感染性疾病的分子诊断 ppt课件

pre-C
C区
C
HBeAg HBcAg
P区 P X区 X
DNAP HBxAg
HBsAg
pre-S2
pre-S1
急性感染时期HBV的标志物
HBV 基因分型
A、B、C、D、E、F、G、H共8种基因型 A型主要存在于白人， B型和C型主要存在于亚洲人群 E型主要存在于西非 F型仅见于中南美洲的土著人 G型和H型很少见
一、乙型肝炎病毒
（hepatitis B virus, HBV）
全世界有3.5亿慢性携带者，
世界其它地区
75%在亚太地区 每年有一百万人死于HBV感染，
是全球范围内第9位死因
中国：50%~70%的人受过感染，
亚太地区 75%
8%~10%是HBV携带者
75%的长期慢性携带者 来自亚太地区
HBV的形态特征
2．核酸扩增
2.1试剂配置（PCR前准备区）
从试剂盒中提取出HBV PCR反应液、Tap酶及UNG，室温融化后， 2000rpm离心10sec
设所需的管数为n（n=样本数+2管阴性对照+1管强阳性对照+1管临 界阳性对照+4管阳性参控品）
每个测试反应体系配制如下表：
试剂 PCR反应液 Taq酶
扩增片段大小(bp) 278
477
Ｃ基因特异 5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’
258
片段
5’-ATGGGATCCCTGGATGCTGGGTCTTCCAAA-3’
HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）
1．样本处理（样本处理区） 2．核酸扩增
我国流行的主要是B和C基因型
HBV分子诊断方法
HBV DNA检测（PCR） PCR 引物是PCR扩增的关键，决定扩 增的特异性和敏感度。PCR引物常根据 其S、C、P和X基因中的高度保守序列 来设计。
部分常用的引物序列
扩增位置 P、X基因特
异片段
Ｃ基因特异 片段
引物序列 5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’ 5’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’ 5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’ 5’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’
UNG
用量
17.8ul
0.2ul
0.03ul
计算好各试剂的用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向 设定的n个Roche毛细管中分别加入18ul，转移至样本处理区
HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）
2. 2 加样（样本处理区）
2. 1 试剂配置（PCR前准备区） 2. 2 加样（样本处理区） 2. 3 PCR扩增（检测区）
x x x 试剂制备
标本处理
扩增
检测
HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）
1．样本处理（样本处理区）
样本100ul（待测血清或血浆，试剂盒中对照品） 0.5ml离心管中→加入100ul DNA提取液1，振荡混匀 13,000rpm离心10min；吸弃上清[离心时注意固定离心管
感染性疾病分子诊断标志物
病原体核酸（DNA/RNA）
基因表达产物
代谢物
免疫应答分子
细
胞 免
T
T
疫
致敏T细胞
淋巴因子
体
IgM 感染早期出现
液 免
B
浆细胞
IgG 临近恢复期出现 IgA
疫
IgD IgE 与原虫和蠕虫感染有关
感染性疾病的分子诊断临床价值
定性或定量检测病原体的核酸，用于 病毒、细菌和寄生虫感染的诊断
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
感染后果（转wenku.baidu.com）
动态、定量地检测病原体核酸，判断 疗效和预后
亚型或耐药检测指导用药
第一节 病毒感染的分子检测
病毒
核衣壳 （nucleocapsid）
包膜（envelope） 刺突（spike）
核酸（nucleic acid）
DNA or RNA
衣壳（capsid）
衣壳粒
蛋白质衣壳 核酸
检测病毒的方法
血清学检测 病毒分离鉴定（诊断的金标准） 核酸检测（检出率最高）
HBV在肝细胞内的复制
传染性HBV 病毒颗粒
传染性HBV 病毒颗粒
DNA 部分双链 聚合酶
DNA
负链DNA
逆转录酶
cccDNA
A(n) mRNA
包裹后的前 基因 mRNA
肝细胞
HBsAg 包膜
HBV基因组结构
基因重叠
编码 pre-S1 S区 pre-S2 S
pre-S1蛋白 pre-S2蛋白 HBsAg
DNA 病毒 双链（非环状）
DNA不等长 正链（2/3） 负链
HBV外膜携带的HBsAg抗原性有一个 属特异性的抗原决定簇“a”和至少两个 亚型决定簇“d/y”和“w/r”（尚有少见 的q、g、n、x和t等亚型决定簇） 最常见的血清型为adw、adr和ayw 亚型的地区分布不同，我国以adr为主， adw次之
感染性疾病的分子诊断
Molecular diagnosis for infectious diseases
感染的慨念
感染是病原体和宿主之间的相互作用过程 病原体：病毒、细菌、真菌、衣原体、支原体、螺旋体、寄生虫 病原微生物：致病菌（条件致病菌）
共
生
微 生
状
物
态
人
体
微
生
物
不
人
同
体
的
感
染
状
态
精品资料
方向、尽可能吸弃上清且不碰沉淀] 再加入25ul DNA提取液2，振荡10sec [沉淀需打散、混匀] 2,000rpm离心10 sec，100℃干浴或沸水浴10min 13,000rpm离心10min，保留上清备用. （如果样本裂解产物当天不使用，则要保存在-20℃）
HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）
病原体被清除 ------ 通过非特异性或特异性免疫 隐性感染 ------ 是感染过程中最常见的类型 显性感染（临床感染）
感染致病，慢性感染 潜伏感染
感染性疾病的分子诊断策略
判断有无感染 是何种病原体感染 分型（分类）:亚型---耐药性 检测方法：PCR、杂交、基因芯片、DNA测序