或者超声打断处理，并与合适的载体DNA进行连接，构建重组体。
2.3将带有宏基因组DNA的载体通过转化方式转入模式微生物建立各自的无性繁殖系例如转入大肠埃希菌中，使那些以前无法研究的不可培养微生物的DNA在模式微生物中得到复制、表达，进而得到研究。
所有带有宏基因组DNA载体的模式微生物克隆构成宏基因组文库。
2.4对宏基因组文库的DNA进行分析基于不同的研究目的，有很多分析方法，主要分为两类：一类为表型功能筛选，即利用模式微生物表型的变化筛选某些目的基因。
例如从文库中筛选能表达抗菌物质的克隆。
功能分析法根据重组克隆产生的新活性进行筛选，可用于检测编码新型酶的全部新基因或者获取新的生物活性物质。
另一类为序列基因型分析，即对文库中所有或部分的DNA进行测序分析，以应用于生态学研究。
例如分析文库中16SrRNA序列，对所研究生态环境的多样性进行评估。
一个典型的宏基因组分析涉及多个轮次，以确保从生态环境标本中分离到目的基因，及尽可能多地分析DNA 序列所编码的信息。
3 宏基因组学的技术方法宏基因组学是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
宏基因组学的研究策略和方法大致相同，现按照宏基因组学研究的基本过程和策略对常用方法和技术予以简要介绍。
3.1样品总DNA的提取及基因或基因组DNA勺富集提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，尽可能代表自然状态下的微生物原貌，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。
要采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出环境样品中的DNA又要保持较大的片段以获得完整的目的基因或基因簇［4 5］。
所以总的提取总是在最大提取量和最小剪切力之间折中。
应严格操作，谨防污染，并且保持DNA片段的完整和纯度。
已有许多商品化宏基因组DNA提取试剂盒可用，同时很多实验室仍致力于宏基因组DNA提取方法的改进［6 8］。
常用的提取方法有直接裂解法和间接提取法（细胞提取法）。
直接裂解法是将环境样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理，继而抽提纯化，包括物理法（如冻融法、超声法、玻璃珠击打法、液氮研磨法等）和化学法、酶法等。
不同直接裂解法的提取方法差别在于细胞破壁的方式不同。
此法操作容易、成本低、DNA提取率高、重复性好，但由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小（1-50kb），难以完全去除酚类物质。
细胞提取法先采用物理方法将微生物细胞从环境中分离出来，然后采用较温和的方法抽提DNA如先采用密度梯度离心分离微生物细胞，然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解，脉冲场凝胶电泳回收DNA此法可获得大片段DNA（20-500kb）且纯度高，但操作繁琐，成本高，有些微生物在分离过程中可能丢失，温和条件下一些细胞壁较厚的微生物DNA也不容易抽提出来。
为了更好地反映环境中的微生物种群并且提高阳性克隆的占有率，需要在克隆之前通过不同的方法对感兴趣的目的基因或基因组进行富集［9 11］，一个比较好的富集方法是稳定同位素示踪技术［12］。
抑制性消减杂交技术［13］是抑制性与消减杂交技术相结合的更简单、更快速的分离差异基因的方法。
该方法不仅利用了消减杂交技术的消减富集，同时也利用了抑制性技术进行了高效率的动力学富集，所以该技术是一项富集特定基因、证实微生物之间基因不同的非常有用的技术方法。
3.2宏基因组文库的建立宏基因组文库的构建策略取决于研究的整体目标。
偏重于低拷贝、低丰度基因还是高拷贝、高丰度基因要取决于研究的目的是单个基因或基因产物还是整个操纵子及编码不同代谢途径的基因簇。
基因文库的建立过程中需要选择合适的克隆载体和宿主菌株。
传统的方法是直接利用表达载体构建宏基因文库，但是表达载体可插人的宏基因片段一般小于10kb。
克隆中宿主菌株的选择主要考虑到转化效率、宏基因的表达、重组载体在宿主细胞中的稳定性以及目标性状的筛选等。
目前大肠杆菌是最为常用的宿主［14］，此外，链霉菌和假单胞菌也可以作为构建文库的宿主，不同微生物种类所产生的活性物质有明显差异，不同的研究目标应选择不同的宿主菌株。
3.3宏基因组文库的筛选由于环境基因组的高度复杂性，需要通过高通量和高灵敏度的方法来筛选和鉴定文库中的有用基因。
筛选技术大致可分为四类：①基于核酸序列差异分析；②基于目的克隆功能的特殊代谢活性；③基于底物诱导基因的表达；④基于包括稳定性同位素和荧光原位杂交在内的其他技术。
.3.1基于序列的筛选方法通常根据已知相关功能基因的保守序列设计探针或PCR引物，通过杂交或PCF扩增筛选阳性克隆。
用这种方法有可能筛选到某一类与已知序列相近的新基因，这一策略可以分离已知基因家族的新成员和含有高度保守区的酶基因［15 16］。
另一种方法是对含有16SrRNA等系统进化锚定基因的克隆进行测序或对文库随机测序［17］。
优点是不必依赖宿主菌株来表达克隆基因，缺点是必须对相关基因序列有一定的了解，文库中那些和现有基因序列完全不一样的基因无法被筛选，故难以发现全新的活性物质，对鉴定新的基因成员有一定的局限性，也很难获得全序列。
直接序列分析法(sequenee driven screening method)是对所构建宏基因组文库的克隆进行随机测序分析，显然可以得到最多的信息［18 20］。
也可用鸟枪法对宏基因组文库进行测序，但需要进行大量的测序和分析工作，需大量人力、物力及财力。
虽然DNA序列分析技术不断发展，但与个体微生物基因相比，宏基因组文库包含着巨大的序列片段，但对这些序列片段进行后续的分析则极为困难，结合其他的筛选方法可以得到更多的信息。
用微阵列技术(基因芯片)进行初步筛选，可以很大程度上减少测序量和后续的序列拼接等工作量。
但微阵列技术在用于宏基因组文库筛选时，除了其本身由于交互杂交等导致的特异性低、灵敏度较差等缺点外，同样不能用于对未知功能基因的筛选，且检测不到环境中存在的那些低丰度微生物的序列［21 22］。
3.3.2基于功能的筛选方法功能性筛选法是以活性测定为基础，通过建立和优化合适的方法从基因组文库中获得具有特殊功能的克隆，然后通过序列和生化分析研究这些克隆。
由于基于活性的筛选不需要已知序列的信息，故能较快地找到可用于工农业和医药的蛋白质和天然产物。