宏基因组文库构建
完整版)宏基因组测序讲解
完整版)宏基因组测序讲解宏基因组测序的目的是研究藻类物种的分类、与特定环境相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部、微生物与环境以及与宿主的关系。
宏基因组，也称为微生物环境基因组或元基因组，是由Handelsman等于1998年提出的新名词。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
宏基因组学是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的微生物研究方法。
它通过功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及与环境之间的关系为研究目的。
一般XXX包括从环境样品中提取基因组DNA，进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组文库是一种重要的研究工具，可以利用转入大肠杆菌中的宏基因组DNA载体，使以前无法研究的不可培养微生物的DNA得到复制、表达，从而进行研究。
所有带有宏基因组DNA载体的模式微生物克隆构成宏基因组文库。
对于宏基因组文库的DNA进行分析，有很多分析方法，主要分为表型功能筛选和序列基因型分析两类。
表型功能筛选是利用模式微生物表型的变化筛选某些目的基因，例如从文库中筛选能表达抗菌物质的克隆。
而序列基因型分析则是对文库中所有或部分的DNA进行测序分析，以应用于生态学研究，例如分析文库中16SrRNA序列，对所研究生态环境的多样性进行评估。
一个典型的宏基因组分析涉及多个轮次，以确保从生态环境标本中分离到目的基因，并尽可能多地分析DNA序列所编码的信息。
XXX是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的新的微生物研究方法。
它主要通过功能基因筛选和测序分析来研究微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系。
在宏基因组学研究中，样品总DNA的提取及基因或基因组DNA的富集是非常关键的步骤。
提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测方法首先，宏基因组测序技术的样品采集非常重要，需要选择适当的采样策略和方法。
采样点的选择应考虑生态系统的多样性和复杂性，同时要确保采样点的代表性和一致性，以便更准确的反映生态系统的特征。
其次，样品处理是宏基因组测序技术中的关键步骤之一、样品处理的目的是去除样品中的非目标DNA，并增加细菌和古菌的DNA含量。
常用的样品处理方法包括滤网富集、密度梯度离心和聚合酶链反应（PCR）等。
在DNA提取过程中，需要先将样品中的DNA分离出来。
DNA提取的方法有许多种，可以选择适合的方法根据不同的样品类型和目标物种。
常用的DNA提取方法包括酚-氯仿提取法、商用DNA提取试剂盒等。
在DNA提取后，需要进行文库构建。
文库构建是将DNA片段添加接头序列，并通过PCR放大，生成可以进行测序的文库。
文库构建的方法有多种，常用的包括文库制备试剂盒和自制接头序列等。
完成文库构建后，接下来是测序步骤。
目前宏基因组测序常用的技术是高通量测序技术，常见的有Illumina MiSeq、Illumina HiSeq和PacBio等。
不同的测序技术具有不同的优缺点，可以根据实验需求选择合适的测序技术。
最后是数据分析。
宏基因组测序获得的数据量庞大，需要进行有效的数据分析来获取有价值的信息。
数据分析可以包括序列质控、序列拼接、OTU聚类、物种注释、功能预测等。
数据分析的方法有多种，可以使用开源软件如QIIME和Mothur等，也可以使用商业软件如RDP和MetaPhlan 等。
总体而言，宏基因组测序技术的检测方法包括样品采集、样品处理、DNA提取、文库构建、测序和数据分析等步骤。
这些步骤需要结合具体的实验目的和实验条件来选择和调整，以保证获得准确、可靠和有意义的结果。
宏基因组测序技术的发展将为生物学、生态学和环境研究等领域提供更深入和全面的研究手段，推动相关领域的快速发展。
宏基因组学
广义的宏基因组：特定环境下所有生物遗传物质的总和 狭义的宏基因组：特定环境样品中细菌和真菌的基因组总和
宏基因组测序（Metagenomics Next Generation Sequencing,mNGS)
NGS:也称高通量测序，是一种可以同时对数十万到数百万条DNA分子序列进行读取的测序技术。 mNGS:m指宏基因组。mNGS指宏基因组二代测序，以特定环境中整个微生物群落作为研究对象，利 用高通量测序平台进行基因组DNA测序，DNA不需要进行PCR扩增，测序结果具有较好的无偏性， 不仅可以提示微生物群落的物种组成，更能获需段序列分析不依赖 于任何已知序列信息进行筛选。其中以功能筛选法最为常用。
能够直接发现全新的活性物质和功能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子 缺陷：
工作量大,效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。
谢谢！请大家批评指正
其前端关键性技术是环境DNA(e DNA)的提取A的提取
直接提取法（原位提取法） 不经过样品中微生物的培养和分离，通过化学法、酶解法或物理法直接破碎环境中的微生物细胞而使DNA得以释 放，并对DNA进行纯化。 操作简便、省时、成本低，所获得DNA具有较好的完整性，并能够代表某一生境的微生物群落多样性。 但常会出现细胞裂解不完全或DNA与土壤杂质成分产生共沉淀而无法有效地去除等问题，所以一般需要进一步的 DNA纯化处理，同时所提取获得的DNA片段较用离心介质或者梯度离心等方法先把微生物从环境样品中分离出来，再按处理纯培养细胞的方法裂解微生物 细胞提取DNA。 该法获得的宏基因组DNA受到胞外杂质污染干扰较少，纯度较高、DNA完整性好(20kb~大、DNA得率较低，其产率只是直接裂解法的1%~10%,且获得的DNA往 往不能完全代表样品所在生境的生态学多样性。
微生物组和宏基因组
微生物组和宏基因 组研究面临的挑战 与未来展望
微生物组和宏基因 组数据量大，解析 难度高
数据质量参差不齐， 影响挖掘准确性
解析算法和工具尚 不成熟，需进一步 优化
数据安全和隐私保 护问题亟待解决
技术挑战：提高测序深度和分辨率，降低成本 数据解读：解析微生物组和宏基因组的复杂结构和功能 伦理问题：保护个人隐私和生物安全，避免滥用数据和误导研究环境中的微生物多样性、功能和进化关系。
应用领域：环境科学、生物技术、医学和农业等领域。
定义：对环境样本中的全部微生物基因组进行测序的方法 目的：了解微生物种群结构、功能和进化关系 技术分类：高通量测序、单分子测域
简介：代谢组学分析是一种研究微生物组的方法，通过检测微生物的代谢产物来了解其 功能和相互作用。
技术手段：利用质谱、核磁共振等技术对微生物的代谢产物进行分析，以揭示其代谢途 径和生物合成过程。
优势：代谢组学分析可以全面了解微生物组的代谢活动，揭示微生物组与环境、宿主之 间的相互作用。
应用领域：在医药、农业、食品等领域有广泛的应用，例如用于药物筛选、疾病诊断和 环境污染治理等。
微生物组与人体健康： 对人体健康有重要影 响，与许多疾病的发 生和发展密切相关。
微生物组与生态平衡： 在生态系统中发挥着 重要作用，维持着生 态平衡。
微生物组研究：通过研 究微生物组的组成、功 能和相互作用，有助于 深入了解其在不同领域 的应用价值。
宏基因组是指从环境中直接提取的 基因组信息
宏基因组学在环境保护、生物能源 等领域有广泛应用
利用微生物组和 宏基因组技术可 以开发新型疫苗， 预防和控制疾病 的发生和传播。
微生物组和宏基 因组技术还可以 用于监测疾病的 进展和治疗反应， 为个性化治疗提 供支持。
基因组文库构建
SI 酶 降 解 发 夹 结 构 末 端 转 移 酶 dGTP 末 端 转 移 酶 加 寡 聚 C CCC CCC GGG GGG 连 接
转 化 E .c o li 扩 增 以 质 粒 为 载 体 构 建 cD N A 文 库
四.大容量克隆载体
基因组作图中使用的高容量人工染色体克隆载体的比较。
载体 YAC( 酵母人工染色体 ) 系统 酵母着丝粒 , 复制起始 点和端粒 克隆容量 200kb ～2Mbp 评价 嵌合 发生 率高 ( 在 基因 组 中不相连的连续片段) ； 不稳定 (自发缺失 )； 很难与酵母染色体分离； 稳定，但在细菌外难以维 持
TTTTTT
TTTTTT AAAAAA
通 过 以 下 途 径 将 cDNA 插 入 载 体 a. 平 端 克 隆 b. 加 接 头 c. 进 一 步 进 行 同 聚：裸露的噬菌体重组DNA转化宿主细胞或 包装后转染宿主细胞。 载体筛选：在细菌菌苔中形成噬菌斑。 重组筛选： 插入载体—通过可见标记的插入失活(cI基 因的打断阻止溶源性，产生的噬菌体更清澈； 现代的载体携带lacZ基因，以兰-白筛选)。
(a) 随 机 六 碱 基 NNNNNN (c)发 夹 引 物
AAAAAAA mRNA (b)寡 聚 (dT)引 物 第 一 条 cDNA 的 合 成 An An Tn (d)同 聚 物 加 尾 反 应
第 二 条 cDNA 的 合 成 TTTTTT GGGGGG CCCCCC 加接头 1 TTTTTT GGGGGG AAAAAA CCCCCC 切除发夹 TTTTTT AAAAAA 加接头 2 TTTTTT AAAAAA 经酶切进行定向克隆 cDNA 克 隆
PAC(P1 人工染色体 ) BAC( 细菌人工染色体 ) MACs( 哺乳类人工染色 体)
番茄灰霉病病株根际土壤宏基因组文库的构建
［ ］ Ｌ Ｒ Ｎ Ｐ Ｓ Ｈ Ｅ Ｅ Ｃ Ｍ ｔ ｇ ｎ ｍ Ａ ｈ ｌ ｅ ｇ ｎ ７ Ｏ Ｅ Ｚ ， Ｃ Ｌ Ｐ Ｒ ． ｅ ａ ｅ ｏ ｅ ｃ ａ ｎ ｉ ｇ ｌ ｓ ｕ ｃ ｏ ｅ ｚ ｍ ｄ ｃ ｖ ｒ ［ ］ Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆ Ｍ ｌ ｃ ｌ ｒ ｏ ｒ ｅ ｆ ｎ ｙ ｅ ｉ ｏ ｅ ｙ Ｊ ． ｏ ｒ ａ ｏ ｏ ｅ ｕ ａ ｓ
春 鞘 顶 芽 一外 植 体 灭 菌 、诱 导 培 养 一继 代 增 殖 培 养 一 生 根 培养 一 瓶炼 一 营养 杯 移栽 苗 一 成 品苗 。
［］ 李 云． 果 花 菜组 织培 养技 术 ［］ 北 京 ： 国林 业 出版 ３ 林 Ｍ． 中
社 ．
［］ 梁玉 堂， 庄 如． 木 营 养繁 殖原理 和 技 术 ［］ 北京 ： ４ 龙 树 Ｍ． 中
育 出版社 ．
容 易 失水 萎 蔫 ；湿 度过 大 ， 组培 苗会 腐 烂致 死 。实验 结 果显 示 ，
相 同。
移 栽 的初 始 湿度 应 为饱 和 湿度 ，其后 逐 渐 降低 ，直 到 与 大气 湿度 林 业 出 版 社 ．
４结 论 ４ １ 工厂 化 育苗 工 艺流 程 ．
ｐｒｏ ｃｔｓ ｆ ｍ ｓ ｄｕ ｒｏ ｏｉｌ Ｄ ｌｉ ｒａ ｅｓ Ｔｎ ｓ ｅｐ ｎｙ ｔｅ ＮＡ ｂ ｒｉ ａ ｔｒ ｔＯ ｃｅ
１ ０ ０ ５ ０ ｂｐ
ｈ ｓ ［ ］ Ｏ ｇ Ｌ ｔ ， ０ ０（） ２ ０ — ４ ４ ｏ ｔ Ｊ ． ｒ ｅ ｔ ２ ０ ２ ： ４ １２ ０ ．
［］ ５ 冯美琴 ． 基 因组 学 的研 究进展 ［］ 安徽 农 业科 学．０ ８ 宏 Ｊ． ２０ ，
３ ２ ４ ５４６４ ９ ６（）： １ － １ ， ７ ．
怎样构建基因组文库
i. 两菌株分别培养,分别收集和制备，包装前混合---本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。
ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单， 本底高，可包装不同大小的λDNA分子。
2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组 λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去 细胞碎片 λ颗粒于-70℃保存待用
sa c B
K anr
p a c lo x P
D N A h ea d fu l
+
+ p a c c le a v a g e
p r o te in
C re
R e c o m b ila tio n
DNA
A m p lific a tio n七. 利用YAC载体构建基因组1. 两臂DNA片段的制备:
第四章基因的建立来自基因文全部遗传信息的重组D因组DNA长度之比
S
C o s o r i A pr S
SalI Cos
S
H
S
S1 Cos
H
BamH I 小片段
Cos
H
35-45kb DNA 片 段
T4 DNA ligase
Cos
H
利
构用
建双
COS
基
因
组质
文粒
S
离体包装
S
库载
感 染 E.coli
体六. 利用P1载体构建基因组构建过程也与λ载体构建过程十分相似:
1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2. 供体DNA片段的制备: 部分酶切 蔗糖梯度离心 3. 两DNA的连接和重组DAN分子的包装
宏基因组学
,已发现的新基因主要有生物催化 剂基因、 抗生素抗性基因以及编码转运蛋白基因
• 土壤宏基因组学技术最引人注目的贡献是新生物 催化剂的发现 , 包括腈水解酶和淀粉酶( Rondon et al . , 2000 )、 蛋白酶、 氧化还原酶(Knietsch et al . , 2003)、 脂肪酶、 酯酶 ( Ki m et a l . ,2004; 2006)等 ,并且在此基础上获得新酶的许 多特征信息.
• 海表层水样 为研究海洋生命的代谢潜力和海洋生态学提供
了前所未有的原始素材；海洋蕴藏着巨大的生物 多样性和复杂性 ,宏基因组学研究将大大促进人 们对它的认识。 • 极端环境水体 (如酸性矿水、 深海 )
由于其苛刻的物理化学条件,使得其中的微生 物群落也较为独特 ；利用环境基因组学对其开展 微生物生物群落结构及生理代谢对环境变化响应 的研究 ,将促进我们更好地理解这些极端环境生 态系统并对其加以调控和利用。
序列分析法
• 微序列技术 (Micr oarray)采用集约化和平面处 理原理 ,在微小片基上高密度而有序地排列大量 基因片段、 EST或寡核苷酸片段 ,从而形成 DNA 微矩阵 ,又称基因芯片。
• 焦磷酸测序技术( Pyrosequencing) 是在焦磷酸 盐测序法的基础上结合一种乳胶材料和皮升级反 应孔 ,将基因组 DNA进行随机切割 ,批量地进行 整个测序反应，能够在相同的时间内破译 6 × 106组以上的基因组序列 ,比 Sanger法要快100 倍 ,提高了测序的效率。
将一条完整的目标序列随机打断成小的片段 , 分别测序 ,然后利用计算机根据序列间的重叠关 系进行排序和重新组装, 并确定它们在基因组中 的正确位置 。
• 优点：为筛选新的天然产物提供了 一种可选择的途径, 从中挖掘上百 万个新基因,揭示不可培养微生物 的代谢途径.
基因文库的构建与使用
基因文库的构建与使用在生物科学领域，基因文库的构建和使用是研究基因功能和生物多样性的重要工具。
基因文库是指包含某种生物全部基因的克隆文库，它可以为我们提供深入了解该生物基因组的信息。
本文将详细介绍基因文库的构建与使用，包括基因文库的基本概念、构建方法、使用方法以及优势和展望。
一、基因文库的基本概念和作用基因文库是包含某种生物全部基因的克隆文库，它为我们提供了该生物基因组的全面信息。
构建基因文库的目的是为了方便研究者们筛选、分析和研究基因的功能以及多样性。
基因文库可以用于寻找基因的新颖功能、发现新的药物靶点以及为基因组编辑和改造提供资源。
二、构建基因文库的方法构建基因文库主要包括以下步骤：1、基因组文库的构建：首先需要获得该生物的基因组，然后将基因组进行分解，形成一系列重叠的DNA片段。
这些片段经过纯化、扩增和克隆到特定的载体中，形成基因组文库。
2、表达文库的构建：为了筛选出具有特定功能的基因，还需要构建表达文库。
表达文库中的基因需要在特定的细胞或组织中表达，以便研究者们能够确定基因的功能。
在构建基因文库时，需要考虑到基因的种类、基因表达水平以及克隆载体的选择等因素。
这些因素都会影响到基因文库的质量和实用性。
三、基因文库的使用方法使用基因文库可以方便地筛选和研究基因的功能。
以下是如何使用基因文库的一般步骤：1、选择相应的基因文库：首先需要选择包含所需基因的文库。
如果研究目标是寻找特定功能的基因，可以选择包含该功能基因的文库。
2、筛选候选基因：根据研究目标，可以在文库中进行筛查，挑选出可能具有所需功能的候选基因。
3、验证基因功能：通过实验验证挑选出的候选基因是否具有所需功能。
这可以通过表达和检测候选基因在细胞或整体生物中的功能来实现。
4、利用基因文库进行基因组编辑：基因文库也可以为基因组编辑提供资源和指导。
通过比对和分析基因文库中的序列，可以确定目标基因的精确位置和剪切位点，从而实现精准的基因组编辑。
宏基因组学
稳定性同位素标记技术
• 通过 SIP实验使参与特定代谢过程 (例如甲 烷氧化 )的生物基因组富集 ,克隆从 SIP实验 中获得的13C标记的核酸 ,从而构建一个因 吸收了特定的基质而在
应用和研究现状
水体宏基因组学
底物诱导基因表达法
• 代谢相关基因或酶基因往往在有底物存 在的条件下才表达 ,反之则不表达 ,SIGEX 即利用这个原理来筛选目的代谢基因。
底物诱导基因表达法
• 第—β2 D硫代半乳糖苷
( IPTG)为诱导物去除阴性克隆和绿色荧光蛋白 基因 ( gfp)表达的克隆子； • 第三步：在培养基中添加底物诱导代谢关基因的表达； • 第四步：根据 gfp基因的表达从宏基因克隆库中筛选出表 达代谢基因的克隆子 ,利用荧光激活细胞分离仪 ( FACS)从琼脂培养平板上将GFP表达的克隆子分 离出来。
• 宏基因组学
也称微生物环境基因组学, 环境基 因组学，元基因组学,生态基因组学。
环境基因组学建立在对疾病病因认识的基 础上 ,深入探讨环境胁迫 - 基因、 基因基因间交互作用。其目标是研究环境胁迫对 机体遗传变异的过程和机理 ,包括发掘环境 应激和应答基因的多态性 ,探究这些多态性 基因的功能及其与患病风险的关系 ,其与毒 理基因组学密切相关 ,是在人类基因组基础 上发展的功能基因组学内容之一。
为什么要研究宏基因组学呢？
• 99%以上的微生物未 (难 )被纯培养, 对微 生物世界的认识集中在不到1%的微生物上
• 人们对微生物的认识主要基于实验室纯培 养的单一微生物物种,对微生物群落作为整 体的功能的认识远远落后于对其个体的认 识
• 环境基因组学的研究方法
以基因组学技术为依托
主要的程序包括: 1、从环境样品 (例如土壤 )中直接提取 DNA; 2、将 DNA克隆到合适的载体中; 筛 选。
(完整版)宏基因组测序讲解
宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。
技术简介宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
宏基因组测序原理
宏基因组测序原理
宏基因组测序是一种用于研究复杂生态系统中宏观生物群落的基因组组成和功能的方法。
宏基因组测序的原理是通过高通量测序技术，将样本中所有的DNA提取、扩增和测序。
与传统
的基因组测序不同，宏基因组测序不需要进行纯培养和分离，可以直接对环境样品中的DNA进行整体测序。
宏基因组测序可以用于研究各种生态系统，如土壤、水体、海洋、肠道等。
其主要步骤包括样品采集、DNA提取、DNA文
库构建、高通量测序和数据分析。
首先，样品采集时需要选择合适的采集方法和地点，以保证样品中包含目标生态系统的丰富多样性。
然后，通过DNA提取技术获得样品中的总DNA，包括来自各种微生物、植物和动物的DNA。
接下来，将DNA
文库构建用于测序，通常使用PCR扩增技术将DNA样品分成小片段，并在每个片段的末端添加特定的测序适配体。
然后，通过高通量测序技术对DNA文库进行测序，生成大量的短DNA序列。
最后，通过对测序数据进行数据分析，可以获得
宏基因组的组成和功能信息，如物种多样性、宏观基因组结构、功能基因等。
宏基因组测序的应用广泛，可以用于研究生态系统的演化、生态功能和生态网络等。
例如，通过宏基因组测序可以研究土壤中微生物的多样性和功能，了解微生物在土壤生态系统中的作用。
此外，宏基因组测序还可以用于研究人体肠道微生物群落的组成和功能，为人类健康和疾病的研究提供重要依据。
总之，宏基因组测序是一种高通量测序技术，通过对环境样品
中的总DNA进行测序和数据分析，可以获取复杂生态系统中宏观生物群落的组成和功能信息。
它为生态系统研究和微生物学领域提供了强大的工具和方法。
宏基因组文库构建
载体的选择：
可装载的外源DNA
Plasmid
<10kb
λ Phage Cosmid BAC YAC
0-23kb ~45kb ~ 100kb ~ 300kb-1.2Mb
粘粒克隆所需的克隆子数是λ phage的一半， 如λ 需700000时，cosmid需350000个
如无特殊需要(如单个λ phage不能包容靶基因片段 或要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克 隆时)一般不采用cosmid，因其在构建和贮存 比λ phage困难得多
1976年L.Clark,p)/基因组DNA大小的比值
哺乳动物 3×109kb 若p=99% 平均克隆片段20kb
• 分解基因: 苯环化合物, 分解酶
• 功能活性：杀虫，酶 • 启动子/复制子
Vector
Amp ori
MCS
Tet gene without promoter
将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在Tet 平板上筛选抗性菌落, 可得到promoter
其他标记: gfp, Kan
eria in pure culture is typically the first step in investigating bacterial processes.
standard culturing techniques account for 1% or less of the bacterial diversity in most environmenta phylogenetic diversity of uncultured microorganisms is only the first step.
assign ecological roles to them.
宏基因组测序的流程
宏基因组测序的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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1. 样品采集和DNA提取。
从目标环境中采集样品，例如土壤、水或动物肠道。
土壤宏基因组文库的构建及格尔德霉素类PKS基因的初步筛选
ｍｅ ａ ｅ ｏ ｃ ｌ ｒ ｒ ｓ ｃ ｎ ｔ ｃｅ ｕ ｃ ｓ ｆ ｌ ， ｉｈ Ｗａ ｏ ｓｓｅ ｆａ ｏ ｔ６ ０ ｌ ｎ ｓｃ ｎ ａ ｎ ｎ ｖ ｒ２ ｋ ｔ ｇ ｎ ｍｉ ｉ ａ ｗａ ｏ ｓｒ ｔ ｄ ｓ ｃ ｅ ｓ ｕ ｌ ｗｈ ｃ ｓ ｃ ｎ ｉｔ ｄ ｏ ｂ ｕ ８ ０ ｃｏ ｅ ｏ ｔ ｉ ｉ ｇ ｏ ｅ ５ ｂ ｂ ｙ ｕ ｙ
ｇ ｌ ａ ａ ｃｎ ｔ ｐ ＫＳ ｇ ｎ ｓ Ｃｏ ｏ ｙ Ｐ ｓｐ ｒｏ ｍ ｅ ｒｓ ｒ ｅ ｉ ｇ ｔ ｅ ｍｅ ａ ｅ ｏ ｃ ｌ ｒ ｒ Ｒｅ ｕｌｓ Ａ ｏ ｌ ｅ ｄ ｎ ｍｙ ｉ ｅ Ｉ ｙ Ｐ ｅ ｅ ． ｌ ｎ — ＣＲ ｗａ ｅ ｆ ｒ ｄ ｆ ｃ ｅ ｎ ｎ ｔ ｇ ｎ ｍｉ ｉ ａ ｏ ｈ ｂ ｙ ｓ ｔ ｓ ｉ
Ｇ ＤＭ和 ４５ ｄｈ ｄｏ １ 一 ｇｙ ｙ． ，．ｉ ｙ ｒ 一 ９Ｏ— ｌｃ １ ＧＤＭ较 ＧＤＭ ，水
溶 性 提 高 了约 ２ 倍 ［】 ３ １ 。Ｃｈ ｎ 等 合 成 了糖 基 化 的 ６ ｅｇ
ＧＤＭ ， 降低 了毒 副 作 用 ［】 １。Ｃｙ ｙ 等 用 谷 胱 甘 肽 取 ７ ｓｋ 代Ｇ ＤＭ苯醌 环 上 ｌ 位硫 醇 基 团 ，减 弱 了Ｇ ９ ＤＭ的毒 性
ｂ ｏｓ ｎｔ ｅ ｉ ｆｎｏ ｅ ｌ ｋｅｉ ｅ ｓ ｃ ｎ ｒ ｅａ ｏ ｉｅ ． ｉ ｙ ｈ ｓｓｏ ｖ ｌ ｐｏ ｙ ｔｄ ｅ ｏ ｄａ ｙｍ ｔ ｂ ｌｔ ｓ
Ｋｅ ｒ ｓ Ｍ ｅ ａ ｅ ｏ ｃｌ ｒ ｒ ；Ｐ ｙ ｗｏ ｄ ｔ ｇ ｎ ｍｉ ｂ ａ ｙ ＫＳ ｉ ；Ｓ ｉ ｏｌ
关键 词 ：宏 基 因组 文 库 ；Ｐ ； 土 壤 ＫＳ 中 图分 类 号 ：Ｑ ３ 文 献标 识 码 ：Ａ ９３
Ｃｏ ｓ ｒ ｃ ｉ ｎ ｏ ｏｌｍ ｅ ａ ｅ ｍ ｉ ｉ ａ ｙ ａ ｅｉ ｉ ｒ ｃ ｅ ｎ ｎ ｆ ｎ ｔ ｕ ｔｏ ｆａｓ ｉ ｔ ｇ ｎｏ ｃｌｂｒ ｒ ｎｄ ｐｒ ｌｍ ｎａ ｙ ｓ ｒ ｅ ｉ ｇ ｏ ｇ ｌ ｎａ ｙｃｎ・ ｋｅｔ ｐｅ・ ｌ ｋｅ ｉ ｙｎｔ ｓ ｅ ｅ ｅ ｄａ ｍ ｉ —ｉ ｙ － ｐｏ ｙ ｔｄｅｓ ｌ Ｉ ｈａ ｅｇ ｎ
南极土壤微生物宏基因组文库构建及其抗肿瘤活性初探
自 燕科荸遗展 第１卷 第２ ２０年２ ７ 期 Ｏ ７ 月
２ ６ ７
南 极 土 壤 微 生物 宏 基 因组 文 库 构 建 及其 抗 肿 瘤 活性 初 探 ＊
赵 晶 杨 祥 胜 曾润 颖 一
１ ．厦 门大 学 生 命 科 学 学 院 ，厦 门 ３ １０ ；２ ６ ０ ５ ．国 家 海洋 局 海洋 生物 遗 传 资 源 重 点 实 验 室 ，厦 门 ３ １０ ； ６ ０ ５ ３ ．国 家海 洋 局 第 三 海 洋 研 究 所 ，厦 门 ３ １０ ６０５
子 ＡＥ ３对 卵 巢 癌 细 胞 具 有 明 显 的 生 长 抑 制 作 用． 一
关 ｏ世 纪 ６ ｏ年 代 开 始 至今 已分 离 得 到 了
几 十种 具有潜 在 抗肿 瘤 活 性 的新 物 质［ ，但 恶 性 肿 ５ ］ 瘤 中 ９ ％以上 的 实 体瘤 的 治疗 未 能 达 到满 意效 果 ， Ｏ 因此抗肿 瘤新 药 筛选 在 肿 瘤 治 疗 中 占重 要 地 位． 南 极 的极 端环 境 中生存 着 众 多 尚未得 到 研 究 的特 殊 微
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自鞋科荸ｊ展 第１卷 第２ ２ ７ 月 ． 焦 ， ７ 期 ０ 年２ ０
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极端 环 境 中． 本 文构 建 了南 极 土 壤 样 品 的宏 基 因组 Ｄ ＮＡ 的 Ｃ ｓ ｄ文 库 ，并 采 用 指 示 菌 株 的 差 异 性 ｏｍｉ ＤＮ 修 复试验 （ Ｒ ［ 作 为抗 肿瘤 活 性 物 质 的筛 Ａ ＤＤ Ｔ）９ 选模 式 对 所 构 建 的 文 库 进 行 初 步 筛 选 ， 获 得 了 １ ３
摘要
微 生 物代谢 产 物是 药物 的 重要 来 源 之 一， 然 而采 用传 统 的分 离培 养 筛选 的手 段仅 能对 不
宏基因组学研究方法及应用概述
宏基因组学研究方法及应用概述彭昌文 (山东省济宁学院生物学系 273155) 颜 梅 (山东省曲阜师范大学生命科学学院 273165)摘 要 本文简要介绍了宏基因组的概念,概述了其原理及应用。
关键词 宏基因组 宏基因组学 环境基因组学 基因文库的构建 迄今,人们对微生物世界的认识基本都来源于对占细菌总种数不到1%的微生物的单个种群的孤立研究结果。
然而微生物是通过其群落而非单一种群来执行在自然界物质与能量循环中的作用的,对微生物群落作为整体的功能认识远远落后于对其个体的认识。
这种状况不利于全面认识微生物在自然界所扮演的重要角色。
为了获得完整的环境微生物基因表达产物,早在1978年许多学者就提出了直接从环境中提取微生物DNA的思路,1998年,AR I A D phar maceutical公司的科学家Handels man等首次提出宏基因组的概念[1]。
宏基因组(the genomes of the total m icrobi ota found in nature)是指生境中全部微生物基因的总和[2]。
它包含了可培养的和未培养的微生物的基因总和,微生物主要包括环境样品中的细菌和真菌。
而宏基因组学就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系等为研究目的的新的微生物研究方法,也称为微生物环境基因组学、元基因组学或生态基因组学。
它主要研究从环境样品获得的基因组中所包含的微生物的遗传组成及其群落功能,为充分认识和开发利用非培养微生物,并从完整的群落水平上认识微生物的活动、最大限度地挖掘微生物资源,提供了可能,已成为国际生命科学技术研究的热点和前沿。
1 宏基因组学的研究方法宏基因组学的研究过程一般包括从环境样品中提取基因组DNA,克隆DNA到合适的载体,导入宿主菌体,筛选目的转化子等工作,可分为三个步骤。
宏基因组-PPT
3.开拓天然产物新资源
2000年8月, Brady和 Clardy等人构建了一 个含有约7000000个5个, 并从 其中一个克隆发酵物 中分离出一系列具有 抗菌活性的长链N2酰 基酪氨酸类新化合物 1213
3.开拓天然产物新资源
（2）间接提取法
操作方法：采用物理方法将微生物细胞从环境中分 离出来，然后采用较温和的方法抽提DNA，如先采 用密度梯度离心分离微生物细胞，然后包埋在低熔 点琼脂糖中裂解，脉冲场凝胶电泳回收DNA。 优点：可获得大片段DNA(20—500 kb)且纯度高 缺点：操作繁琐，成本高，有些微生物在分离过程 中可能丢失，温和条件下一些细胞壁较厚的微生物 DNA 也不容易抽提出来。所获得的DNA产率比原位 裂解法少10—100倍
三、宏基因组的应用及研究现状
1.海洋微生物
1、海洋生物活性产物的痕量存在； 2、海洋生物活性物质难于化学合成； 3、产生活性物质的海洋微生物难于人工培养
宏基因组工程与海洋生物学进行有机的结合，促 使人类了解许多为培养海洋微生物的基因组序列 及其功能产物，在海洋天然药物研究、海洋极端 环境微生物研究、海洋微生物多样性探索中具有 十分重要的应用前景。
测序过程: 脱氧核苷酸三磷酸(dNTP) DNA聚合酶↓（能和DNA模板的下一个碱基配对） 添加到测序引物的3’末端 ↓ （释放） 焦磷酸(PPi) ATP硫酸化酶↓加入 APS 特异的检测峰 ↓ ↗ （微弱光检测） ATP→→→→氧化荧光素（产生可见）
加入荧光素
（2）基于功能的筛选方法
以活性测定为基或编码功能蛋白在外源宿主中的表 达 能够在各种选择性平板上通过可见性状筛选的到产 生脂酶、淀粉酶、七叶苷水解酶、甘油脱水酶及抗 菌活性的克隆子
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E.coli 4639221bp p=99% f=20kb/4600kb n=1056.9
p=99% f=10kb/4的外源
DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的
特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA
经反转录形成的cDNA，它们所构成的重组
1976年L.Clark,p)/大小与基因组DNA大小的比值
哺乳动物 3×109kb 若p=99% 平均克隆片段20kb f=20kb/3×109 n=690773.2
常见筛选工具: 探针
狭义: 核酸, 抗体 广义: 还包括其他筛选手段
一、功能筛选
利用目标基因的特定功能进行筛选 • 抗性基因: antibiotics抗性基因, 抗重金属活 性 • 分解基因: 苯环化合物, 分解酶 • 功能活性：杀虫，酶 • 启动子/复制子
Vector
Amp ori
MCS
Tet gene without promoter
以此突变体作为宿主
在野生型的DNA导入后检测回复突变
如 营养缺陷型 相关的基因
二、核酸探针 • 同源DNA探针
高度保守的基因 rRNA基因
邻近种属的相应基因
相应基因的序列比较
• 合成寡核苷酸
蛋白质N-末端aa序列 简并探针degeneracy 选取简并程度低的aa序列
° 根据密码子的使用频率, 合成猜测体探针 ° 设计两组简并探针, 用第二个探针对第一次筛 选的阳性acteria in pure culture is typically the first step in investigating bacterial processes.
standard culturing techniques account for 1% or less of the bacterial diversity in most environmental samples
sequencing of ribosomal RNAs and the genes encoding them was introduced to desnment.
The most startling result of the many microbial diversity studies that have employed 16S RNA culture-independent methods is the richness of the uncultured microbial world.
将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在Tet 平板上筛选抗性菌落, 可得到promoter
其他标记: gfp, Kan
质粒复制单位的克隆 Amp ori
MCS
目标宿主可用的 抗性gene
将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在抗性平板上筛选抗性菌落, 可得到质粒复制单位
• 功能缺失
在获得相应突变体的前提下
a suite of culture-independent techniques are needed to complement efforts to culture the thousands or millions of unknown speci能的话 设计一对, 用PCR产物作探针
三、免疫
在可获得PT后, 制备抗体, 用于筛选
四、高表达基因
高丰度mRNA, 如 用苯肼作了贫血处理的兔网织 红细胞中,血红蛋白mRNA的含量占绝大多数
五(1)、差别杂交 五(2)、扣除杂交
六、mRNA差别显示
Differential display PCR, DD PCR
如无特殊需要(如单个λ phage不能包容靶基因片段 或要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克 多
YAC可用于克隆500kb以上，甚至几Mb的DNA片段
BAC 可减少DNA分子间的重组
DNA
Plasmid λ Phage Cosmid BAC YAC
<10kb 0-23kb ~45kb ~ 100kb ~ 300kb-1.2Mb
粘粒克隆所需的克隆子数是λ phage的一半， 如λ 需700000时，cosmid需350000个
七、酵母双杂交系统
用于分离与某一已知蛋白发生相互作子，该蛋白结合 在gal基因上游激活区(UAS)可启动gal基因的转录
GAL4蛋白：可分为两个区域 DNA-BD: DNA结合域, N-末端 1-147aa AD: 转录激活域， C-末端 768-881aa