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宏基因组文库构建
宏基因组文库构建宏基因组文库构建分子微生物生态学的研究业已证明环境中大量存在未能培养的微生物，某些环境中采用现有培养技术能够培养的微生物不到1%，超过99%的微生物尚未能培养(1)，可见基于微生物分离培养的技术途径开发利用微生物资源受到了极大的限制。
为了突破上述限制，充分挖掘和利用微生物的多样性基因资源，人们在寻找新技术方法上倾注了极大的热情。
“宏基因组（Metagenome）”是由Handelsman等1998年提出的新名词，其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature”，即生境中全部微小生物遗传物质的总和，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和（2 ）。
宏基因组文库既包含了可培养的又包含了未能培养的微生物基因，避开了微生物分离培养的问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间。
目前已采用土壤、海水、海洋浮游生物、海棉、甲虫、人唾液等环境样品成功构建了宏基因组文库，已筛选到的生物活性物质有各种酶类及一些次生代谢产物，包括脂酶/酯酶、蛋白酶、淀粉酶、氧化酶、几丁质酶、核酸酶、膜蛋白、4-羟基丁酸代谢酶系、生物素合成酶系、色素、抗菌抗肿瘤活性物质及抗生素抗性基因等（3、4、5）。
一、实验原理1、基本原理从环境样品中直接提取总DNA，经纯化后部分酶切，然后把这些DNA片段连接到载体上，转化替代宿主细胞，形成一个重组DNA文库即宏基因组文库。
获得的克隆子根据宿主细胞获得的新功能进行筛选, 或用相关已知序列设计探针或PCR引物寻找并分离目的基因片段，加上表达调控元件后使目的基因表达，从而获得产物。
2、载体促使宏基因或基因簇在重组克隆子中表达或提高表达量，载体起着重要作用。
载体的选择主要是针对有利于感兴趣的目标产物基因的表达、目标基因的扩增及在筛选细胞毒类物质时表达量的调控等。
1）大片段插入载体由于很多微生物活性物质是其次生代谢产物，代谢途径由多基因簇调控，尽量插入大片段DNA以获得完整的代谢途径多基因簇是很有必要的。
宏基因组学的PPT
宏基因组学的PPT宏基因组学是通过收集宿主的粪便里的微生物、以及培养皿中的微生物，利用专业的宏基因组技术进行分析。
它能够获得宏基因组信息和相关序列，从而为疾病相关症状的诊断和治疗提供依据。
随着人类健康问题愈演愈烈，为了降低成本，并能通过生物技术进行治疗，研究人员开发了宏基因组学技术。
其通过收集环境中存在的特定细菌，来分析它们在土壤、水源或大气中的分布，以了解它们在整个生态系统中所扮演的角色。
宏基因组学（宏测序法）是一种对人体和环境进行科学评价（包括微生物菌群与疾病之间关系）的工具。
它是一种高通量方法来鉴定微生物群落或疾病（包括寄生虫病等),并用于进行疾病和环境健康状态跟踪和诊断。
虽然宏基因组学可以通过分析病原体来诊断疾病——但目前还没有针对特定微生物群落或某一种病原体开展研究。
1.目的宏基因组学通过收集宿主的粪便和排泄物，以及在培养皿或土壤中的特定微生物群落来检测微生物菌群。
它们在宿主的整个生命周期中都是重要的，并且是许多宿主健康相关问题发生和治疗的潜在因素之一。
通过对宿主宏基因组学数据进行统计分析，可以更好地了解宿主微生物多样性与环境健康状况之间的关系；进而有助于了解宿主肠道微生物及其他微生物群落对人体健康所发挥作用；同时也有助于了解特定微生物群落与其健康状况之间的关系。
此外，还可以通过研究宿主体内微生物种群之间互相作用机制，从而更好地理解宿主微生物群落结构及疾病发生背后原因。
这为人类健康提供了新的见解。
在环境方面，宏基因组学可以从宿主微生物群落中发现与生态系统结构相关、通过检测宿主体内微生物群落来揭示生命现象本质和机制；还可以通过感染或死亡微生物群落以及与宿主相互交互作用规律来揭示微生物群落与疾病发生之间关系：同时宏基因组学还可以为相关研究人员提供研究资源、为治疗提供科学依据。
此外，宏基因组学还能为环境健康状态跟踪和诊断提供参考——为了解环境健康状态和健康风险提供科学依据。
2.方法原理在了解宿主肠道中的微生物群落的组成之后，宏基因组学可以分析宿主的粪便样本。
宏基因组技术在微生物中的应用
❖ 另一类是间接提取法,即异位提取法,是利用离心介质或者 梯度离心等方法先把微生物从环境样品中分离出来,再按处 理纯培养细胞的方法裂解微生物细胞提取DNA。
❖ 该法获得的宏基因组DNA受到胞外杂质污染干扰较少,纯 度较高、DNA完整性好(20kb~大、DNA得率较低,其产率只是直接裂解法的1%~10%,且 获得的DNA往往不能完全代表样品所在生境的生态学 多样性。
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❖ 但是已知功能基因PCR扩增技术筛选法存在2 个主要的缺陷:
❖ (1)引物的设计依赖于已有的序列信息,共同进 化的2个功能相似的基因难于用“族特异性” 引物区分开来,因此很难发现新的功能基因。
❖ (2)通过PCR扩增功能基因,一般只能获得结构 基因的一个片段,而不能获得完整的功能基因。
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宿主细胞的选择
❖ 宿主菌株的选择主要考虑转化效率、重组载体在宿主细胞
中的稳定性、宏基因的表达、目标性状(如抗菌)缺陷型等 因素。 ❖ 研究经验表明不同微生物种类所产生的活性物质类型 有明显差异,不同的研究目标应选择不同的宿主菌株,如 70%的抗生素来源于放线菌,如以寻找抗菌抗肿瘤活性物质为 目标,选择链霉菌为宿主较理想,而筛选新的酶则采用大肠
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非序列依赖性筛选法
❖ 非序列依赖性筛选法,其筛选 法最为常用,原理是直接对目的克隆表达的性状在选择培养 基上进行筛选。该法筛选能够发现全新的活性物质或全长
基因,但工作量大、效率低,生物转化的产物仅在少数情 况下具有可见性状,酶活性的检测受到研究方法的限制。 此外,由于受到酶活检测方法的限制,大多数宝贵的酶资源不 能通过上述基于活性的方法发掘出来。
第17宏基因组技术中占有十分重要的地 位。载体系统的选择主要依赖于DNA提取质量、 插入片段、质粒拷贝数、宿主菌库、噬菌体类 载体。第18页，本讲稿共34页
宏基因组-PPT
Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Saccharomyces
2.环境保护和污染修复
挖掘降解基因和功能菌株，进行生物修复 获取任何序列的基因或功能，由此合成新物质或发 现新的生物物种。 发掘极端环境为生物的新物种，了解其耐受机制， 帮助极端环境的污染修复。 从宏基因组中分离的重要基因元件组编成具有其他 活性成分、或可降解污染物功能的基因簇，以替代 原有不易降解化合物，或直接降解环境中石油烃、 有害有害化合物、重金属。
（1）基于序列的筛选方法
②.焦磷酸测序( Pyrosequencing)
焦磷酸测序技术是在焦磷酸盐测序法的基础 上结合一种乳胶材料和皮升级反应孔，将基因组 DNA 进行随机切割，批量地进行整个测序反应， 能够在相同的时间内破译 6×106组以上的基因组 序列，比 Sanger法要快100倍，提高了测序的效 率。
底物诱导基因 表达法SIGEX screening
1.样品中DNA的提取和富集
采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出 环境样品中的DNA，又要保持较大的片段以 获得完整的目的基因或基因簇。所以提取原 则是在最大提取量和最小剪切力之间折中 常用的提取方法有直接裂解法和间接提取法 (细胞提取法)
3.开拓天然产物新资源
2000年8月, Brady和 Clardy等人构建了一 个含有约7000000个5个, 并从 其中一个克隆发酵物 中分离出一系列具有 抗菌活性的长链N2酰 基酪氨酸类新化合物 1213
宏基因组及其应用
宏基因组及其应用学习笔记吕涛15010906一、宏基因组及宏基因组学1.概念宏基因组( Metagenome)（也称微生物环境基因组Microbial EnvironmentalGenome, 或元基因组）是由Handelsman 等1998 年提出的新名词，其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature” , 即环境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
2.宏基因组学宏基因组( Metagenome)（也称微生物环境基因组Microbial EnvironmentalGenome, 或元基因组）是由Handelsman 等1998 年提出的新名词，其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature” , 即环境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
3.发展历程环境基因组学——微生物基因组学——宏基因组学——人类基因组学人类基因组学：把人体内所有微生物菌群基因组的总和称为“人体宏基因组”(humanmetagenome)。
人类宏基因组学(human metagenomics)研究人体宏基因组结构和功能、相互之间关系、作用规律和与疾病关系的学科。
它不仅要把总体基因组序列信息都测定出来，而且还要研究与人体发育和健康有关的基因功能。
人类宏基因组计划目标是：把人体内共生菌群的基因组序列信息都测定出来，而且要研究与人体发育和健康有关的基因功能。
4.研究步骤5.研究方法二、宏基因组学的应用1.水体宏基因组学●海表层水样为研究海洋生命的代谢潜力和海洋生态学提供了前所未有的原始素材；海洋蕴藏着巨大的生物多样性和复杂性，宏基因组学将极大地促进人们对他的认识。
宏基因组技术的原理及应用
宏基因组技术的原理及应用简介宏基因组技术（Metagenomics）是一种研究环境中各种微生物群落的遗传信息及功能性基因的技术。
它能够快速、高效地分析和描述海量的微生物基因组数据，为微生物研究提供了一种全新的方法。
原理宏基因组技术的核心原理是通过直接从环境样品中提取微生物的DNA或RNA，而不是通过培养分离的方式来研究微生物群落的遗传信息。
其主要的实验过程包括：样品采集、DNA/RNA提取、建立文库、高通量测序等。
样品采集宏基因组技术的第一步是采集环境样品。
样品的选择是非常重要的，因为不同的环境中会存在不同的微生物群落。
常见的样品包括土壤、水体、肠道等。
DNA/RNA提取样品采集完毕后，需要对样品进行DNA/RNA提取。
提取方法会根据样品的不同进行相应的调整。
DNA/RNA提取的质量和效果直接影响后续的实验结果。
建立文库提取到的DNA/RNA需要进行文库的构建。
文库是指将DNA/RNA样本转化为可供测序的DNA文库。
文库建立的方法也有多种，例如PCR扩增、文库构建试剂盒等。
高通量测序文库建立完成后，需要进行高通量测序。
高通量测序可以快速、平行、高效地测定众多微生物群落中的DNA/RNA序列信息。
常见的测序方法有Illumina HiSeq、Ion Torrent等。
应用宏基因组技术在各个领域都有广泛的应用，下面列举几个常见的应用。
生态学研究宏基因组技术可以帮助研究者深入了解生态系统中微生物群落的组成结构以及其功能。
通过对环境样品进行宏基因组测序，可以获得丰富的微生物遗传信息，进而揭示微生物在生态系统中的功能和相互作用。
疾病研究宏基因组技术在疾病研究方面也有着重要的应用。
通过对人体肠道微生物的宏基因组测序，可以揭示人体肠道微生物群落的组成与变化，进而探索某些疾病与微生物群落的关联。
发现新基因宏基因组技术也为发现新基因提供了新的途径。
通过宏基因组测序，可以获得大量未知序列，并通过对这些未知序列的分析和比对，发现新的功能性基因。
宏基因组
一、宏基因组简介
1.产生背景
❖ 人类基因组计划(human genome project，HGP)的 完成，从结构基因组学进入以功能性基因组研究为 主的后基因组时代
❖ 人体的生理代谢和生长发育不仅受自身基因控制， 还与其他生物基因组相关。已证明体内菌群的组成 和活动与人的生长发育、生老病死息息相关。
❖ 优点：操作容易、成本低、DNA提取率高、重复性 好
❖ 缺点：纯度低，腐植酸等污染严重，还需要经过纯 化处理才能满足后续分子生物学操作的需要。此外， 由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小 (1—50 kb) )且多为平端，不利于建库。
（2）间接提取法
❖ 操作方法：采用物理方法将微生物细胞从环境中分 离出来，然后采用较温和的方法抽提DNA，如先采 用密度梯度离心分离微生物细胞，然后包埋在低熔 点琼脂糖中裂解，脉冲场凝胶电泳回收DNA。
❖ 要想了解生命的起源、本质、进化和相互作用及影 响，就必须对彼此密切相关的生物进行各个基因组 学及其相互关系的研究。
2.宏基因组（广义）
❖ 广义宏基因组是指特定环境下所有生物 遗传物质的总和，它决定了生物群体的 生命现象。它是以生态环境中全部DNA 作为研究对象，通过克隆、异源表达来 筛选有用基因及其产物，研究其功能和 彼此之间的关系和相互作用，并揭示其 规律的一门科学
10
λphage
24
Cosmid,fosmid 35~45
BAC
120~300
PAC
100~300
YAC
250~2000
MAC
>1000
Vector structure
Expresslion hosts
宏基因组学的研究及其应用
宏基因组学的研究及其应用随着科技的不断进步，人类对于自然界的认识也在不断深入。
过去，我们只能通过显微镜观察到微生物的形态，而现在，我们可以通过先进的宏基因组学技术去研究微生物的DNA序列，从而了解生物界的更多信息。
宏基因组学已经成为了生物学及相关领域的研究热点，其在医学、环境监测、生态等方面应用广泛。
宏基因组学的研究方法宏基因组学是指研究环境样本中微生物群落的基因组学方法。
这是一项高通量技术，可以通过对微生物DNA的特定放大和测序来获取标准化数据，然后进行基因学分析。
在样本收集方面，一般采用一个高通量的DNA提取技术，以提取环境样本中的微生物群体中的基因组DNA。
DNA样本可以来自各种样本类型，如土壤、海洋、河流、水、气溶胶以及植物和动物等。
DNA提取和测序之后，需要对数据进行清洗、去除噪声、组装基因组和注释等复杂的分析流程。
这些数据分析工具需要依赖高级计算机科技，如云计算、高效算法、人工智能等。
宏基因组学在医学上的应用宏基因组学技术在医学上的广泛应用主要是通过研究微生物群落来了解人体内的微生物组成，从而促进人类健康的改善。
例如，人类肠道的微生物组成与许多人类疾病都有关系，包括肥胖症、炎症性肠病、癌症等等。
通过宏基因组技术，我们可以了解不同人体的微生物群落组成差异，并发展出一些治疗方案，以改善人类健康。
除了以上的应用，宏基因组技术在药物研发方面也有着广泛的应用。
许多药物的研究及开发需要使用大量的微生物，而宏基因组技术可以对微生物的基因组信息进行更深入的研究，以便更好地了解微生物的生理机制，并且开发出更有效的药物。
宏基因组学在环境研究上的应用宏基因组学技术在环境研究中的应用也是非常广泛的。
对于环境保护和治理，我们需要了解微生物对于气候变化和污染的反应，以便更好地处理环境问题。
例如，通过宏基因组技术可以了解微生物在水体中的变化及其对不良污染的反映，从而开发出更为高效的治理方案。
另外，宏基因组技术在农业生产中也有着重要的作用。
浅谈宏基因组学的应用
浅谈宏基因组学的应用宏基因组学由Handelsman和Rodon于1998年首次提出，并成为研究复杂的肠道微生物群落的另一种DNA测序方法。
它旨在对样本中提取的所有DNA进行随机测序，并对一个群落的所有基因进行分析，即环境中所有微生物基因组的总和。
以粪便样本的宏基因组学为例，首先从粪便样本中提取所有微生物的总DNA。
在测序之前，总DNA样本通过“鸟枪法（shotgun）”对总DNA样本进行随机剪切。
之后，对综合序列进行分析，以获得基于系统发育标记（16S rDNA）的物种图谱或基于全基因组的基因组图谱[1]。
宏基因组的分析流程主要包括环境样本收集、宏基因组DNA提取、文库准备、测序、DNA序列分析。
宏基因组测序的应用不胜枚举，本篇文章就一些方面介绍宏基因组的应用。
01宏基因组在微生物监测方面的应用1.1公共卫生的传统病原体监测现有的公共卫生病原体监测方法包括对特定病原体的主动筛查，如CRE、MRSA以及VRE等，或是基于感染事件或医院特定病房相关病原体的监测。
当环境污染物在流行病学上与疫情调查有关时，对空气、水和表面进行有针对性的采样，以确定潜在的来源。
来自疫情调查的培养分离株通常接受各种分型，如多点序列分型（MLST），以确定疾病传播途径。
因此，需要各种各样的实验室技术、设备、试剂和相关专业技能人员在医院对已知的人类病原体子集进行监测。
社区病原体监测主要在医院、净水厂和农场进行，并有多种方法，表1列举了一些传统的监测方法。
ELISA, enzyme-linked immunosorbant assay, 酶联免疫吸附实验; MAST, multi-antigen sequence typing, 多抗原序列分型; MLVA, multiple locus variable-number tandem repeat analysis, 多基因座可变数目串联重复序列分析; NAATs, nucleic acid amplification tests, 核酸扩增实验; PFGE, pulse-field gel electrophoresis, 脉冲场凝胶电泳; RT–PCR, Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，逆转录聚合酶链反应; WGS, Whole Genome Sequence, 全基因组测序。
宏基因组的原理及应用
宏基因组的原理及应用1. 宏基因组的定义宏基因组，也被称为环境基因组，是指利用高通量测序技术对环境样品中的全部基因组进行测序和分析的一种方法。
与传统的基因组学研究关注单个生物个体的基因组不同，宏基因组研究旨在了解整个环境中微生物群落的遗传信息。
2. 宏基因组的测序技术2.1 16S rRNA测序宏基因组研究的一个重要方法是对16S rRNA基因进行测序。
16S rRNA是细菌和古细菌中高度保守的基因，具有高度变异的区域和保守的区域。
通过对16S rRNA基因进行测序和比对分析，可以对微生物群落的组成和丰度进行研究，并推测不同微生物的功能和相互作用关系。
2.2 全基因组测序全基因组测序是另一种常用的宏基因组研究方法。
通过对环境样品中微生物的全部基因组进行测序，可以获取更全面的遗传信息。
全基因组测序可以用于研究微生物的种类组成、基因编码功能以及潜在的生物合成能力等。
3. 宏基因组的分析流程宏基因组的分析流程主要包括样品采集、DNA提取、测序、数据处理和结果分析等几个步骤。
3.1 样品采集样品采集是宏基因组研究的第一步，根据研究目的选择合适的环境样品，如土壤、水样、肠道内容物等。
样品采集过程需要注意避免外源性DNA污染，并保证样品的代表性和多样性。
3.2 DNA提取DNA提取是宏基因组研究的关键步骤，可以使用商用的DNA提取试剂盒，也可以根据具体情况选择自制的提取方法。
提取得到的DNA需要经过质量检测来评估DNA的纯度和完整性。
3.3 测序宏基因组的测序通常采用高通量测序技术，如 Illumina HiSeq、PacBio SMRT等。
测序过程中需要进行质量控制和序列拼接，以获得高质量的宏基因组序列数据。
3.4 数据处理宏基因组测序生成的数据通常包含大量的序列信息，需要经过一系列的数据处理步骤来处理和分析。
常见的数据处理包括去除低质量序列、去除冗余序列、比对序列到参考数据库、聚类序列到操作单元（OTU）等。
宏基因组的构建及应用ppt课件
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PS：
通过DNA微阵列技术(基因芯片技术)寻找环境基 因组序列中的有用片段也是一种全新的筛选技 术，它可以快速有效的识别和描述许多菌落的 特征，并可应用于大量保守基因的分离。基于 序列的筛选策略可以利用基因芯片技术大大提 高筛选效率，有可能筛选到某一类结构或功能 的蛋白质中的新分子，但必须对相关基因序列 有一定的了解，较难发现全新的活性物质。
在水体中的应用： 海洋蕴涵着非常丰富的微生物资源，目前已应用宏基因组 技术研究了多种海洋次生代谢产物合成途径，其中最为经 典的是研究海洋聚酮类和非核糖体肽类的生物合成基因簇。
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2 、在新型生物催化剂中的应用
新型催化剂主要是酶。传统的新型酶的筛选方法限 制了筛选的广泛性和有效性。宏基因组学则克服了 这一限制，有效地提高了新酶的筛选效率。 现已发现了抗生素及维生素生物合成相关基因簇的 克隆，以及水解酶类和氧化还原酶类编码的基因。 宏基因组技术通过对环境的直接克隆，为研究和利 用占微生物99％以上的非培养微生物提供了新的途 径，为微生物的研究和发展提供了全新的策略。
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1 、在生态学方面的应用
宏基因组在生态学上的应用主要是土壤与水体。
目前其在土壤微生物研究中的应用主要包括两方面： 一、进行土壤微生物及其资源的挖掘。目前的研究工作已经 得到大批新基因，特别是在一些极端环境中的微生物宏基 因组的研究中得到了一些具有特殊应用价值的功能酶基因 二、揭示土壤微生物的多样性及其与环境之间的关系。
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3 序列驱动的筛选
序列驱动的筛选(Sequence-driven screening)是根 据已知功能的基因序列设计探针或PCR引物， 通过核酸杂交或PCR扩增来筛选具有目标序列 的克隆子。 优点：不依赖克隆基因在宿主菌株中的表达。 缺点：必须对即未知基因)。
宏基因组文库构建
高丰度mRNA, 如 用苯肼作了贫血处理的兔网织 红细胞中,血红蛋白mRNA的含量占绝大多数
五(1)、差别杂交
五(2)、扣除杂交 六、mRNA差别显示
Differential display PCR, DD PCR
七、酵母双杂交系统
用于分离与某一已知蛋白发生相互作用的 蛋白质基因
GAL4蛋游激活区(UAS)可启动gal基因的转录
Metagenomics Defined
Metagenomic technology has been successful at all scales—it has been used to study single genes, pathways, organisms, and communities.
• 分解基因: 苯环化合物, 分解酶
• 功能活性：杀虫，酶 • 启动子/复制子
Vector
Amp ori
MCS
Tet gene without promoter
将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在Tet 平板上筛选抗性菌落, 可得到promoter
其他标记: gfp, Kan
质粒复制单位的克隆
• 合成寡核苷酸
蛋白质N-末端aa序列
简并探针degeneracy 选取简并程度低的aa序列
°根据密码子的使用频率, 合成猜测体探针
° 设计两组简并探针, 用第二个探针对第一次筛 选的阳性克隆子作第二次杂交
• 综合合成
可能的话 设计一对, 用PCR产物作探针
三、免疫
在可获得PT后, 制 phylogenetic diversity of uncultured microorganisms is only the first step.
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3.开拓天然产物新资源
2000年8月, Brady和 Clardy等人构建了一 个含有约7000000个5个, 并从 其中一个克隆发酵物 中分离出一系列具有 抗菌活性的长链N2酰 基酪氨酸类新化合物 1213
3.开拓天然产物新资源
（2）间接提取法
操作方法：采用物理方法将微生物细胞从环境中分 离出来，然后采用较温和的方法抽提DNA，如先采 用密度梯度离心分离微生物细胞，然后包埋在低熔 点琼脂糖中裂解，脉冲场凝胶电泳回收DNA。 优点：可获得大片段DNA(20—500 kb)且纯度高 缺点：操作繁琐，成本高，有些微生物在分离过程 中可能丢失，温和条件下一些细胞壁较厚的微生物 DNA 也不容易抽提出来。所获得的DNA产率比原位 裂解法少10—100倍
三、宏基因组的应用及研究现状
1.海洋微生物
1、海洋生物活性产物的痕量存在； 2、海洋生物活性物质难于化学合成； 3、产生活性物质的海洋微生物难于人工培养
宏基因组工程与海洋生物学进行有机的结合，促 使人类了解许多为培养海洋微生物的基因组序列 及其功能产物，在海洋天然药物研究、海洋极端 环境微生物研究、海洋微生物多样性探索中具有 十分重要的应用前景。
测序过程: 脱氧核苷酸三磷酸(dNTP) DNA聚合酶↓（能和DNA模板的下一个碱基配对） 添加到测序引物的3’末端 ↓ （释放） 焦磷酸(PPi) ATP硫酸化酶↓加入 APS 特异的检测峰 ↓ ↗ （微弱光检测） ATP→→→→氧化荧光素（产生可见）
加入荧光素
（2）基于功能的筛选方法
以活性测定为基或编码功能蛋白在外源宿主中的表 达 能够在各种选择性平板上通过可见性状筛选的到产 生脂酶、淀粉酶、七叶苷水解酶、甘油脱水酶及抗 菌活性的克隆子