答辩论文-脂质体介导的CHO细胞转染

（二）脂质体制备
1.脂质体简介 脂质体是由脂质双分子层组成的，不同组成的脂质体其表面电性会 不同，表面电荷为阳性、阴性和中性的脂质体对细胞的转染频率也 会有差别。其中阳离子脂类起主要作用，通过静电作用与DNA形成 DNA-脂复合体，并引导DNA进入细胞





2.脂质体的制备方法 脂质体的制备主要有超声波法、磷脂酰丝氨酸Ca2+离子融合法和逆 相蒸发等，用超声波法可制备的单层或多层脂质小体能向细胞内引 入的物质量少，故常用后两种方法制备大的脂质体。 3.脂质体介导转染的机制 阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将 DNA分子包裹入内，形成DNA-脂复合体，也能被表面带负电荷的细 胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞食、作用进入溶酶体。 内吞后DNA-脂复合体在细胞内形成包涵体，在DOPE作用下，细胞 膜上的阴离子脂质因膜的不稳定而失去原油的平衡扩散进入复合体， 与阳离子脂质中的阳离子形成中性离子对，使原来与脂质体结合的 DNA游离出来，进入细胞质，进而通过核孔进入细胞核，最终进行 转录并表达。 4.增加转染效率的添加剂 脂质体-DNA复合体中加入一些阴离子物质促进复合体与细胞膜的融 合或DNA的释放。DNA与脂质体混合前预先用磷酸盐缓冲液处理。 硫酸精蛋白通过精蛋白分子中精氨酸残基浓缩质粒DNA来增加转染 率。Ca2+能促进膜对DNA-脂质体的吸收。
脂质体介导的CHO细胞转染
——脂质体介导的基因真核细胞转染
指导老师：XX 班级：生物2班 姓名：XX
一
二
三
四 五
内容简介 实验材料 实验方法 实验结果分析 结论


一 内容简介
转染就是让外源核酸进入真核细胞中。如今广义的转染不单包括了 DNA、RNA，还有蛋白质等生物大分子。核酸转染技术在21世纪60年 代末和70年代初期已经建立。 常用的转染方法有:磷酸钙法、DEAE一葡聚糖法、电穿孔法(电击基 因导人法)、脂质体转染法，另外还有细胞核的直接微注射法、Pol 沙rene介导的外源DNA导入培养细胞可分为瞬时转染和稳定转染。 本实验将采用脂质体转染法转染宿主细胞。 Lipofectamine™ 2000转染试剂是一种阳离子脂质体,在体外可以转 染许多种哺乳动物细胞，对各类细胞系都可提供最高的转染效率， 具有高效性和操作步骤简单的优点。






二
实验材料

1.细胞系 中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO) 2.试剂 脂质体LipofectaminerM2000；G418；台盼蓝，储存浓度4％，使 用浓度0．4％；固定液：4％多聚甲醛甘氨酸漂洗液：IOOmM／L， 用DPBS配制冲洗液：DPBS，每升溶液中含CaCl2 O．109、KCl 0．209、MgCl2· 6H20 O．109，NaCl 8．009、Na2H· 71120 2．169调节pH7．4，4“C保存。封闭液：5％正常山羊血清抗荧光 淬灭封片剂 3.药品 青霉素、链霉素；胎牛血清；③D-Hank’s：每升溶液中含NaCI 89、 KCl0．49、 Na2HP040．069、l(IL]2P040．069、NaHC030．359。 ④双抗：以PBS或D-Hank‘s配制，过滤除菌；抗体稀释液；抗PrP单 抗BEl2；羊抗小鼠IgG。

谢谢！


五 结论
在本实验中，在带有加强型绿色荧光蛋白报告基因pEFGFP-Ni真核 表达载体的基础上，我们成功构建了pEGFP-OvPrP真核表达载体， 并利用阳离子脂质体转染试剂成功转染至，获得了携带加强型绿色 荧光蛋白的重组绵羊PrP的CHO细胞的克隆．转染效率达69．27％。 成功构建了CHO细胞培养基及完成了CHO细胞的培养，并利用脂质 体转染试剂转染子cHO细胞中，成功表达了全长的重组绵羊EGFPPrP，得到了稳定表达绵羊PrP基因的CHO细胞系。对此细胞系的进 一步研究发现。外源导入CHO的绵羊PrP可以在CHO中稳定表达。
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4.培养基 DMEM培养基，无血清opti．MEM，Gibeo 5.实验仪器 ①细胞用倒置显微镜 ②医用超净工作台 ③C02细胞培养箱 ④OliymptB倒置荧光显微镜；激光共聚焦扫描显微镜(FV500) ⑤超低温冰柜：．80 CULT Freezer 702 ⑥高速离心机 ⑦冷冻台式离心机 ⑧全自动高压锅 ⑨DK．8D电热三相恒温水槽


三
实验方法


（一）CHO细胞制备 1. CHO细胞简介 CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞 系。 其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别：动物细胞 比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适 应环境能力差；倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时 需用抗生素；培养过程需氧量少（氧传质系数kla大于10h-1即可满 足每毫升107个细胞的生长）；培养过程中细胞相互粘连以集群形式 存在；原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡；代谢产物具有生物 活性，生产成本高，但附加值也高。 2. DMEM培养基组成 将一袋培养基全部倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养 基洗下，并入容器。加注射用水（水温20~30℃）到950毫升，轻微 搅拌溶解。 加入2.438克碳酸氢钠 轻微搅拌溶解，加注射用水至一升 用1mol\L氢氧化钠溶液或1mol\L盐酸溶液调ph至所需值 用0.2um滤膜正压过滤除菌 溶液应在2℃~8℃下避光保存

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三 实验结果
荧光显微镜、光学显微镜观察 转染后24h在荧显微镜下观察转染效果，并计算转染效率。因为我们 所构建的真核表达载体含有GFP绿色荧光蛋白报告基因，如果转染成 功，被转染基因得到表达。在荧光显微镜下可看到绿色荧光，否则。 不产生绿色荧光．

对脂质体介导的质粒转染在不同的时间段观察，正常CHO 细胞成圆形或椭圆，有的呈不规则三角形，细胞生长良 好、饱满。转染8h后，个别细胞边缘不整齐，高倍镜下 可见胞质那内有颗粒状物。转染绵羊PrP 24h后，有的细 胞表面出现空洞，这些细胞随时间延长，细胞体积变小。 皱缩。最后悬浮在培养液中死亡。转染空质粒的细胞和 只加脂质体的细胞无明显变化 2.转染效率计算 直接在荧光显微镜下随机采三个视野，计算发绿色荧光 的细胞数占总细胞数的百分率即为转染效率。 计算公式：转染效率(％)=(三个视野发绿色荧光的细胞 总数)／(三个视野总细胞数)×100。 空载体和pEGFP-OvPrP的转染效率大于65％，表示在同一 倍数下，同一视野下明场与荧光背景下转染空载体、 pEGFP-OvPrP的细胞重合图，从图片可以看出，各质粒 DNA的转染效果良好。


（三）脂质体转染
转染前24h，以胰蛋向酶消化CHO．接种于24孔细胞培养板中，转染 前细胞达到95％融合。 最佳DNA和脂质体转染比例确定：根据DNA和lipofeetamine2000的比 例不同进行分组． DNA(ug)：lipofectamine(uL)分别为l：l、1：2、l：3，l：4、1： 5和空白对照组。转染细胞在37“C，5％C02培养箱培养。转染不同 时间置于(荧光显微镜)显微镜进行细胞形态学观察，确定DNA与脂质 体哪个比例细胞转染成功率最高。得出转染的最佳比例后进行转染 实验。实验分为空白对照组，脂质体转染PEGFP-ovPrP组。转染不同 时间进行光镜观察并照相。 转染24h后，按l：lO稀释细胞，接种到含G418的选择性培养基(25～ 50ml培养瓶)，48小时内杀死阴性细胞，然后传代，接种6孔板。





影响阳离子脂质体转染细胞转染效率的因素
1.被转染细胞 脂质体复合物越易进入细胞，基因转染效率就越高。转染前细胞最 好经过1次传代，以保证细胞生长旺盛，容易转染。 贴壁细胞生长到活率为80%时就要进行下一次传代，否则细胞就会出 现接触抑制，从而降低细胞转染活力。 转染时细胞密度对转染效率影响非常显著。不同的转染试剂，要求 转染时的最适细胞密度相同 2.培养基种类 不同的细胞类型有不同的特性，需要特定培养基、血清、补充添加 剂等。 3.转染混合物中DNA与阳离子脂质体的量 阳离子质脂体具有细胞膜活性，因此可能对细胞膜或亚细胞结构的 膜结构的完整功能产生影响，从而形成细胞毒性。体外转染中，优 化的比率常常大于1，而体内转染时其比率接近1较好。

6.活体染色 台盼蓝活体染色简单易行，是常用检查细胞存活的方法，用台盼蓝 染液，然后可见死细胞染成均匀的蓝色，活体细胞不着色。 7.细胞计数 用血球计数板做细胞计数。根据情况用营养液稀释与否均可。做法 是用习惯吸取少许染色的细胞悬液滴于计数板上，使悬液自由充满 盖片下方间隙。稍后片刻，镜下观察并计算出四角大格内的细胞数， 压线只计上线和右线的细胞，然后按下式计算出细胞浓度：细胞数 /ml原液=四角大格内的细胞总数/4*10000*稀释倍数。





3.培养皿处理 玻璃器皿一般需用清洁液浸泡1~7天，清水冲洗20次后再用蒸馏水洗 两次，烤干备用。用前160℃高温消毒2小时后使用。96孔或24孔塑 料板一般用2﹪NaOH浸泡4小时后，清水洗净再用1N HCL浸泡4小时， 用清水冲洗后再用蒸馏水漂洗，37℃干燥后，紫外线灯照射消毒。 新橡皮塞须用1/2NAOH煮沸15分钟，洗后再用4﹪HCL煮沸15分钟，清 水冲洗后用蒸馏水洗5次，煮沸10分钟灭菌，或送高压锅灭菌。 4.CHO细胞培养 将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体， 使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保 持悬浮状态。 5.CHO细胞无血清驯化 取处于对数生长期的贴壁CHO细胞，活率大于95﹪，转瓶中开始进 行无血清驯化。将无血清细胞培养基和原培养基按1:1（V/V）的比 例进行混合，接种密度为2×105cells/ml的细胞，在37％、5％CO2 培养箱进行培养。 根据细胞生长和活率情况，在降血清的每一个阶段可稳定传代1-3代， 接种密度维持在2×105cells/ml，逐步提高无血清细胞培养基在混合 液中的比例，即降低混合液中的血清含量，传代过程的细胞接种密 度仍维持为2-3×105cells/ml，直至混合液中的血清浓度降低至0.10.2％，每一代的细胞活率大于90％后，此时可将细胞完全培养在 CHO无血清无动物组分培养基中。在CHO无血清无动物组分培养基 中进行放大培养。