挑战杯稿件314

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-1亲和素间接包被法测定血清 PSA 方法学研究黄媛苑博张蝶林曦阳金花指导教师李会强邸宝华张晓昊（天津医科大学医学检验学系，天津，300203）[摘要] 目的：以双抗体夹心测定血清 PSA 为例，探讨生物素化牛血清白蛋白间接包被技术应用于酶联免疫吸附试验中的可行性及实用价值。方法：包被生物素化牛血清白蛋白并通过生物素连接链霉亲和素，形成间接包被链霉亲和素反应板。测定时加入生物素化抗 PSA 抗体和待测血清，再加入酶标记抗 PSA抗体，充分反应后，洗涤后加酶底物显色并测定光密度值。通过棋盘滴定确定最佳抗体浓度，并对不同反应模式.时间等因素进行选择。结果：本方法用于测定血清 PSA 水平的灵敏度为 0.52ng/ml,批内变异小于10％，批间变异在11％以内，回收率在95％-105％之间，方法具有良好稳定性和特异性。结论：此间接包被技术可以替代传统的 ELISA 直接包被技术，减少包被抗体用量，降低试剂成本，适合临床应用。

[关键词] 前列腺特异抗原；生物素化牛血清白蛋白；生物素avidin system Enzyme Immunoassay for Detection of PSA in Serum[Abstract] To establish a new biotin-avidin lified enzyme immunoassay for detection of PSA in serum.The test was designed as a solid-phase, double-antibody, sandwich assay in which plates were coated with biotinylation

bovine serum albumin and avidin-enzyme-linked. The plates were associated with the antibody which was a biotin-labeled. At the same time, antigen-antibody reaction was in liquid-phase, thereby, to raise reaction rate and to enlarge assaying range of PSA in serum as well as decrease hook effect. The test could reduce applied amount of coating bodies and cost. The test is better specificity, reproducibility and stability of kit, and suited clinical applications.[Key Words] PSA; Biotinylation of Bovine Serum Albumin; Biotin-avidin System; ELISA-2抗原-酶标记抗体的复合物。未结合的物质通过洗涤去除。加入显色底物并显色，通过测量光密度的变化来判断标本中抗原的浓度。这种传统模式的 ELISA 存在其固有缺陷，主要表现为：其一，抗体包被微孔板采用直接包被法，抗体分子非特异性吸附于聚苯乙烯上实现固化过程。这种模式简便易行，但由于抗体分子直接与聚苯乙烯结合，抗体分子于固相材料表面的空间构象带有很大随机性，导致抗体分子利用率很低，浪费抗体，增加试剂成本。此外，无效抗体分子占用固相表面的有限面积，导致抗体包被量不足，影响试验方法敏感度和检测范围。其二，由于固相吸附包被模式，抗体分子被涂布于固相材料表面，不同于液相状态分子。一步法 ELISA 是将待测抗原和酶标记抗体同时加入微孔版内。抗原分子同时与固相抗体.酶标记抗体反应，

形成双抗体夹心复合物。但是，抗原分子与包被抗体反应为液相-固相反应，而抗原分子与酶标记抗体反应属于液相-液相反应。由于前者反应速率小于后者反应速率，当标本中抗原含量过高时，导致不能形成双抗体夹心复合物，不与固相抗体反应。此时，虽然待测抗原含量很高，却没产生较高的检测信号，这种现象称为“钩状效应” 。以上缺陷严重影响该技术的应用，血清 PSA 测定也不例外。改进抗体包被法，建立新型 ELISA 测定方法具有重要意义。-3亲和素为基础的间接包被模式，并以检测血清 PSA 为例进行方法学研究及评价，研究取得了较好的结果，现报道如下：材料与方法1 实验材料及实验仪器

1.1 实验材料进口聚苯乙烯板美国 COSTAR生物素标记牛血清白蛋白(BBC)

沃克生物公司提供链霉亲和素(SA)

Sigma 产品生物素标记抗 PSA 抗体（B-McAb-1A5 ）沃克生物公司提供PSA 标准品（PSA-STD）沃克生物公司提供酶标记抗PSA 抗体（PcAb-HRP）沃克生物公司提供辣根过氧化物酶底物（显色液 A/B）沃克生物公司提供0.1N 硫酸溶液（终止液）沃克生物公司提供生物素标记抗体稀释液（0.1M PBS-酶稳定剂）

自己配制酶标记抗体稀释液（0.1M PBS-抗体稳定剂）自己配制

1.2 实验仪器HZQ-C 空气浴震荡器哈尔滨东明医疗仪器厂Multiskan-MK3 酶标分析仪 Thermo electron corporation隔水

式电热恒温水浴箱上海跃进医疗器械厂微量加样器 Effendorf2 实验方法

2.1 BBC 包被技术 BBC 包被技术属于一种间接包被技术，其基本过程为：制备生物素标记牛血清白蛋白，通过常规方式进行包被酶标反应板，链霉亲和素通过牛血清白蛋白分子上的生物素结合并固定于固相材料表面。经测试结果显示微孔板的稳定性和均一性能够达到技术要求。此技术正在申报专利，本研究不做重点讨论。

2.2 新型检测模式的建立确定基础反应模式：保持传统 PSA 检测方法的反应时间.温度及加样量。⑴ 根据用量取出亲和素包被的酶标反应板条及其它试剂，平衡至室温。

⑵ 微孔板内加入50 μl 标准品或待测样品，同时加50 μl 入生物素标记抗-4反应曲线的线性于不同实验日分别测定标准曲线的线性，用四参数数学模型拟和，计算剂量-反应曲线相关系数（r ）。-56B1:20001:40001:8000Ab-

HRP1:10001:20001:40001:10001:20001:40001:10001:20001:4000 0 0.071 0.051 0.047 0.053 0.063 0.046 0.050 0.051 0.0542 0.333 0.223 0.126 0.299 0.237 0.126 0.260 0.173 0.11310

0.746 0.459 0.459

1.015 0.673 0.419 0.841 0.522 0.37525

1.309

1.123 0.900