宏基因组文库构建

常见筛选工具: 探针
狭义: 核酸, 抗体 广义: 还包括其他筛选手段
一、功能筛选
利用目标基因的特定功能进行筛选 • 抗性基因: antibiotics抗性基因, 抗重金属活 性 • 分解基因: 苯环化合物, 分解酶 • 功能活性：杀虫，酶 • 启动子/复制子
Vector
Amp ori
MCS
Tet gene without promoter


1976年L.Clark, J.Carbon提出了一个完全的基因 文库所需克隆的计算公式
n=ln(1-p)/ln(1-f)
n: 一个完全基因文库所应包含的重组体克隆数
p: 所期望的目的基因在基因文库中出现的几率
f: 插入片段的平均大小与基因组DNA大小的比值
哺乳动物 3×109kb 若p=99% 平均克隆片段20kb f=20kb/3×109 n=690773.2
什么是宏基因组文库？

Obtaining bacteria in pure culture is typically the first step in investigating bacterial processes.

standard culturing techniques account for 1% or less of the bacterial diversity in most environmental samples
sequencing of ribosomal RNAs and the genes encoding them was introduced to describe uncultured bacteria in the environment.

The most startling result of the many microbial diversity studies that have employed 16S RNA culture-independent methods is the richness of the uncultured microbial world.
以此突变体作为宿主
在野生型的DNA导入后检测回复突变
如 营养缺陷型 相关的基因
二、核酸探针 • 同源DNA探针
高度保守的基因 rRNA基因
邻近种属的相应基因
相应基因的序列比较
• 合成寡核苷酸
蛋白质N-末端aa序列 简并探针degeneracy 选取简并程度低的aa序列
° 根据密码子的使用频率, 合成猜测体探针 ° 设计两组简并探针, 用第二个探针对第一次筛 选的阳性克隆子作第二次杂交
将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在Tet 平板上筛选抗性菌落, 可得到promoter
其他标记: gfp, Kan
质粒复制单位的克隆 Amp ori
MCS
目标宿主可用的 抗性gene
将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在抗性平板上筛选抗性菌落, 可得到质粒复制单位
• 功能缺失
在获得相应突变体的前提下
什么是文库？

Library 基因文库（也称DNA文库）是指某一生物体全部或部分基因的集合， 就像一个没有目录的“基因图书馆” 基因文库的组成： 外源DNA片段：研究对象基因组DNA或cDNA 载体：质粒载体（ plasmid ）、黏粒载体（ cosmid ）、人工染色体 （BAC、YAC）等 宿主：大肠杆菌（E.coli）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）
DNA克隆群体，则称之为cDNA基因文库
载体的选择：
可装载的外源DNA
Plasmid λ Phage Cosmid BAC YAC
<10kb 0-23kb ~45kb ~ 100kb ~ 300kb-1.2Mb
粘粒克隆所需的克隆子数是λ phage的一半， 如λ 需700000时，cosmid需350000个
七、酵母双杂交系统
用于分离与某一已知蛋白发生相互作用的 蛋白质基因 GAL4蛋白： 什么是文库？ 酵母半乳糖苷酶基因gal的转录激活因子，该蛋白结合 在gal基因上游激活区(UAS)可启动gal基因的转录
GAL4蛋白：可分为两个区域 DNA-BD: DNA结合域, N-末端 1-147aa AD: 转录激活域， C-末端 768-881aa
E.coli 4639221bp p=99% f=20kb/4600kb n=1056.9
p=99% f=10kb/4600kb n=2116
cDNA文库:
若这些大量的重组DNA分子所含的外源
DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的
特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA
经反转录形成的cDNA，它们所构成的重组
如无特殊需要(如单个λ phage不能包容靶基因片段 或要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克 隆时)一般不采用cosmid，因其在构建文库和贮存
文库比λ phage困难得多
YAC可用于克隆500kb以上，甚至几Mb的DNA片段
BAC 可减少DNA分子间的重组
基因克隆的策略
基因克隆的本质 从文库中筛选目标克隆，重点在“筛选”
什么是宏基因组文库？
从环境样品中直接提取总DNA，经纯化后部 分酶切，然后把这些 DNA 片段连接到载体 上，转化替代宿主细胞，形成一个重组 DNA 文库即宏基因组文库。获得的克隆子 根据宿主细胞获得的新功能进行筛选 , 或用 相关已知序列设计探针或 PCR 引物寻找并 分离目的基因片段，加上表达调控元件后使 目的基因表达，从而获得产物。
• 综合合成
可能的话 设计一对, 用PCR产物作探针
三、免疫
在可获得PT后, 制备抗体, 用于筛选
四、高表达基因
高丰度mRNA, 如 用苯肼作了贫血处理的兔网织 红细胞中,血红蛋白mRNA的含量占绝大多数
五(1)、差别杂交 五(2)、扣除杂交ห้องสมุดไป่ตู้
六、mRNA差别显示
Differential display PCR, DD PCR

a suite of culture-independent techniques are needed to complement efforts to culture the thousands or millions of unknown species in the
什么是宏基因组文库？