宏基因组

Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Saccharomyces
linear
mammalia
3.宿主系统的选择
❖ 在构建文库的过程中，细菌、酵母、链霉菌等为主要的宿主。 不同的宿主所产生的活性物质有明显的差异，目前构建的文 库如果筛选新的酶，采用大肠杆菌为宜；若是抗菌抗肿瘤物 质，选择链酶菌为宿主较为理想。
10
λphage
24
Cosmid,fosmid 35~45
BAC
120~300
PAC
100~300
YAC
250~2000
MAC
>1000
Vector structure
Expresslion hosts
circular linear circular circular circular linear
欲插入目的片段的大小 所需要的载体拷贝数 使用的宿主 筛选方法
❖ 载体的选择要有利于目的基因的扩增、表达 及在筛选细胞中目标物质的表达量的调控等。
Comparison of different clone vectors
Cloning vectors
Size of inser segments
plasmid
❖ 要想了解生命的起源、本质、进化和相互作用及影 响，就必须对彼此密切相关的生物进行各个基因组 学及其相互关系的研究。
2.宏基因组（广义）
❖ 广义宏基因组是指特定环境下所有生物 遗传物质的总和，它决定了生物群体的 生命现象。它是以生态环境中全部DNA 作为研究对象，通过克隆、异源表达来 筛选有用基因及其产物，研究其功能和 彼此之间的关系和相互作用，并揭示其 规律的一门科学
入模式微生物建立各自的无性繁殖系 ❖ 对宏基因组文库的DNA进行分析
环境样品Environment samples 富集培养Enrichment Cultivation
DNA提取 DNA isolation
载体插入Vectors Biblioteka Baiduigation 插入寄主Insert into the host
小片段插入Small size (plasmid)
为什么要研究宏基因组学呢？
❖ 99%以上的微生物未 (难 )被纯培养, 对微生 物世界的认识集中在不到1%的微生物上
❖ 人们对微生物的认识主要基于实验室纯培养 的单一微生物物种,对微生物群落作为整体的 功能的认识远远落后于对其个体的认识
二、宏基因组的研究步骤
❖ 分离特定环境生物DNA ❖ 纯化大分子量DNA进行克隆 ❖ 将带有宏基因组DNA的载体通过转化方式转
1 宏基因组简介 2 研究步骤 3 应用及研究现状
一、宏基因组简介
1.产生背景
❖ 人类基因组计划(human genome project，HGP)的 完成，从结构基因组学进入以功能性基因组研究为 主的后基因组时代
❖ 人体的生理代谢和生长发育不仅受自身基因控制， 还与其他生物基因组相关。已证明体内菌群的组成 和活动与人的生长发育、生老病死息息相关。
❖ 常用的提取方法有直接裂解法和间接提取法 (细胞提取法)
（1）直接裂解法
❖ 操作方法：将环境样品直接悬浮在裂解缓冲液中处 理，继而提取DNA并纯化，包括：
➢ 物理法(如冻融法、超声法、玻璃珠击打法、液氮研磨法) ➢ 化学法（常用化学试剂有表面活性剂、盐类、有机溶剂）
➢ 酶裂解法（加入裂解酶、蛋白酶K 和溶解酶等）
❖ 优点：操作容易、成本低、DNA提取率高、重复性 好
❖ 缺点：纯度低，腐植酸等污染严重，还需要经过纯 化处理才能满足后续分子生物学操作的需要。此外， 由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小 (1—50 kb) )且多为平端，不利于建库。
（2）间接提取法
❖ 操作方法：采用物理方法将微生物细胞从环境中分 离出来，然后采用较温和的方法抽提DNA，如先采 用密度梯度离心分离微生物细胞，然后包埋在低熔 点琼脂糖中裂解，脉冲场凝胶电泳回收DNA。
大片段插入Large size (Cosmid,Fosmid,BAC,YAC)
构建宏基因组文库construct matagenomic libraries
文库筛选Library screening
功能驱动法 Function–driven
screening
序列分析法 Sequence-driven
❖ 宿主菌株的选择主要考虑：
1 转化效率
2 重组载体在宿主细胞中的稳定性 3 宿主能否提供必需的转录表达体系
4 对异源表达基因产物是否有较强的相容性
5 目标性状(如抗菌性) 6
4.宏基因组文库的筛选
❖ 筛选技术大致可分为四类： ①基于核酸序列差异分析； ② 基于目的克隆功能的特殊代谢活性； ③基于底物诱导基因的表达； ④ 基于包括稳定性同位素和荧光原位杂交在内
screening
底物诱导基因 表达法SIGEX
screening
其它方法 Compound Configuration screening
1.样品中DNA的提取和富集
❖ 采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出 环境样品中的DNA，又要保持较大的片段以 获得完整的目的基因或基因簇。所以提取原 则是在最大提取量和最小剪切力之间折中
3.宏基因组（狭义）
❖ 狭义宏基因组学则以生态环境中全部细 菌和真菌基因组DNA作为研究对象，它 不是采用传统的培养微生物的基因组， 包含了可培养和还不能培养的微生物的 基因，通过克隆、异源表达来筛选有用 基因及其产物，研究其功能和彼此之间 的关系和相互作用，并揭示其规律
4.宏基因组学
❖ 宏基因组学是一种基于无需预先培养来利用 环境样品基因组资源，获得活性物质和功能 基因的新技术，因而绕过了菌种纯培养障碍， 可直接从自然界获取遗传信息，极大拓宽了 微生物资源的利用空间，正成为国际生命科 学研究最重要的热点之一
❖ 优点：可获得大片段DNA(20—500 kb)且纯度高
❖ 缺点：操作繁琐，成本高，有些微生物在分离过程 中可能丢失，温和条件下一些细胞壁较厚的微生物 DNA 也不容易抽提出来。所获得的DNA产率比原位 裂解法少10—100倍
2.载体选择
❖ 载体系统的选择取决于所提取土DNA 的质量 及研究目的，需要考虑：