分子生物学第16章

第十六章逆转录病毒和反座子通过RNA中间体的转座是真核生物独有的，这种转座作用是由逆转录病毒(Retrovirus)把RNA基因组逆转录成DNA，再插入到宿主染色体中所提供的。

一些真核生物的转座子和寄生在这些生物中的逆转录病毒的前体有关，它们是通过RNA中间体进行转座的。

作为一类，这些元件被称为反座子(Retroposon)，有时也称为反转座子(Retrotransposon)。

反座子包括逆转录病毒，它们能自由地侵染宿主细胞，具有转座子的特征，在插入位点产生短的由方向性的重复序列。

甚至在并没有检测到活性转座子的基因组中，以前转座事件的足迹也被发现，它们形成了分散的有方向的重复序列。

这些序列表明RNA序列是基因组(DNA)序列的祖先。

我们认为RNA一定是被逆转录成双螺旋DNA，并且通过类似转座的形式插入到基因组中的。

像其它复制循环一样，逆转录病毒或反座子的循环是连续的，我们任意在某一点打断，并且称之为起始点。

但我们通常推荐如图16.1的形式来定义循环。

逆转录病毒首先是作为一种感染病毒颗粒被发现的，它能在细胞之间传染，因此细胞内的循环被认为是RNA病毒复制的一种途径。

反座子是作为基因组的组分被发现的，它的RNA形式和mRNA具有相似的特征和作用，因此我们认为反座子是基因组序列，它能在细胞内转座，但不能在细胞间转移。

16.1 逆转录病毒的生命周期中包含类似转座的事件逆转录病毒的基因组是单链的RNA，它通过一个双链DNA中间体复制，病毒的生命周期中包含一个阶段，在这个阶段中，双链DNA通过类似转座的机制被插入到宿主基因组中，形成反向重复序列(Reversed repeats)。

这个反应的意义超出了病毒繁衍的范围，其结果有以下几点:•被整合到细胞基因组中的逆转录病毒序列称为原病毒(Provirus)，一个原病毒就像细胞基因组的一部分一样。

•有时细胞的序列能与逆转录病毒的序列重组并且随之转座，这些序列可能会被当作双螺旋序列插入到新位点。

•被逆转录病毒转座的细胞序列能改变被感染细胞的特性。

逆转录病毒生命周期的特殊性如图16.2所示。

其中关键的步骤是病毒的RNA被逆转录成DNA，然后DNA被整合到宿主基因组中，最后，DNA原病毒被转录成RNA。

负责将RNA逆转录成DNA的酶被称为逆转录酶(Reverse transcriptase)，逆转录酶在宿主细胞中将RNA逆转录成双链DNA(DNA也能被逆转录成环形的，但这些环形的DNA 不能进行复制)。

线形DNA进入到细胞核中，一个或多个DNA分子被整合到宿主基因组中，过程由整合酶(Integrase)催化，整合的原病毒被宿主的转录系统转录为病毒RNA，这个RNA既能充当mRNA也能作为基因组被包装成为病毒。

整合(Integration)作为病毒生命周期的一部分是转录所必需的。

图16.1 逆转录病毒和返座子的循环再生过程中都伴随着从DNA 到RNA 以及从RNA 到DNA的交替转录，不同的是逆转录病毒能产生感染性颗粒，返座子只在细胞内进行再生循环。

图16.2 逆转录病毒生活周期中，病毒的RNA 基因组经逆转录成为双链DNA ，双链DNA 插入宿主的基因组中。

已整合的DNA 再转录出病毒RNA 。

每一个病毒中包装了两个拷贝的RNA 基因组，结果使每一个病毒颗粒是双倍体。

当细胞同时被不同的但有关系的病毒感染时，有可能会产生一个携带两类基因组的杂合病毒，二倍体可能对病毒获得宿主的基因序列是很重要的，逆转录酶和整合酶是由病毒颗粒的基因组编码的。

一个典型的逆转录基因组序列包含3或4个基因，这些基因通过不同的加工能编码多种蛋白质。

典型的逆转录病毒的基因组包含3个有序的序列gag-pol-env ，如图16.3所示。

逆转录病毒的mRNA 具有保守的结构，在5′端有帽子(Cap)结构，3′端有poly(A)。

代表两种mRNA ，若整个mRNA 被翻译，会形成Gag 和Pol 的多聚物。

若从起始密码读到第一个终止密码会产生Gag 蛋白质，若这个终止密码子被通读(Readthrough)就会表达Pol 。

在不同的病毒中采用不同的机制来通读gag 的终止密码，这取决于gag 和pol 读码框之间的关系，当gag 和pol 相连时，识别终止密码的谷氨酰胺-tRNA 被抑制，只产生一种蛋白质；当gag 和pol 在不同读码框时，核糖体移码(Frameshift)只产生一种蛋白质。

通常，通读的频率只有5%，所以Gag 蛋白质是Gag-Pol 蛋白质数量的20倍。

Env 多聚蛋白质是通过另一种方式表达的：剪切产生亚基因组mRNA ，然后翻译成Env 的产物。

gag 基因编码病毒的核心蛋白质(Nucleoprotein core)，pol 基因编码与核酸合成以及重组相关的酶类，env 基因编码病毒外壳蛋白质(Envelope)，外壳蛋白质同时也能从细胞的细胞膜上得到组分。

无论是Gag、Gag-Pol还是Env基因的多聚蛋白质产物都能被酶切割，产生单个蛋白质，这些蛋白质能在成熟的病毒中找到。

编码蛋白酶活性在病毒中有不同的的形式：它可能是gag或者pol基因的一部分，或者是有时采用一个附加的独立读码框形式。

逆转录病毒的复制包括一个将RNA包装到衣壳(Capcid)中的过程，用蛋白质外壳包装RNA，然后从细胞的细胞膜上得到部分膜。

通过这种方式释放感染性病毒颗粒，如图16.4所示。

在感染过程中，此过程被颠倒过来，病毒感染一个新宿主细胞时先锚定到细胞的质膜上，然后注入病毒的内容物。

图16.3 逆转录病毒的表达产物为多聚蛋白，经图16.4 HIV从受感染细胞的质膜出芽的情形。

过加工后才成为单个蛋白。

逆转录病毒被称为正链病毒(Plus strand virus)，因为它的RNA能编码蛋白质产物，就像名字所说的，逆转录酶负责将基因组(单链RNA)逆转录为互补的DNA链，称为负链(Minus strand)DNA。

逆转录酶还催化其后产生双链DNA的反应。

它有DNA聚合酶活性，能以逆转录成的单链DNA为模板合成双链DNA。

双螺旋DNA的第二条链称为正链DNA，这个酶还有一个附加的必须活性，RNAase H活性，具有降解RNA和DNA杂交分子中RNA链的功能。

所有逆转录病毒的逆转录酶都具有大量相同的氨基酸序列，在其它的反座子中也能发现同源序列。

病毒的DNA形式和RNA形式的比较如图16.5所示。

病毒的RNA在末端有同向重复序列(Direct repeat)，这些R片段在不同病毒中的变化范围为10-80个碱基。

在5′端紧挨着的是80-100个碱基的U5区，它是5′端所独有的，在3′端处R片段前是U3区，有170-1350个碱基，是3′端所独有的。

R片段在将RNA逆转录为DNA时被用来产生大量的同向重复序列，这些重复序列能在线形DNA找到(见图16.6和图16.7)，在整合的形式DNA中两端各缺少2bp，是由整合的机制造成的(见图16.8)。

像其它DNA聚合酶一样，逆转录酶需要一个引物，天然的引物是tRNA，病毒中存在的一个没有装载氨基酸的tRNA。

tRNA 3′端一个18bp的序列和病毒RNA分子5′端100~200位点处配对，tRNA也有可能和病毒RNA 5′端的其它位点配对，辅助病毒RNA形成二聚体。

这里存在一个矛盾，逆转录酶是从5′端下游100~200bp处开始合成DNA，那么产生的DNA怎么能代表整个RNA基因组呢(这和任何线形核酸末端复制的通常问题有很大的不同，参见12章)。

在体外，合成进行到最后时，产生一个短的DNA片段称为负链强终止(Minus strong-stop)DNA。

这个分子在体内没有被发现是因为如图16.6所示的合成过程反应持续进行。

逆转录酶变换模版，携带新生的DNA跳跃到新的模版上，这是在模版上两个跳跃(Jump)的第一次跳跃。

图16.5 逆转录病毒RNA末端为正向重复；游离的线形DNA为长末端重复(LTR)；前病毒DNA(整合的病毒DNA)两末端是各少了两个碱基的LTR。

图16.6 负链DNA的合成中，需要经过一次跳跃来转换模板。

在这个反应中，RNA模版的5′末端的R区被逆转录酶的RNAase H 酶活性降解。

这使3′端R区和新合成的DNA碱基配对，然后逆转录通过U3区进入RNA继续进行。

与负链强终止DNA配对的R区可以是同一个RNA分子(分子内配对)的3′端，也可以是不同RNA分子的3′端(分子间配对)。

有证据说明在反转座子的生命周期中tRNA引物是不能遗传(如果发生分子间配对，我们希望这个片段能遗传，因为它能提供下一个循环的引物结合序列。

分子内配对允许另外一个逆转录RNA提供这个片段)。

因此，继续合成需要逆转录酶跳跃到另一个RNA模版上。

跳跃和延伸的结果是把一个U3片段加到5′端，形成U3－R －U5片段，称为长末端重复序列(Long terminal repeat ，LTR)。

通过一系列反应把U5片段加到3′末端，形成相同U5－R －U3重复结构。

接下来，需要产生正链DNA 和在另一个末端产生LTR ，此反应如图16.7所示。

合成正链的逆转录酶的引物，是原来的RNA 分子降解过程中剩下的RNA 分子。

当酶到达模版末端时，就合成了一个含强终止的正链DNA 。

然后这个DNA 分子被转移到负链DNA 分子的另一端。

当第二个DNA 复制循环从上游的引物开始时，这个DNA 分子就被释放(如左图)，它用R 区和负链DNA 的3′末端配对。

此双螺旋DNA 通过互补在彼此末端产生一个双螺旋的LTR 。

图16.7 正链DNA 的合成中需要再经过一个跳跃。

图16.8 整合酶是整合反应中唯一需要的酶，整合过程中每个LTR 丢失两个碱基后被整合到靶DNA 的4bp 重复之间。

由于在每个病毒颗粒中都有两个RNA 基因组，在病毒生命周期中可能重组，可能有两个时期与之有关，一个是在负链合成期间，另一个在正链合成期间：•分子间的配对能使两个连续的RNA 模版之间发生重组(见图16.6)。

•在一个涉及几个内部起始的反应中，正链DNA 的合成可能是不连续的，反应过程中可能发生链转移。

这些事件的共同点特征是重组由DNA 合成过程中模板变更造成的，这是拷贝选择(Copy choice)重组机制的普通例子，多年以来这个机制许一直被认为可能是普通重组的机制。

虽然它不可能被真核细胞系统所采用，但确实RNA 病毒感染期间发生重组的基本基础，包括复制释放RNA 形式的病毒基因组，例如脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)。

整合原病毒的组织形式是线形DNA，其两端的LTR相同。

3′末端由短反向重复序列构成的U5与5′末端的U3相关，因此LTR本身以断反向重复处结束。

整合的原病毒与转座子(Transposon)类似：靶DNA的短同向重复序列包围着原病毒两侧末端的短反向重复序列。